李紅宇，張鞏亮，牛同旭，李 逸，劉夢紅，鄭桂萍

(黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)農(nóng)學(xué)院，黑龍江省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)栽培技術(shù)與作物種質(zhì)改良重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江大慶163319)

水稻灌溉用水占中國農(nóng)業(yè)用水的70%左右［1-2］，供水問題已成為制約水稻生產(chǎn)良性發(fā)展的瓶頸之一［3］。篩選和培育抗旱水稻品種是解決這一問題的最有效途徑［4］。

作物抗旱性是其自身對干旱環(huán)境的適應(yīng)性變化［5］，是多種生理生化性狀共同構(gòu)成的復(fù)雜性狀，包括形態(tài)特征、生理生化特性及生長發(fā)育進(jìn)程改變等［6］。品種間及同一品種的不同生育時期間抗旱機(jī)制存在一定差異，進(jìn)行抗旱鑒定時，單一抗性指標(biāo)不能全面、準(zhǔn)確地反映作物的抗性，應(yīng)運(yùn)用綜合指標(biāo)法對作物復(fù)雜性狀的抗性進(jìn)行綜合評判［7］。在統(tǒng)計分析方面，綜合指標(biāo)法主要采用相關(guān)分析、主成分分析、聚類分析、多元逐步回歸分析、模糊綜合評價、灰色關(guān)聯(lián)分析等方法進(jìn)行組合評價，以利用不同統(tǒng)計分析方法在指標(biāo)體系構(gòu)建、指標(biāo)賦權(quán)、數(shù)據(jù)需求等方面的優(yōu)勢，減少隨機(jī)偏差和系統(tǒng)誤差發(fā)生的可能性，有助于解決評價結(jié)論不一致問題，提高綜合評價的質(zhì)量［8］。如田又升等［9］用 PEG-6000高滲溶液模擬干旱條件，采用發(fā)芽勢、發(fā)芽率、最大胚根長等11個萌發(fā)性狀指標(biāo)對33份水稻材料進(jìn)行了萌發(fā)期抗旱性綜合鑒定，通過主成分分析將11個生長指標(biāo)歸類為4個互不相關(guān)的因子，以各指標(biāo)的隸屬函數(shù)值進(jìn)行模糊聚類，將參試品種的抗旱性分為4大類。但是，多種統(tǒng)計方法的組合評價仍存在一定問題，如參試指標(biāo)間可能存在非線性關(guān)系，使用傳統(tǒng)主成分分析法進(jìn)行線性降維，會導(dǎo)致評價結(jié)果發(fā)生偏差［10］。針對此問題，葉明確等［11］提出了一種基于非線性投影的對數(shù)主成分評價法，并從理論基礎(chǔ)、幾何意義和適用范圍等方面闡明了該算法的合理性和有效性。紀(jì)龍等［8］首次將其引入作物種質(zhì)資源綜合評價。本研究采用對數(shù)主成分評價法，在全生育期干旱條件下，從形態(tài)特征、物質(zhì)生產(chǎn)、光合及生理特性方面對12份寒地水稻種質(zhì)資源齊穗期抗旱性進(jìn)行了綜合評價，以期為寒地水稻抗旱育種和節(jié)水栽培提供種質(zhì)資源支持。

1 材料與方法

1.1 參試材料及其處理

試驗(yàn)于2017年和2018年在黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)校內(nèi)試驗(yàn)基地防雨棚內(nèi)進(jìn)行。盆栽試驗(yàn)采用二因素完全隨機(jī)試驗(yàn)設(shè)計。品種因素為12水平，包括前期工作篩選出的苗期抗旱材料(DPB120、墾稻24、DPB71、DPB112、DPB70、DPB15)和敏感材料各6份(齊粳10、綏育117463、綏稻3號、瑩稻2、綏育118146、綏粳21)。干旱因素為2水平，即常規(guī)灌溉(對照)和干旱處理。常規(guī)灌溉水分管理為淺水插秧、深水扶苗、淺水增溫促蘗、減少分裂期深水護(hù)苗、結(jié)實(shí)期干濕交替灌溉;干旱處理于返青期后開始干旱脅迫處理，返青期以80%以上秧苗早晚葉尖吐水為標(biāo)志。干旱處理的方法是返青期排干水，采用負(fù)壓式土壤濕度計測定土壤水勢(將濕度計的陶頭插入土表以下10 cm位置)，保持全生育期土壤水勢在-30～-35 kPa，常規(guī)灌溉對照和干旱處理每份材料各種植14盆，插秧規(guī)格為4穴·盆-1。其他管理方法同常規(guī)。

1.2 調(diào)查與測定

1.2.1 干物質(zhì)量和葉面積的測定 齊穗期各品種處理和對照分別取代表性植株12穴，從基部切除根系，余下部分分為莖鞘、穗、上三葉和其余葉片4部分。采用長寬系數(shù)法測定上三葉葉面積(高效葉面積)和有效葉面積。各部分單獨(dú)包裝，105℃殺青30 min，80℃烘干至恒重。

1.2.2 光合指標(biāo)的測定 在齊穗期天氣晴朗的上午9∶00～11∶00，使用CIRAS-3型便攜式光合熒光測定系統(tǒng)測定劍葉凈光合速率(Pn)、蒸騰速率(Ts)、氣孔導(dǎo)度(Gs)和胞間CO2濃度(Ci)。

1.2.3 劍葉SPAD值的測定 于齊穗期每處理選主莖劍葉20片，使用葉綠素SPAD-502儀(日本MINOLTA產(chǎn))測定劍葉中部的SPAD值，測定時注意避開葉脈和有損傷的葉片。

1.2.4 劍葉可溶性蛋白質(zhì)含量、游離脯氨酸含量、SOD活性和POD活性測定 齊穗期各品種取處理和對照主莖劍葉6片，快速去除葉脈后，置于液氮中冷凍，在超低溫冰箱中保存?zhèn)溆?。采用考馬斯亮藍(lán)G-250染色法測定可溶性蛋白質(zhì)含量［12］;采用磺基水楊酸法提取游離脯氨酸，茚三酮顯色法進(jìn)行測定［12］;參照盧少云等［13］的方法提取、測定還原型谷胱甘肽(GSH)含量。采用任紅旭等［14］的方法提取超氧化物歧化酶(SOD)和過氧化物酶(POD)，并參照李合生的方法［12］進(jìn)行測定。

1.2.5 糖花比的測定 齊穗期每品種處理和對照各選擇長勢均一的主莖15個，計數(shù)主穗穎花數(shù)。采用蒽酮比色法測定主莖莖鞘中的淀粉和可溶性糖含量，并參照趙步洪等［15］的方法計算糖花比。

糖花比(SSR，mg·穎花-1)=莖鞘非結(jié)構(gòu)性碳水化合物含量/每穗穎花數(shù)

1.2.6 莖稈傷流量的測定 齊穗期每品種處理和對照各選取代表性植株4穴，于17∶00從距地表10 cm處橫切10個莖，用已稱重(W1)的脫脂棉完全覆蓋切口，自封塑料袋包扎以收集根系傷流液，并記錄時間T1，10 h后記錄時間T2。取下包裝物并稱重，記為W2。利用下式計算單莖根系傷流量:

1.3 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析

1.3.1 抗旱系數(shù)(DTC) 采用水稻抗旱系數(shù)(drought tolerant coefficients，DTC)，即各抗旱指標(biāo)的相對值進(jìn)行抗旱性綜合分析，以消除參試材料間的基礎(chǔ)性狀差異。

1.3.2 原始數(shù)據(jù)無量綱化和對數(shù)化 采用均值化方法對原始指標(biāo)進(jìn)行無量綱化處理。

在此基礎(chǔ)上進(jìn)行對數(shù)化處理，得到均值化處理后的指標(biāo)為lnXi(i=1，2，…，18)。

1.3.3 指標(biāo)的權(quán)重分配 對lnXi進(jìn)行主成分分析，根據(jù)特征值大于1或累積方差貢獻(xiàn)率超過80%(85%)的原則確定主成分個數(shù)。根據(jù)主成分載荷矩陣計算lnXi的權(quán)重和主成分Pj:

式中，eij代表第i個評價指標(biāo)在第j主成分中的特征向量，λj表示第j個主成分的特征值。

1.3.4 主成分Pj權(quán)重(Wj)和主成分綜合得分(Sf)

對公式(6)兩邊取指數(shù)得到Sf:

1.3.5 統(tǒng)計分析軟件 各指標(biāo)2017—2018年數(shù)據(jù)平均值用于統(tǒng)計分析。利用Excel 2010進(jìn)行數(shù)據(jù)整理、描述性分析、權(quán)重和抗旱綜合評價Sf值的計算。利用DPS 7.05軟件進(jìn)行主成分分析、聚類分析和灰色關(guān)聯(lián)度分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 各單項指標(biāo)的抗旱系數(shù)及相關(guān)分析

依據(jù)公式(1)計算各單項指標(biāo)的相對值即抗旱系數(shù)(DTC)，以消除基因型間本底差異和指標(biāo)間的量綱差異。表1列出了每個性狀抗旱系數(shù)的均值及描述性分析統(tǒng)計數(shù)，17個性狀的抗旱系數(shù)平均值為0.722，數(shù)值分布在0.090～1.919。對各指標(biāo)的年際間差異進(jìn)行成組數(shù)據(jù)t測驗(yàn)，傷流量、莖鞘非結(jié)構(gòu)性碳水化合物含量、凈光合速率、蒸騰速率、間隙CO2濃度、氣孔導(dǎo)度、可溶性蛋白含量、超氧化物歧化酶活性、超氧化物歧化酶活性、游離脯氨酸含量、還原型谷胱甘肽含量等11個指標(biāo)的抗旱系數(shù)年際間差異顯著或極顯著，其他指標(biāo)年際間差異不顯著。從變異系數(shù)方面看，變異系數(shù)最大為傷流量(185.183%)，氣孔導(dǎo)度(133.471%)次之，SOD 活性(47.910%)再次之;變異系數(shù)最小為有效葉面積(11.997%)，干物質(zhì)量次之(12.265%)，SPAD值再次之(13.637%)。

表1 各單項指標(biāo)的抗旱系數(shù)Table 1 Drought tolerant coefficient(DTC)of each single index

2.2 對數(shù)主成分分析

主成分分析可在損失較少信息量的前提下，將多指標(biāo)簡化為少量綜合指標(biāo)，以濃縮數(shù)據(jù)、簡化指標(biāo)，彌補(bǔ)利用單項指標(biāo)評價抗旱性的不足。主成分?jǐn)?shù)目的確定應(yīng)同時滿足數(shù)據(jù)降維和信息綜合的要求。確定合適的指標(biāo)權(quán)重是應(yīng)用主成分分析進(jìn)行綜合評價的核心內(nèi)容之一。各指標(biāo)的權(quán)重分配依賴于主成分個數(shù)的選取，通常根據(jù)特征值大于1或累積方差貢獻(xiàn)率超過80%(或85%)的原則確定主成分個數(shù)。對對數(shù)化處理后的數(shù)據(jù)(lnXi)進(jìn)行主成分分析，前5個主成分的特征值均大于1，貢獻(xiàn)率分別為 28.905%、21.087%、13.811%、11.862% 和8.164%，其累計貢獻(xiàn)率達(dá)到83.829%，即前5個相互獨(dú)立的主成分代表了17個指標(biāo)83.829%的變異信息，其余可忽略不計(表2)。

前5個主成分的載荷矩陣如表3所示，第一主成分的貢獻(xiàn)率為28.905%，該主成分以蒸騰速率載荷的絕對值最高(-0.3363)，凈光合速率、間隙CO2濃度和氣孔導(dǎo)度在第一主成分也具有較高載荷，可稱為光合因子;第二主成分的貢獻(xiàn)率為21.087%，該主成分以高效葉面積(0.4188)和有效葉面積(0.4344)載荷最高，可稱為葉面積因子;第三主成分的貢獻(xiàn)率為13.811%，該主成分以SPAD、可溶性蛋白含量、超氧化物歧化酶、過氧化物酶、游離脯氨酸含量載荷最高，稱為生理因子;第四主成分的貢獻(xiàn)率為11.862%，傷流量的載荷最高(0.5040)，稱為傷流量因子;第五主成分的貢獻(xiàn)率為8.164%，干物質(zhì)量的載荷最高(0.4408)，稱為干物質(zhì)量因子。

表2 特征值與方差貢獻(xiàn)率Table 2 Eigenvalue and variance contribution rate

表3 主成分載荷矩陣Table 3 Load matrix of the principal component

根據(jù)公式(3)計算lnXi的權(quán)重lij(表3)，利用公式(4)得到5個主成分的解析式:

P1=0.0470lnX1-0.0730lnX2-0.0080lnX3+0.0414lnX4+0.1470lnX5+0.1046lnX6+0.0622lnX7-0.1390lnX8-0.1517lnX9-0.1434lnX10-0.1480lnX11-0.0373lnX12+0.1455lnX13+0.1403lnX14+0.1023lnX15+0.0727lnX16+0.1224lnX17

P2=0.0086lnX1+0.1278lnX2+0.2212lnX3+0.2294lnX4+0.1254lnX5-0.0937lnX6+0.1610lnX7+0.0039lnX8+0.0449lnX9-0.0032lnX10+0.1406lnX11+0.1354lnX12+0.0603lnX13+0.0290lnX14+0.1935lnX15-0.1625lnX16-0.0451lnX17

P3=0.0264lnX1-0.1044lnX2+0.1678lnX3-0.0128lnX4+0.0956lnX5+0.1092lnX6+0.0202lnX7+0.2958lnX8+0.1972lnX9+0.2296lnX10+0.1248lnX11-0.2137lnX12+0.2027lnX13+0.1358lnX14-0.0347lnX15+0.1489lnX16+0.2033lnX17

P4=0.3549lnX1+0.1672lnX2+0.0887lnX3+0.1341lnX4-0.1738lnX5+0.2678lnX6-0.3298lnX7-0.0525lnX8-0.1385lnX9+0.1690lnX10-0.0066lnX11+0.0218lnX12+0.0161lnX13+0.0220lnX14+0.0027lnX15-0.2032lnX16+0.1111lnX17

P5=-0.3713lnX1+0.3742lnX2-0.2276lnX3-0.2003lnX4+0.0149lnX5+0.2347lnX6-0.1497lnX7-0.0274lnX8+0.1340lnX9-0.0968lnX10+0.1686lnX11+0.0278lnX12+0.2159lnX13+0.3594lnX14+0.0288lnX15-0.1837lnX16-0.0735lnX17

依據(jù)各主成分的特征值大小，利用公式(5)計算出各主成分的權(quán)重分別為0.345、0.252、0.165、0.142、0.097。利用公式(7)對 lnXi的權(quán)重lij和主成分權(quán)重(Wj)計算得到抗旱綜合評價值Sf。

表4結(jié)果表明，各品種平均Sf值為0.706，分布區(qū)間在0.548～0.872，95%置信度為0.077。綜合抗旱Sf值排名前三位的材料分別為齊粳10(0.872)、DPB15(0.859)、DPB120(0.859)。綜合抗旱Sf值排名后三位的材料分別為瑩稻2(0.548)、DPB112(0.549)、綏稻3號(0.570)。

2.3 聚類分析

以抗旱綜合評價Sf值為依據(jù)，采用歐氏距離最長距離法對12個參試材料進(jìn)行聚類分析，最長距離大于0.104時分為3類:強(qiáng)抗旱型、中抗旱型和干旱敏感型(圖 1)。第Ⅰ類包括齊粳 10、DPB120和DPB15，屬強(qiáng)抗旱類型;第Ⅱ類包括綏育 117463、DPB71、齊粳10、綏育 118146和墾稻 24，屬中抗旱類型;第Ⅲ類由DPB70、綏稻3號、DPB112和瑩稻2組成，屬干旱敏感型。對類型間各指標(biāo)的抗旱系數(shù)和綜合抗旱值進(jìn)行方差分析，強(qiáng)抗旱類型的可溶性蛋白、SOD和POD與中抗旱型差異不顯著，與旱敏感型差異顯著或極顯著;強(qiáng)抗旱類型的抗旱綜合評價值極顯著高于中抗旱類型，中抗旱類型極顯著高于干旱敏感類型(表5)。

表4 品種抗旱性綜合評價結(jié)果Table 4 Comprehensive evaluation result of rice varieties on drought resistance

圖1 S f值的聚類分析Fig.1 System clustering of S f value

表5 不同抗旱類型水稻的抗旱系數(shù)及抗旱綜合評價值的方差分析Table 5 Variance analysis of DTC and S f of different drought tolerant type

2.4 抗旱系數(shù)與抗旱綜合評價值的灰色關(guān)聯(lián)分析

采用灰色關(guān)聯(lián)分析法分析各指標(biāo)抗旱系數(shù)與抗旱綜合評價值的關(guān)聯(lián)程度。將所有指標(biāo)的抗旱系數(shù)視為一個灰色系統(tǒng)，每個指標(biāo)的抗旱系數(shù)作為比較數(shù)列(子序列)，抗旱綜合評價值作為參考數(shù)列(母序列)，將各指標(biāo)的抗旱系數(shù)與抗旱綜合評價值作灰色關(guān)聯(lián)分析，關(guān)聯(lián)度越大，說明該指標(biāo)的抗旱系數(shù)與抗旱綜合評價值的變化趨勢越接近。抗旱綜合評價值與其他指標(biāo)抗旱系數(shù)的關(guān)聯(lián)系數(shù)如表6所示，除游離脯氨酸含量、傷流量和氣孔導(dǎo)度的關(guān)聯(lián)系數(shù)小于0.5，其他14個指標(biāo)關(guān)聯(lián)系數(shù)均大于0.5，與抗旱綜合指標(biāo)值有較大關(guān)聯(lián)?？紤]到進(jìn)行抗旱篩選的效率，可以選用關(guān)聯(lián)系數(shù)大，并容易測定的有效葉面積、高效葉面積、干物質(zhì)量和主穗穎花數(shù)為抗旱鑒定指標(biāo)。

表6 抗旱系數(shù)與抗旱綜合評價值的灰色關(guān)聯(lián)系數(shù)Table 6 Grey correlation coefficient of DTC and S f

3 討論

3.1 關(guān)于采用對數(shù)主成分分析合理性的探討

作物的抗旱性是多種抗旱機(jī)理的綜合反映，受基因型、環(huán)境和基因型×環(huán)境的共同影響，目前采用形態(tài)、生理、生化等與抗旱性密切相關(guān)的多個指標(biāo)綜合反映作物抗旱性已達(dá)成共識［16-17］。當(dāng)前多數(shù)學(xué)者［18-20］采取的方法是以抗旱系數(shù)(單項指標(biāo)處理與對照的比值)描述單項指標(biāo)變異，對各指標(biāo)的抗旱系數(shù)進(jìn)行主成分分析，計算各主成分的隸屬函數(shù)和主成分權(quán)重，然后進(jìn)行多個主成分加權(quán)，獲得各參試材料的抗旱性評價綜合D值。但是，傳統(tǒng)主成分分析法屬于線性降維，而評價指標(biāo)之間以及主成分和原始數(shù)據(jù)之間仍可能存在非線性關(guān)系，從而導(dǎo)致評價結(jié)果的偏差。為此，葉明確等［11］提出了一種對數(shù)主成分評價法，并通過傳統(tǒng)的主成分分析法和對數(shù)主成分評價法的比較，證明了傳統(tǒng)的主成分分析法運(yùn)用多個主成分進(jìn)行綜合評價是不可取的，僅用第一主成分進(jìn)行排名也存在不準(zhǔn)確性，而對數(shù)主成分評價法解決了指標(biāo)之間以及主成分與原始數(shù)據(jù)之間的非線性關(guān)系，具有現(xiàn)實(shí)意義上的合理性。紀(jì)龍等［8］在運(yùn)用該方法對綠色超級稻品種進(jìn)行綜合評價的過程中，對數(shù)主成分分析的指標(biāo)權(quán)重同專家打分法所得到的指標(biāo)權(quán)重較傳統(tǒng)主成分分析更為接近，也從另一個方面驗(yàn)證了其合理性。本研究采用均值化法對抗旱系數(shù)進(jìn)行無量綱化和取對數(shù)處理，之后進(jìn)行主成分分析，將17個指標(biāo)簡化為5個相互獨(dú)立的主成分，方差累計貢獻(xiàn)率達(dá)83.829%。在對數(shù)主成分分析的基礎(chǔ)上，計算各指標(biāo)的lnXi權(quán)重和主成分權(quán)重，進(jìn)而得到抗旱綜合評價Sf值。各參試品種Sf值變幅在 0.548～0.872，平均 0.706，95%置信度為0.077，綜合抗旱性最強(qiáng)的品種為齊粳10，最差的品種為瑩稻2。齊粳10已經(jīng)通過黑龍江省品種審定委員會審定，可以應(yīng)用于旱直播栽培或節(jié)水栽培，但其耐旱機(jī)理尚需進(jìn)一步研究。

3.2 關(guān)于抗旱篩選指標(biāo)選擇的探討

在進(jìn)行作物種質(zhì)資源抗旱性綜合評價時，如何確定與抗旱性關(guān)系最密切的評價指標(biāo)，如何提高評價效率是要解決的基本問題。一般的做法是以利用主成分加權(quán)得到的綜合評價指標(biāo)值為因變量，以各單項指標(biāo)抗旱系數(shù)為自變量，進(jìn)行逐步回歸分析，或者對綜合評價指標(biāo)值和各單項指標(biāo)抗旱系數(shù)作直線相關(guān)分析，或者將逐步回歸與相關(guān)分析結(jié)合以篩選抗旱評價指標(biāo)［21-22］。但是，作物生理因素間復(fù)雜的互作關(guān)系加之環(huán)境因素的影響，構(gòu)成了一個具有許多不確定因素的灰色系統(tǒng)。當(dāng)采用白化系統(tǒng)的方法進(jìn)行分析時，難以確切反映事物的本質(zhì)，如直線相關(guān)分析的R2若小于0.5，二者關(guān)系能用線性解釋的分量不足50%，基本不存在直線關(guān)系［23］?；疑P(guān)聯(lián)度分析是基于灰色系統(tǒng)的灰色過程而進(jìn)行的因素間時間序列比較，可比較客觀地反映出各指標(biāo)抗旱系數(shù)與作物抗旱性之間的相關(guān)密切程度。結(jié)果表明，參試材料有效葉面積、高效葉面積、干物質(zhì)量等14個指標(biāo)的抗旱系數(shù)與抗旱綜合評價Sf值的灰色關(guān)聯(lián)系數(shù)較大?？紤]到工作效率和鑒定成本，可以選用關(guān)聯(lián)系數(shù)排名前4位的有效葉面積、高效葉面積、干物質(zhì)量和主穗穎花數(shù)作為抗旱鑒定指標(biāo)。

4 結(jié)論

通過對數(shù)主成分分析和聚類分析，利用抗旱綜合評價值Sf對12份參試材料的抗旱性進(jìn)行評價，獲得強(qiáng)耐旱材料齊粳10、DPB120和DPB15，干旱敏感材料DPB70、綏稻3號、DPB112和瑩稻2。通過灰色關(guān)聯(lián)分析，從17個指標(biāo)中篩選出有效葉面積、高效葉面積、干物質(zhì)量和主穗穎花數(shù)4項適宜作為抗旱性篩選的指標(biāo)，為寒地水稻種質(zhì)資源抗旱性鑒定及抗旱育種提供依據(jù)。