殷建玫，朱云芬，薛 倩，李國(guó)輝，張會(huì)永，蘇一軍，韓 威

(江蘇省家禽科學(xué)研究所 國(guó)家級(jí)地方雞種基因庫(kù)，江蘇 揚(yáng)州 225125)

河南斗雞，原產(chǎn)地及中心產(chǎn)區(qū)為河南省開封市，1989年被《中國(guó)家禽品種志》收錄，2000年被列入國(guó)家級(jí)畜禽品種資源保護(hù)名錄[1]。河南斗雞飼養(yǎng)歷史悠久，在長(zhǎng)期的選擇和馴化過程中形成了與其他地方雞品種截然不同的的外貌特征，具有較強(qiáng)的斗性和抗擊打能力，是我國(guó)家禽庫(kù)極其寶貴的遺傳資源。

微衛(wèi)星標(biāo)記及線粒體DNA序列變異已被廣泛應(yīng)用于地方雞種的遺傳多樣性、遺傳結(jié)構(gòu)及起源分析[2-3]，然而這些DNA標(biāo)記在整個(gè)雞基因組中的覆蓋范圍是極其微小的，如雞微衛(wèi)星標(biāo)記僅有約30個(gè)，雞線粒體DNA的D-loop區(qū)域全長(zhǎng)也僅約1 200 bp，其所代表的基因組遺傳變異信息量非常有限。新一代測(cè)序技術(shù)的發(fā)展實(shí)現(xiàn)了SNP分子標(biāo)記的高通量檢測(cè)[4]，為從基因組水平上審視雞的遺傳進(jìn)化提供了高效準(zhǔn)確的研究方法。

本研究利用簡(jiǎn)化基因組測(cè)序(Restriction-site associated DNA sequencing，RAD-seq)鑒定河南斗雞基因組SNP標(biāo)記，通過與其他地方雞品種及引入雞品種比較，揭示河南斗雞的遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)，鑒定受選擇基因，為開展河南斗雞種質(zhì)特性評(píng)價(jià)、品種資源保護(hù)及開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

河南斗雞及對(duì)照組18個(gè)地方雞品種(狼山雞、安義瓦灰雞、固始雞、仙居雞、白耳黃雞、東鄉(xiāng)綠殼蛋雞、金湖烏鳳雞、文昌雞、大圍山微型雞、藏雞、茶花雞、瓢雞、惠陽(yáng)胡須雞、大骨雞、蕭山雞、鹿苑雞、邊雞、北京油雞)、2個(gè)引入雞品種(隱性白羽肉雞、安卡紅雞)來自于國(guó)家級(jí)地方雞種基因庫(kù)(江蘇)。每個(gè)品種按照家系選擇30個(gè)個(gè)體(10公、20母)，個(gè)體間無(wú)親緣關(guān)系。翅靜脈采血1～1.5 mL，檸檬酸鈉(ACD)抗凝，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 RAD-seq 簡(jiǎn)化基因組測(cè)序 常規(guī)酚-氯仿法提取基因組DNA，構(gòu)建pair-end文庫(kù)(300～500 bp)進(jìn)行RAD-seq雙酶切簡(jiǎn)化基因組測(cè)序。

1.2.2 SNP 質(zhì)控 SNP的鑒定采用GATK和samtools程序。質(zhì)控條件包括：Q20>95%，ddRAD depth>60%，SNP Call rate >90%，MAF>0.05。

1.2.3 統(tǒng)計(jì)分析 連鎖不平衡(LD)分析采用Haploview軟件，觀察雜合度(Ho)、近交系數(shù)(Fis)和群體分化指數(shù)(Fst)計(jì)算采用PopGen軟件，群體聚類分析應(yīng)用MEGA軟件UPGMA聚類法。選擇信號(hào)檢測(cè)采用PLINK軟件，以100 kb為窗口、10 kb為step進(jìn)行滑動(dòng)的θπ比率和Fst分布計(jì)算。

2 結(jié) 果

2.1 基因組SNP鑒定

經(jīng)過兩步數(shù)據(jù)質(zhì)控，在河南斗雞中鑒定出SNP 259,412個(gè)(表1)?？傮w上，SNP平均密度與染色體長(zhǎng)度呈正相關(guān)，大染色體上SNP分布較多(其中1～7號(hào)染色體上SNP數(shù)量均超過10,000個(gè))，小染色體上SNP分布較少。

表1 SNP在河南斗雞不同染色體上分布Table 1 SNP distribution on Henan game chicken chromosomes

2.2 群體遺傳多樣性分析

群體遺傳多樣性統(tǒng)計(jì)量結(jié)果(表2)表明，河南斗雞的觀察雜合度為0.1560，核苷酸多樣度為0.1752，近交系數(shù)為0.1099。與其他地方雞種相比，河南斗雞的遺傳多樣性相對(duì)較低，與LD連鎖不平衡分析結(jié)果(圖1)相一致。

表2 觀察雜合度、核苷酸多樣度和近交系數(shù)Table 2 Statistics of HO, Pi and Fis

2.3 群體遺傳結(jié)構(gòu)分析

河南斗雞與瓢雞之間的遺傳分化系數(shù)Fst最低(0.1765)，其次為文昌雞(0.1932)、惠陽(yáng)胡須雞(0.1980)，相對(duì)應(yīng)的基因流Nm分別為1.1665、1.0443和1.0125(表3)。河南斗雞與其它地方雞種間的平均遺傳分化系數(shù)Fst大于0.20，基因流Nm均小于1.00。聚類結(jié)果(見圖2)表明，河南斗雞形成了一個(gè)獨(dú)立的分支。

2.4 選擇信號(hào)分析

結(jié)合核苷酸多樣度θπ比率和遺傳分化系數(shù)Fst的選擇信號(hào)分析發(fā)現(xiàn)24個(gè)染色體區(qū)域受到選擇，129個(gè)受選擇基因。功能分析結(jié)果表明(圖3)，受選擇基因主要富集在代謝過程、神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育、微管細(xì)胞骨架、運(yùn)動(dòng)行為、適應(yīng)性免疫和刺激反應(yīng)等生物學(xué)通路。

表3 斗雞與其他品種間遺傳分化系數(shù)和基因流Table 3 Fst and Nm between DJ and other chicken breeds

圖2河南斗雞及其他雞種聚類圖
Fig.2 Phylogenetic tree of DJ and other chicken breeds

3 討 論

3.1 基因組SNP鑒定和遺傳多樣性分析

簡(jiǎn)化基因組RAD-seq測(cè)序技術(shù)能鑒定出合適數(shù)量、廣泛覆蓋基因組范圍的變異位點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于資源群體SNP發(fā)掘和遺傳多樣性研究[5-7]。本文利用RAD-seq測(cè)定了19個(gè)地方雞種的基因組序列，通過嚴(yán)格的質(zhì)控，在河南斗雞群體中鑒定出SNP標(biāo)記259,412個(gè)，這為在基因組水平上分析河南斗雞遺傳進(jìn)化提供了基礎(chǔ)。

斗雞是我國(guó)地方雞種中一類特殊的品種資源，由于主要是用于玩賞打斗，加之馴養(yǎng)方法非常保守(主要是靠斗雞愛好者小規(guī)模的家庭飼養(yǎng))，因此斗雞在品種形成過程中與其它地方雞種間鮮有血緣交流。本文的遺傳結(jié)構(gòu)分析結(jié)果很好地驗(yàn)證了這一點(diǎn)，在19個(gè)地方雞種中河南斗雞的平均遺傳分化系數(shù)Fst 最高(>0.20)、平均基因流Nm 最低(<0.10)，在系統(tǒng)發(fā)育樹中形成了一個(gè)獨(dú)立的分支。在19個(gè)地方雞種中河南斗雞的觀察雜合度Ho 和核苷酸多樣度Pi 最低，這與河南斗雞資源群體較小的表型變異相一致，已報(bào)道的基于微衛(wèi)星DNA及線粒體DNA研究結(jié)果也發(fā)現(xiàn)河南斗雞的遺傳多樣性相對(duì)匱乏[8]。河南斗雞群體的近交系數(shù)Fis(0.1099)處于較高水平，這提示在河南斗雞的保種過程中，應(yīng)嚴(yán)格控制近交水平的過快增加，保持遺傳多樣性的相對(duì)穩(wěn)定。

3.2 基因組選擇信號(hào)分析

自然選擇和人工選擇作用會(huì)在動(dòng)物基因組上留下選擇信號(hào)[9]，通過選擇信號(hào)分析，可以發(fā)掘重要的功能基因。目前，研究者通過基因組測(cè)序或芯片檢測(cè)，已經(jīng)對(duì)不同物種開展了選擇信號(hào)研究[10-13]，發(fā)掘出大量種質(zhì)特性相關(guān)基因。針對(duì)雞而言，Rubin等[14]在家雞中鑒定了與代謝調(diào)節(jié)和生殖光周期調(diào)控相關(guān)的促甲狀腺激素受體基因TSHR，在肉雞中發(fā)現(xiàn)與生長(zhǎng)、食欲和代謝調(diào)控相關(guān)的基因重疊在一起。Elferink等[15]在商業(yè)化品系雞、荷蘭及中國(guó)地方雞種中發(fā)現(xiàn)396個(gè)染色體區(qū)域受到選擇作用，其中26個(gè)區(qū)域顯示出強(qiáng)烈的選擇信號(hào)。Wang等[16,17]發(fā)現(xiàn)藏雞群體中受到選擇作用的基因在鈣離子信號(hào)通路中顯著富集，大量視覺相關(guān)基因在家雞馴化過程中受到正選擇作用，使視覺退化。

本文中，選擇信號(hào)分析結(jié)果表明河南斗雞基因組中有24個(gè)染色體區(qū)域受到選擇作用，受選擇基因顯著富集于不同的生物學(xué)通路。斗性行為是河南斗雞在進(jìn)化過程中形成的最顯著的特性，分析發(fā)現(xiàn)多個(gè)參與下丘腦-垂體-腎上腺/甲狀腺軸調(diào)控通路及激素介導(dǎo)信號(hào)通路的基因CRH、ADRB1、SLC64A、DRD1、SORCS2等受到選擇作用。腎上腺素、多巴胺、5-羥色胺及雄激素等已被證實(shí)是調(diào)控攻擊行為的主要神經(jīng)遞質(zhì)[18]，Vps10p蛋白家族成員SORCS2是調(diào)節(jié)雞攻擊行為的重要候選基因[19]。與成骨細(xì)胞分化、骨生長(zhǎng)及礦化相關(guān)的基因FBN2[20]、DDR2[21]和TWSG1[22]受到了選擇。這些基因的作用可能使得河南斗雞具有較其它雞種更粗壯致密的骨骼。與頭部發(fā)育相關(guān)的基因MEF2C、Wnt6也受到了選擇，Verzi等[23]研究發(fā)現(xiàn)由MEF2C與DLX5-6形成的前饋環(huán)是顱面骨發(fā)育中所必須的，Wnt基因在雞眼睛結(jié)構(gòu)的發(fā)育中發(fā)揮著重要作用[24]，這些基因的作用形成了河南斗雞頭蓋骨厚、臉部狹長(zhǎng)及獨(dú)特的眼部結(jié)構(gòu)特征。

心室發(fā)育與心臟收縮力調(diào)節(jié)基因FOXF1、MYL3，氧化還原酶活性基因PTGS2及線粒體呼吸鏈基因NDUFV2、STEAP4也受到了選擇作用，發(fā)達(dá)的心血管系統(tǒng)和能量代謝系統(tǒng)使得河南斗雞能夠適于長(zhǎng)時(shí)間激烈的打斗。另外，視覺及聲音感知基因RGS9BP、PDE6H，運(yùn)動(dòng)行為調(diào)節(jié)基因DSCAM也顯示出強(qiáng)烈的選擇信號(hào)，表明河南斗雞仍保持著野外生存狀態(tài)下必須的機(jī)警與敏感。

研究結(jié)果為全面評(píng)價(jià)河南斗雞種質(zhì)特性提供了重要遺傳信息，諸多受選擇基因的功能尚未有清晰的注釋，需要進(jìn)一步的深入研究。