王 潔 鄭運(yùn)亮 杜爾罡

1.浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院 杭州 310006 2.浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院

早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病變 （retinopathy of prematurity，ROP）是一種發(fā)生于早產(chǎn)兒和低出生體重嬰幼兒的視網(wǎng)膜血管增生性疾病。臨床上重度ROP表現(xiàn)為視網(wǎng)膜新生血管、視網(wǎng)膜出血、玻璃體腔積血伴牽拉性視網(wǎng)膜脫離等，嚴(yán)重影響患兒視功能和生活質(zhì)量，給家庭和社會帶來沉重的經(jīng)濟(jì)壓力。隨著圍生醫(yī)學(xué)的不斷發(fā)展，早產(chǎn)兒的存活率不斷增高，ROP的發(fā)病率也逐年上升。ROP病因眾多，發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，確切的病理機(jī)制仍不明確。目前關(guān)于ROP的研究主要集中于視網(wǎng)膜血管的改變，臨床上以抗血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）治療為主，但是療效有限，患兒視力預(yù)后不佳[1]，鮮有研究關(guān)注視網(wǎng)膜細(xì)胞本身的變化。研究證實(shí)，細(xì)胞自噬在視網(wǎng)膜疾病和功能障礙發(fā)生過程中具有重要作用，視網(wǎng)膜細(xì)胞代謝失衡所引起的細(xì)胞自噬與多種眼底疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。在溫和應(yīng)激反應(yīng)條件下，激活自噬有助于視網(wǎng)膜細(xì)胞存活；而嚴(yán)重應(yīng)激反應(yīng)容易導(dǎo)致自噬過度激活，又可引發(fā)視網(wǎng)膜細(xì)胞死亡[2]。因此本研究擬從視網(wǎng)膜自噬活性改變的角度入手，以期為闡明ROP的發(fā)病機(jī)制及臨床防治提供新的思路和研究方向。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 SPF級C57BL/6孕鼠18只購于上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動物有限公司[實(shí)驗(yàn)動物生產(chǎn)許可證號碼：SCXK（滬）2017-0005]，于浙江中醫(yī)藥大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心SPF級屏障系統(tǒng)飼養(yǎng)和繁殖[實(shí)驗(yàn)動物使用許可證號碼：SYXK（浙）2018-0012]。實(shí)驗(yàn)動物飼養(yǎng)和干預(yù)遵循浙江中醫(yī)藥大學(xué)的動物倫理操作要求。

1.2 主要試劑和儀器 P62、微管相關(guān)蛋白輕鏈3-Ⅱ（microtubule-associated protein light chain 3-Ⅱ，LC3-Ⅱ）、自噬相關(guān)基因5（autophagy-related gene 5，ATG5）引物購于上海生工生物有限股份公司 （批號：900170023）；FITC-Dextran、雷帕霉素（rapamycin，RAPA）購于美國Sigma公司 （批號：FD2000S、553211）；RNA提取及PCR熒光定量試劑盒均購自日本TAKARA公司（批號：639542、639505）；復(fù)方托吡卡胺購自日本參天制藥有限公司（批號：H20057919）。PCR儀為美國ABI公司產(chǎn)品；LSM880激光共聚焦顯微鏡購于德國卡爾蔡司光學(xué)有限公司。

1.3 ROP動物模型的構(gòu)建 將18只C57BL/6乳鼠分為3組，ROP模型組6只C57BL/6乳鼠出生后7d（postnatal day of life，P7）和母鼠一同放置在氧濃度為（75±0.5）%的高氧裝置中飼養(yǎng)5d（至P12），然后取出乳鼠和母鼠，置于正常氧濃度環(huán)境下飼養(yǎng)，至鼠齡17d（P17）[3]。 控制室溫（22±2）℃，光照12h循環(huán)。 正常對照組6只乳鼠從出生到P17均隨母鼠生活在正常氧濃度環(huán)境下，室溫及光照時間同ROP模型組。

1.4 ROP動物模型的自噬干預(yù) 自噬干預(yù)組6只乳鼠P7放入高氧裝置前行RAPA玻璃體腔注射。4%水合氯醛0.01mL/g腹腔注射麻醉后，以1滴復(fù)方托吡卡胺滴眼液滴眼散大瞳孔，解剖顯微鏡下采用10μL微量注射器經(jīng)角膜緣后約0.5mm的位置向右眼玻璃體腔注入1μL濃度為1nmol·μL-1的RAPA，左眼注入1μL無菌磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）。術(shù)后以氧氟沙星眼膏涂眼。小鼠蘇醒后與母鼠共同放入高氧裝置飼養(yǎng)5d至P12，然后取出小鼠在正常氧濃度環(huán)境下飼養(yǎng)至P17，飼養(yǎng)條件同ROP模型組。

1.5 熒光素視網(wǎng)膜血管灌注 P17造模結(jié)束后，從3組中各選小鼠3只，仰臥固定后以4%水合氯醛0.01mL/g腹腔注射麻醉，小心剪開胸腔，暴露心臟。在50mg FITC-Dextran中加入lmL蒸餾水，配置FITCDextran灌注液。以FITC-Dextran灌注液緩慢行左心室灌注，并穿刺右心房作回流，持續(xù)約3min，小鼠口唇、鼻尖及趾尖呈黃綠色表示心臟灌注成功。CO2麻醉處死小鼠后摘下雙眼球，并以4%多聚甲醛固定2h。在顯微鏡下分離視網(wǎng)膜，將載玻片放入多聚甲醛溶液中，托出視網(wǎng)膜并鋪平。中性樹脂膠封片后蓋上蓋玻片，立即置于激光共聚焦顯微鏡下，觀察小鼠視網(wǎng)膜血管形態(tài)并照相。

1.6 定量即時聚合酶鏈反應(yīng) （quantitative real-time polymerase chain reaction，RT-qPCR）檢測小鼠視網(wǎng)膜組織自噬相關(guān)基因表達(dá) P17造模結(jié)束后，從3組各選取余下小鼠3只，以CO2麻醉處死小鼠，分離視網(wǎng)膜組織，按照Trizol試劑操作流程提取視網(wǎng)膜總RNA，按照操作說明書程序完成逆轉(zhuǎn)錄，并以實(shí)時熒光定量PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增。反應(yīng)條件：95℃ 3min，95℃ 10s，60℃ 30s，共48個循環(huán)。熔解曲線：從55℃開始，每30s升高0.5℃，直到95℃，循環(huán)1次。PCR引物序列見表1。各組小鼠視網(wǎng)膜中P62、LC3-Ⅱ及ATG5的mRNA相對表達(dá)量采用公式2-△△CT計算。

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料以±s表示，各組數(shù)據(jù)均行正態(tài)性分析，符合正態(tài)分布的資料，兩組間比較采用t檢驗(yàn)；多組間比較采用單因素方差分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ROP模型的建立 正常對照組小鼠視網(wǎng)膜血管自視盤向四周放射狀均勻分布，血管分布規(guī)則整齊，無閉塞。見圖1A。ROP模型組小鼠視盤周圍視網(wǎng)膜見大片無灌注區(qū)，血管分支減少，中周邊視網(wǎng)膜血管扭曲、擴(kuò)張，可見大量新生血管。見圖1B、C。證明本研究ROP動物模型建立成功。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

2.2 RAPA對視網(wǎng)膜血管的影響 自噬干預(yù)組小鼠視網(wǎng)膜鋪片顯示，視盤周圍視網(wǎng)膜血管稀疏，無灌注區(qū)較ROP模型組減少。見圖1D。提示RAPA干預(yù)后，視網(wǎng)膜無灌注區(qū)較前減少。

2.3 各組小鼠P62、LC3-Ⅱ及ATG5的mRNA表達(dá)比較 與正常對照組比較，ROP模型組小鼠P17時P62的mRNA相對表達(dá)量由1.00±0.05升高到1.29±0.06，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。與ROP模型組比較，自噬干預(yù)組P62的mRNA相對表達(dá)量下降到1.14±0.07，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。與正常對照組比較，ROP模型組LC3-Ⅱ和ATG5的mRNA相對表達(dá)量分別由 1.00±0.10、1.00±0.11 下降到 0.75±0.09 和0.81±0.09，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，P＜0.05），自噬干預(yù)后LC3-Ⅱ和ATG5的mRNA相對表達(dá)量分別升高到0.81±0.05、0.87±0.4， 但是ROP模型組與自噬干預(yù)組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05，P＞0.05）。見圖 2。提示ROP模型組小鼠視網(wǎng)膜自噬活性發(fā)生改變。

3 討論

ROP是一種視網(wǎng)膜血管未發(fā)育完全，伴視網(wǎng)膜血管新生及纖維組織增生的眼部血管性視網(wǎng)膜病變，是早產(chǎn)兒及低出生體重兒主要致盲性眼病之一。目前臨床上對ROP的診斷多聚焦在視網(wǎng)膜血管的改變上，比如后極部膨脹的小靜脈和迂曲的小動脈被認(rèn)為是ROP發(fā)生的高危表現(xiàn)[4]。但是ROP的特征不僅僅是視網(wǎng)膜血管異常，ROP患者長期神經(jīng)視網(wǎng)膜功能低下，說明其視網(wǎng)膜細(xì)胞也發(fā)生了功能障礙[5]。本研究發(fā)現(xiàn)，ROP發(fā)生發(fā)展過程中，除了視網(wǎng)膜血管發(fā)生異常增生改變外，視網(wǎng)膜細(xì)胞中自噬相關(guān)指標(biāo)的活性也發(fā)生了改變。

自噬是細(xì)胞質(zhì)成分運(yùn)輸?shù)饺苊阁w進(jìn)行降解的胞內(nèi)途徑，正常生理狀態(tài)下細(xì)胞通過自噬清除衰老細(xì)胞器及突變蛋白，以維持自身結(jié)構(gòu)穩(wěn)定及功能正常。自噬功能障礙會導(dǎo)致有害蛋白和廢棄細(xì)胞器的積聚，影響細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)，從而引起細(xì)胞功能喪失，導(dǎo)致疾病發(fā)生和發(fā)展[6]。研究證實(shí)，眼部細(xì)胞包括角膜細(xì)胞和視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞等都依賴自噬以維持正常的結(jié)構(gòu)和生理功能[2，7]。

LC3是自噬相關(guān)基因8（autophagy related gene 8，ATG8）在人體內(nèi)的3種同源體之一，在自噬泡形成階段起著至關(guān)重要的作用[8]。本研究發(fā)現(xiàn)，與正常對照組比較，ROP模型組中LC3-Ⅱ的mRNA水平表達(dá)降低，表明經(jīng)過高氧和正常氧濃度環(huán)境處理后，小鼠視網(wǎng)膜組織的自噬活性受到抑制。P62可連接LC3和泛素化的底物，并在自噬溶酶體中降解細(xì)胞器，同時還參與形成 RAPA靶蛋白 （mammalian target of rapamycin，mTOR）復(fù)合物。當(dāng)自噬受到抑制時，自噬體積聚，P62表達(dá)水平升高[9]。本研究顯示，ROP模型組中視網(wǎng)膜組織P62 mRNA表達(dá)升高，同樣證明視網(wǎng)膜組織自噬活性被抑制。ATG調(diào)控細(xì)胞質(zhì)中大分子物質(zhì)和一些內(nèi)源性底物在自噬囊泡中的降解過程[10]，ROP模型組中ATG5的mRNA表達(dá)也降低，再次提示視網(wǎng)膜組織中自噬活性被抑制。

mTOR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是自噬過程中的經(jīng)典信號通路，是唯一的抑制性信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，在自噬水平的調(diào)控中起著重要作用[11]。本研究中應(yīng)用自噬激動劑，也是mTOR信號通路抑制劑的RAPA進(jìn)行玻璃體腔注射后，自噬干預(yù)組視網(wǎng)膜視盤周圍的無灌注區(qū)減少，同時P62 mRNA表達(dá)略有下降，提示mTOR信號通路可能通過調(diào)控視網(wǎng)膜細(xì)胞的自噬活性參與ROP疾病的發(fā)生。

本研究通過觀察正常對照組、ROP模型組以及自噬干預(yù)組小鼠視網(wǎng)膜血管形態(tài)改變，并分析自噬相關(guān)基因P62、LC3-Ⅱ和ATG5表達(dá)水平的變化，結(jié)果提示ROP的發(fā)生發(fā)展可能與自噬活性下降有關(guān)。目前自噬在視網(wǎng)膜病變中的具體機(jī)制仍不明確，了解自噬在ROP中的作用，有助于為ROP防治提供新的思路。