初巍巍，袁菲陽，丁國臣，呂文君，史昌乾

車葉草苷(Asperuloside)為環(huán)烯醚萜類化合物，主要來源于茜草科(Rubiaceae)如白花蛇舌草等植物，具有抗菌、抗氧化、抗誘變、抗腫瘤、消炎鎮(zhèn)痛等廣泛的藥理作用[1,2]。Lewis肺癌細(xì)胞是來源于小鼠肺腺癌的細(xì)胞，惡性程度較高，肺腺癌是非小細(xì)胞肺癌中較為常見的病理分型[3]。化療是臨床治療晚期非小細(xì)胞肺癌的重要手段，但常因不能完全消滅腫瘤細(xì)胞、殘存微小轉(zhuǎn)移灶、產(chǎn)生抗藥性等不良反應(yīng)而使其臨床應(yīng)用受到限制[4,5]。尋求一種與化療藥物配合應(yīng)用的治療用藥顯得尤為重要。車葉草苷具有良好的抗炎、抗腫瘤等藥理作用，但尚未作為治療用藥[6]。本研究旨在觀察車葉草苷對荷瘤小鼠的抑瘤、抗炎作用，并通過分子生物學(xué)檢測手段，檢測瘤體中TLR4/MYD88/NF-κB信號通路的活化情況，探討車葉草苷抗炎、抗腫瘤的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物 SPF級健康C57BL/6J小鼠36只，體質(zhì)量(20±2)g。購自遼寧長生生物科技有限公司，實(shí)驗(yàn)動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(遼)2010-0001。實(shí)驗(yàn)動物購入后，常規(guī)顆粒飼料喂養(yǎng)，自由食水，12 h晝夜節(jié)律。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)藥品及制備 車葉草苷，上海欽誠生物科技有限公司生產(chǎn)，CAS：14259-45-1。順鉑，山東齊魯制藥生產(chǎn)，國藥準(zhǔn)字：H201510743。

1.1.3 主要試劑 IL-1β、TNF-α酶聯(lián)免疫法檢測試劑盒，購自武漢云克隆科技股份有限公司，貨號：SEA563Mu、SEA133Mu。TLR4抗體(ab95562)；MYD88抗體(ab2064)；NF-κB抗體(ab16502)，均購自ABCAM公司。免疫組化SP試劑盒(貨號：SP-9001)，購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。DMEM培養(yǎng)液，購自?？寺」?。胎牛血清(FBS)，購自杭州四季青生物技術(shù)有限公司。Lewis細(xì)胞株系購自中科院上海細(xì)胞庫。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 造模方法 36只小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，于小鼠左側(cè)腋下皮膚松弛部位的皮下接種Lewis細(xì)胞懸液，每只小鼠0.2 ml，然后正常飼養(yǎng)，每日觀察左側(cè)腋下成瘤情況。36只小鼠1周開始成瘤，而瘤體達(dá)3 mm×3 mm×3 mm以上的29只。隨機(jī)分為3組：模型對照組10只，車葉草苷組9只，順鉑對照組10只。

1.2.2 干預(yù)方法 模型對照組：經(jīng)口灌服生理鹽水，0.5 ml/只，同時腹腔注射生理鹽水，0.5 ml/只。車葉草苷組：參考李紅霞等[7]研究，小鼠經(jīng)口灌胃車葉草苷(50 mg/kg)，0.5 ml/只，同時腹腔注射生理鹽水，0.5 ml/只。順鉑對照組：經(jīng)口灌服生理鹽水，0.5 ml/只，同時腹腔注射順鉑(1 mg/kg)，0.5 ml/只。各組干預(yù)1次/d，連續(xù)3周。給藥期間，模型對照組死亡3只，車葉草苷組死亡1只，順鉑對照組死亡2只。

1.2.3 樣本采集 末次給藥后，稱量并記錄小鼠體重，麻醉狀態(tài)下采血1 ml，室溫靜置1 h，3000 r/min，離心10 min，分離血清，凍存?zhèn)溆?。然后斷髓處死，于冰面上剝離腫瘤組織，稱量腫瘤重量，將瘤組織均分，一份凍存于-80 ℃冰箱中；另一份浸泡在4%多聚甲醛中固定。

1.2.4 指標(biāo)檢測 (1)體重變化。各組小鼠成瘤并隨機(jī)分組后，在給藥干預(yù)前稱量體重并記錄；取材處死前，稱量體重并記錄，對比各組小鼠給藥前后體重變化。(2)瘤指數(shù)。各組小鼠末次給藥后，剝離完整瘤組織并稱重，以各自瘤重/體重的比值作為該小鼠的瘤指數(shù)，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。(3)血清IL-1β、TNF-α含量。采用酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)法檢測各組小鼠血清中IL-1β、TNF-α含量。檢測方法按照試劑盒內(nèi)說明書步驟進(jìn)行。(4)western-blot法檢測各組小鼠瘤組織中TLR4、MYD88、NF-κB表達(dá)水平。TBST洗膜后ECL發(fā)光，采集圖像，測定條帶的灰度值，以目的蛋白灰度值/內(nèi)參蛋白灰度值的比值作為該小鼠目的蛋白的相對表達(dá)水平，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。(5)免疫組織化學(xué)法檢測各組小鼠瘤組織中p-NF-κB表達(dá)水平。取固定的瘤組織，常規(guī)制備5 μm厚石蠟切片，烤片2 h，脫蠟至水，滴加3% H2O2去除內(nèi)源性過氧化物酶。次日37 ℃復(fù)溫1 h，洗片，滴加即用型二抗工作液，37 ℃孵育1 h，洗片，計(jì)數(shù)細(xì)胞核呈陽性表達(dá)的細(xì)胞百分率，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié) 果

2.1 車葉草苷對荷瘤小鼠體重和瘤指數(shù)的影響 給藥前各組小鼠體重比較均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；給藥3周后，與模型對照組和順鉑對照組比較，車葉草苷組小鼠體重顯著增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，表1)。與模型對照組比較，車葉草苷組和順鉑對照組小鼠瘤指數(shù)顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，表1)。

2.2 車葉草苷對荷瘤小鼠血清IL-1β、TNF-α的影響 與模型對照組比較，車葉草苷組和順鉑對照組小鼠血清IL-1β、TNF-α含量顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；車葉草苷組和順鉑對照組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(表2)。

2.3 車葉草苷對荷瘤小鼠瘤組織中TLR4、MYD88、NF-κB表達(dá)的影響 與模型對照組比較，車葉草苷組和順鉑對照組小鼠瘤組織中TLR4、MYD88、NF-κB表達(dá)水平顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；車葉草苷組和順鉑對照組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(表3，圖1)。

組別例數(shù)體重(g)給藥前給藥后瘤指數(shù)(瘤重/體重)模型對照組722.54±2.5716.16±2.130.064±0.012車葉草苷組823.09±2.6819.00±1.44①0.041±0.009①順鉑對照組823.35±2.6816.19±1.760.044±0.010①

注：與模型對照組比較，①P<0.01

組別nIL-1βTNF-α模型對照組778.60±10.7387.14±14.54車葉草苷組849.10±6.10①61.32±6.91①順鉑對照組850.87±3.78①55.21±7.96①

注：與模型對照組比較，①P<0.01

組別例數(shù)Western-blot(aim/β-actin)TLR4MYD88NF-κB模型對照組70.513±0.0720.528±0.0650.557±0.068車葉草苷組80.405±0.029①0.396±0.077①0.377±0.057①順鉑對照組80.392±0.048①0.414±0.046①0.420±0.056①

注：與模型對照組比較，①P<0.01

圖1 小鼠Lewis肺癌組織中TLR4、MYD88、NF-κB表達(dá)電泳圖

2.4 車葉草苷對荷瘤小鼠瘤組織中p-NF-κB表達(dá)的影響 模型對照組瘤組織的p-NF-κB表達(dá)水平較高，陽性產(chǎn)物主要表達(dá)于瘤細(xì)胞的細(xì)胞核位置，見圖2。與模型對照組(0.261±0.026)比較，車葉草苷組(0.171±0.026)和順鉑對照組(0.207±0.020)小鼠瘤組織中p-NF-κB表達(dá)水平顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；車葉草苷組和順鉑對照組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

圖2 各組小鼠Lewis肺癌組織中p-NF-κB表達(dá)(DAB染色，×400倍)

3 討 論

非小細(xì)胞肺癌約占所有肺癌患者總數(shù)的80%。Lewis細(xì)胞是小鼠來源的肺腺癌細(xì)胞，本研究選用Lewis細(xì)胞荷瘤鼠作為研究對象。為了讓組間更具有可比性，我們選擇瘤體達(dá)3 mm×3 mm×3 mm以上的小鼠進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，使得對車葉草苷抑瘤作用的觀察更客觀。

化療是臨床治療晚期非小細(xì)胞肺癌的重要手段，但化療引起患者的毒副反應(yīng)明顯[7]。車葉草苷主要來源于茜草科植物，如白花蛇舌草。車葉草苷的藥理作用比較廣泛，抗腫瘤作用也有報(bào)道，尚不夠豐富。另有文獻(xiàn)[8,9]報(bào)道，車葉草苷對TLR4/MYD88/NF-κB信號通路具有調(diào)控作用。因此，為了尋求新的治療非小細(xì)胞肺腺癌的途徑，我們觀察了車葉草苷對Lewis荷瘤鼠的抑瘤作用，并探討了部分作用機(jī)制。

肺腺癌發(fā)生時，瘤體內(nèi)的炎性反應(yīng)是腫瘤致病原因之一，而TLR4/MYD 88/NF-κB信號通路參與了肺腺癌瘤體內(nèi)炎性反應(yīng)的發(fā)生[10,11]。Toll樣受體是一類作為模式識別受體(PRR)發(fā)揮作用的非催化受體，主要表達(dá)于上皮細(xì)胞及免疫細(xì)胞上，是識別損傷相關(guān)分子模式的主要受體[12]。TLR4是Toll樣受體超家族成員之一。TLR4通過與配體結(jié)合的形式發(fā)揮生物學(xué)作用，二者結(jié)合形成TLR4/MD-2復(fù)合物，通過招募IL-1受體相關(guān)激酶家族成員等環(huán)節(jié)，最終導(dǎo)致NF-κB發(fā)生磷酸化，發(fā)揮調(diào)控IL-1β、TNF-α等促炎因子轉(zhuǎn)錄的作用，從而介導(dǎo)了瘤體內(nèi)炎性反應(yīng)的發(fā)生[13]。

本研究結(jié)果顯示：模型對照組小鼠血清中IL-1β、TNF-α含量處于較高水平，而車葉草苷干預(yù)后，細(xì)胞因子水平顯著下降，提示車葉草苷對荷瘤小鼠全身的炎性反應(yīng)狀態(tài)具有抑制作用。另外，模型對照組小鼠瘤組織中TLR4、MyD88、NF-κB的表達(dá)水平較高，車葉草苷干預(yù)后，瘤組織中TLR4、MyD88、NF-κB的表達(dá)水平顯著降低，提示車葉草苷干預(yù)后，顯著抑制了荷瘤小鼠瘤組織中TLR4/MyD88/NF-κB信號通路的活化。免疫組織化學(xué)法檢測的p-NF-κB結(jié)果，提示模型對照組瘤組織中出現(xiàn)了大量的細(xì)胞核p-NF-κB陽性表達(dá)的現(xiàn)象，而車葉草苷能夠顯著減少瘤組織中p-NF-κB陽性表達(dá)的細(xì)胞數(shù)量，進(jìn)一步說明了車葉草苷對過度活化的TLR4/MyD88/NF-κB信號通路具有抑制作用。

綜上所述，車葉草苷對Lewis荷瘤鼠具有明顯的抑瘤作用，能夠降低荷瘤小鼠機(jī)體的炎性反應(yīng)狀態(tài)，該作用機(jī)制可能是通過抑制瘤組織中TLR4/MyD88/NF-κB信號通路的過度活化實(shí)現(xiàn)的。但是由于本研究自身的局限性，例如樣本數(shù)小、研究對象種屬等問題，我們無法得出車葉草苷抗腫瘤作用機(jī)制的明確結(jié)論，尚需進(jìn)一步深入、全面地研究。