呂敏娟，崔藝佳，李明麗，周曉霞，嚴(yán)達(dá)偉，董新星

(云南農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，云南 昆明 650201)

AIDA(axin interactor, dorsalization associated)基因，最初認(rèn)為是一種軸突連接分子，在酶的合成中起重要作用[1]。后圍繞敲除AIDA基因的易胖小鼠研究發(fā)現(xiàn)：AIDA基因編碼的AIDA蛋白能夠控制脂肪吸收的效率[2]。AIDA基因能夠與磷酸肌肽結(jié)合，或通過環(huán)狀結(jié)構(gòu)與細(xì)胞膜結(jié)合來發(fā)揮作用[3]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)蛋白降解(endoplasmic reticulum associated degradation, ERAD)是位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(endoplasmic reticulum, ER)中的一種蛋白降解系統(tǒng)[4]，以一種底物依賴性的方式執(zhí)行特殊細(xì)胞的功能[5-8]。AIDA基因是通過ERAD促進(jìn)小腸細(xì)胞內(nèi)脂肪合成酶的降解。在熱中性條件下，對(duì)敲除AIDA基因的小鼠喂食高脂肪食物時(shí)，小鼠體內(nèi)的脂肪酸會(huì)進(jìn)行再酯化，三酰甘油急劇增加，但是脂肪的生成并沒有增加[1]。因此， AIDA蛋白介導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)降解途徑可以通過降解脂肪合成途徑過程中的代謝酶，限制膳食脂肪在腸道的吸收，來抵御機(jī)體肥胖。

撒壩豬肌內(nèi)脂肪含量高，肉質(zhì)優(yōu)良[9-10]，但脂肪率較高，在動(dòng)物脂肪市場需求大幅下降、豬肉市場優(yōu)質(zhì)優(yōu)價(jià)機(jī)制尚未健全的情況下，其養(yǎng)殖比較效益受到了一定影響。鑒于AIDA基因與脂肪的吸收有關(guān)，本研究對(duì)撒壩豬AIDA基因編碼序列進(jìn)行克隆及序列特征分析，旨在揭示撒壩豬AIDA基因編碼區(qū)序列的生物信息學(xué)特征，運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測該基因在mRNA水平上的表達(dá)規(guī)律，豐富AIDA基因的數(shù)據(jù)庫信息，為撒壩豬AIDA基因與脂肪性狀相關(guān)的遺傳機(jī)制研究提供一定依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

采集撒壩豬、大河豬、杜洛克、大白豬和長白豬的耳組織樣，每個(gè)品種各90頭(公母各半)，裝入裝有75%乙醇的離心管中。采集撒壩豬脾臟、胰臟、背脂、腎臟、肺、大腦、肝臟、心臟、背最長肌和大白豬的背脂、背最長肌，用于各組織表達(dá)分析檢測。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì) 以GenBank中豬AIDA基因序列(登錄號(hào)：NC_010452.4)為模板，使用Primer premier 5.0軟件設(shè)計(jì)引物(見表1)：分別擴(kuò)增10個(gè)外顯子，涵蓋了AIDA基因的CDS區(qū)域。所設(shè)計(jì)的引物由北京擎科(昆明)生物技術(shù)有限公司合成。

1.2.2 基因組DNA提取 采用動(dòng)物基因組 DNA 提取試劑盒(TSINGKE)從耳組織樣品中提取DNA，儲(chǔ)于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 RNA提取與cDNA合成 采用Trizol法分別提取撒壩豬的脾臟、胰臟和背脂等9種組織以及大白豬的背脂和背最長肌的RNA，并反轉(zhuǎn)錄為cDNA，質(zhì)控合格后保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 PCR擴(kuò)增與測序 PCR反應(yīng)體系為25 μL，包含ddH2O18 μL，10×buffer(Mg2+)2.5 μL，上下游引物各0.5 μL(10 μmol/L)，dNTPs2.0 μL(2.5 mmol/L)，Taq聚合酶(5 U/μL)0.5 μL，DNA模板(50 ng/μL)1.0 μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性4 min，然后94 ℃變性30s→退火30s→72℃延伸30s，30個(gè)循環(huán)后，于72 ℃后延伸8 min，4 ℃終止反應(yīng)。退火溫度依次依引物而異(見表1)。PCR產(chǎn)物采用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

經(jīng)檢測后的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送至北京擎科(昆明)生物技術(shù)有限公司進(jìn)行序列測定，測序結(jié)果經(jīng)比對(duì)拼接后，獲得撒壩豬AIDA基因完整CDS序列。

表1 AIDA基因分段擴(kuò)增引物Table 1 AIDA gene fragment amplification primer

1.2.5 分析軟件 采用上述得到的CDS序列，經(jīng)一系列預(yù)測分析獲得AIDA基因的生物學(xué)信息。預(yù)測項(xiàng)目及軟件如表2所示。

1.2.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測 分別取撒壩豬和大白豬不同組織的cDNA，以GAPDH基因?yàn)閮?nèi)參，實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測AIDA基因在不同組織中的表達(dá)。取0.2 ml PCR管，配制如下反應(yīng)體系，每個(gè)反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物配制3管，反應(yīng)體系為25 μL：2×qPCR Mix 12.5 μL，7.5 μM 上下游引物2.0 μL(表3)，cDNA 2.5 μL，RNase-free水 8.0 μL。PCR反應(yīng)條件為：95 ℃，10 min為模板的預(yù)變性階段；95 ℃，15 s，60 ℃，60 s，共40個(gè)循環(huán)為模板的擴(kuò)增階段，60 ℃→95 ℃，每15 s緩慢升溫0.3 ℃，建立熔解曲線階段。結(jié)果用2-△△Ct法進(jìn)行計(jì)算。

表2 分析軟件Table 2 Analysis tools

2 結(jié)果與分析

2.1 AIDA基因多態(tài)性分析

對(duì)大白豬、長白豬、撒壩豬、杜洛克、大河豬等5種豬的AIDA基因編碼區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增、測序比對(duì)得出：AIDA基因在5個(gè)豬種間沒有發(fā)生錯(cuò)義突變，在長白豬群體中發(fā)現(xiàn)2個(gè)同義突變(C20554T，G20560A)，大白豬群體中發(fā)現(xiàn)3個(gè)同義突變(C20554T，G20560A，G34355A)，撒壩豬中檢測到1個(gè)同義突變(T7243C)。經(jīng)過SeqMan軟件對(duì)撒壩豬各個(gè)外顯子進(jìn)行拼接，利用DANMAN軟件翻譯，得到CDS的完整序列及氨基酸序列(圖1)。

表3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物序列信息Table 3 Real-time fluorescence quantitative PCR primer sequence information

2.2 AIDA基因氨基酸序列理化特性預(yù)測與分析

氨基酸是構(gòu)成生物功能大分子蛋白質(zhì)的基本組成單位，是動(dòng)物營養(yǎng)所需蛋白質(zhì)的最基本物質(zhì)[11]。經(jīng)ProtParam在線軟件預(yù)測顯示，撒壩豬AIDA蛋白由306個(gè)氨基酸組成，分子重34.973ku，其中亮氨酸(Leu)所占比例最高(11.1%)，色氨酸(Trp)所占比例最低(0.7%)，如表4。撒壩豬AIDA蛋白基本理化性質(zhì)如表5所示。其中AIDA蛋白的不穩(wěn)定指數(shù)為86.08，屬于不穩(wěn)定蛋白(注：不穩(wěn)定系數(shù)小于40，說明是穩(wěn)定蛋白，反之則是不穩(wěn)定蛋白[12])?？偲骄H水性為-0.541，屬于親水蛋白。運(yùn)用ExpAsy服務(wù)器上的Protscale程序預(yù)測撒壩豬AIDA蛋白的疏水性，結(jié)果如圖2。

2.3 AIDA蛋白信號(hào)肽預(yù)測與分析

信號(hào)肽在蛋白分泌的過程中起重要作用,分泌性蛋白質(zhì)合成后由信號(hào)肽引導(dǎo)其穿過合成所在的細(xì)胞到其他組織細(xì)胞中[13]。運(yùn)用SignalP軟件對(duì)撒壩豬AIDA蛋白的信號(hào)肽進(jìn)行預(yù)測。通過圖3可知，S<0.5，因此，撒壩豬AIDA蛋白不存在信號(hào)肽。

表4 AIDA蛋白的氨基酸組分Table 4 Amino acid component of AIDA protein

表5 AIDA蛋白的基本理化性質(zhì)Table 5 Basic physical and chemical properties of AIDA protein

圖2撒壩豬AIDA蛋白質(zhì)疏水性預(yù)測結(jié)果
Fig.2 The hydrophobicity profile of AIDA in pigs analyzed by Prot Scale in Saba pig

2.4 AIDA蛋白跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測與分析

對(duì)撒壩豬AIDA蛋白跨膜結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，預(yù)測結(jié)果如圖4。撒壩豬AIDA蛋白不存在跨膜結(jié)構(gòu)。

2.5 AIDA蛋白亞細(xì)胞定位

通過在線軟件PsortⅡ分析預(yù)測豬AIDA基因編碼蛋白的亞細(xì)胞定位[14]，結(jié)果如表6：該蛋白主要分布在細(xì)胞質(zhì)，其次為細(xì)胞質(zhì)膜，在細(xì)胞壁和胞外少量分布。因此，可以推斷出撒壩豬AIDA蛋白主要在細(xì)胞質(zhì)中發(fā)揮作用。

表6 撒壩豬AIDA蛋白亞細(xì)胞定位分值Table 6 Location score of AIDA in Saba pigs

2.6 AIDA蛋白卷曲螺旋預(yù)測與分析

卷曲螺旋主要存在于一些轉(zhuǎn)錄因子、結(jié)構(gòu)蛋白以及酶中，在細(xì)胞與外界環(huán)境之間的物質(zhì)與信息交換中可以發(fā)揮重要功能[15]。由圖5可見，在14、21、28三個(gè)窗口寬度下均檢測到AIDA蛋白含有兩個(gè)典型的卷曲螺旋結(jié)構(gòu)。

2.7 AIDA蛋白糖基化位點(diǎn)、磷酸化位點(diǎn)預(yù)測

運(yùn)用 NetNGlyc 1.0 預(yù)測撒壩豬AIDA蛋白N糖基化位點(diǎn)(圖6)，發(fā)現(xiàn)有1個(gè)糖基化位點(diǎn)，位于第51個(gè)氨基酸處，NLSE為0.579。由圖7可見，當(dāng)潛在磷酸化位點(diǎn)的閾值為0.5時(shí)，AIDA蛋白存在29個(gè)潛在的磷酸化位點(diǎn)，其中包含11個(gè)絲氨酸(Ser)位點(diǎn)、14個(gè)蘇氨酸(Thr)位點(diǎn)、4個(gè)酪氨酸(Tyr)位點(diǎn)。在撒壩豬AIDA蛋白上可能有unsp、PKC、CaM-II、GSK3等15種保守的蛋白激酶結(jié)合位點(diǎn)，在221處unsp分值最高，為0.996。

2.8 AIDA蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測

由圖8可見，AIDA蛋白α-螺旋區(qū)域有106個(gè)氨基酸，占34.64%，β轉(zhuǎn)角區(qū)域有12個(gè)氨基酸，占3.92%，無規(guī)卷曲區(qū)域有139個(gè)氨基酸，占45.42%，延伸鏈區(qū)域有49個(gè)氨基酸，占16.01%。

2.9 AIDA蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測

采用Phyre2對(duì)AIDA蛋白同源建模獲得三級(jí)結(jié)構(gòu)模型，撒壩豬的AIDA蛋白經(jīng)折疊、彎曲等一系列復(fù)雜的過程形成如圖9所示的三級(jí)結(jié)構(gòu)。

2.10 AIDA基因的分子進(jìn)化分析

對(duì)綿羊(XM_004013613.3)、山羊(XM_018060188.1)、牛(NM_001205634.1)、雞(NM_001277540.2)、猴(NM_001283182.1)、鼠(NM_181732.4)、人(NM_022831.3)和豬(XM_003130513.6)的AIDA基因編碼序列進(jìn)行同源性分析，結(jié)果顯示，豬AIDA基因編碼區(qū)序列與綿羊、黃牛、雞、山羊、人、猴、鼠的同源性分別為94.2%、94.4%、84.9%、94.4%、94.1%、93.8%、91.0%(圖10)。

對(duì)8個(gè)物種進(jìn)行進(jìn)化樹分析結(jié)果見圖11。由圖11知，撒壩豬與綿羊、山羊、黃牛的親緣關(guān)系較近。

2.11 撒壩豬AIDA基因CpG Plot預(yù)測

運(yùn)用CpG Plot在線軟件預(yù)測撒壩豬AIDA基因的CpG Island，結(jié)果顯示撒壩豬AIDA基因沒有CpG island。

2.12 AIDA基因組織表達(dá)分析

由圖12可知，AIDA基因在大白豬的背最長肌和背脂中表達(dá)量要高于撒壩豬。圖13可知，撒壩豬AIDA基因在不同組織中的表達(dá)量不同，在胰中的表達(dá)量明顯高于其他組織，AIDA基因表達(dá)量從高到低依次為胰臟、脾臟、背脂、腎臟、肺臟、大腦、肝臟、心臟和背最長肌。

S.撒壩豬；Y.大白豬；LD.背最長??；BF.背脂

S. Saba pig;Y. Yorkshire;LD. Longest back muscle;BF. Backfat

3 討 論

動(dòng)物脂肪沉積是脂肪合成和分解代謝平衡后的結(jié)果，受到脂肪合成、分解和脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)等方面的影響[16]。腸道內(nèi)消化的脂肪含量是控制食欲的關(guān)鍵部分[17-18]，脂肪進(jìn)入體內(nèi)后，首先在小腸里水解成脂肪酸和單酰甘油，之后被小腸上皮細(xì)胞攝入，在小腸上皮細(xì)胞中又重新合成脂肪，形成脂蛋白并從小腸上皮細(xì)胞分泌，進(jìn)入淋巴循環(huán)通過血管輸送到全身，被各個(gè)器官利用或儲(chǔ)存。脂肪合成途徑的代謝酶大多都定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)蛋白降解(ERAD)是位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)中的一種蛋白降解系統(tǒng)，能夠控制蛋白質(zhì)的組成，及時(shí)清理ER中未折疊的蛋白質(zhì)[3]。ERAD的失調(diào)會(huì)導(dǎo)致各種疾病的發(fā)生，如神經(jīng)疾病和代謝綜合征[19]。從機(jī)理上講，AIDA能夠與ERAD機(jī)制中的E3連接酶HRD1相互作用，下調(diào)TAG合成途徑中的限速酶，從而改變TAG合成途徑中酶的活性，導(dǎo)致脂肪吸收失調(diào)[20-22]。研究表明，對(duì)于敲除AIDA基因的小鼠，雖然能夠正常發(fā)育，但成年小鼠在中性溫度條件下生長時(shí)，即使采食正常的食物，也會(huì)嚴(yán)重肥胖，喂食高脂肪食物則會(huì)加劇肥胖程度[1]。而導(dǎo)致小鼠肥胖的主要原因可能是敲除AIDA基因的小鼠對(duì)膳食脂肪的高效率吸收。AIDA介導(dǎo)的ERAD是通過選擇性下調(diào)TAG合成酶來防止脂肪過度吸收，合成和儲(chǔ)存的第一道防線。檢測AIDA基因在草原紅牛不同組織中的表達(dá)量發(fā)現(xiàn)AIDA基因在腎臟、肌肉和脂肪中表達(dá)量占有較高比重[23]，三者均是脂代謝的重要場所[24]。

本研究發(fā)現(xiàn)，AIDA基因在5種豬群中沒有發(fā)現(xiàn)錯(cuò)義突變，推測是樣本的來源單一，血緣相對(duì)較窄，也可能是樣本量不足，導(dǎo)致低頻的基因型未被檢測到，同時(shí)也說明AIDA基因可能較為保守。AIDA基因在大白豬背最長肌和背脂中的表達(dá)量分別是撒壩豬的1.2倍、2.55倍(P<0.01)。檢測AIDA基因在撒壩豬各組織的表達(dá)量發(fā)現(xiàn)，AIDA基因在胰臟中的表達(dá)量最高。胰臟分為胰腺和胰島，胰腺分泌的胰液經(jīng)胰管進(jìn)入十二指腸，其中含有胰脂肪酶，胰脂肪酶能將中性脂肪分解成甘油和脂肪酸，使得膳食脂肪被充分的消化和吸收[25]。推測豬體內(nèi)的AIDA基因可能與前人的研究結(jié)果一致，在脂肪代謝、脂肪吸收和脂肪沉積中發(fā)揮著重要作用。

4 結(jié) 論

AIDA基因在5個(gè)豬種間沒有發(fā)生錯(cuò)義突變，有較高的保守性。屬于親水性蛋白，沒有信號(hào)肽、跨膜結(jié)構(gòu)和CpG Island，有2個(gè)卷曲螺旋結(jié)構(gòu)、29個(gè)磷酸化位點(diǎn)和1個(gè)糖基化位點(diǎn)，與綿羊、山羊、黃牛的親緣關(guān)系較近。AIDA基因在大白豬背最長肌和背脂中的表達(dá)量顯著高于撒壩豬，且在胰臟中的表達(dá)量高于其他組織。