馬佳麗 蔣殷盈 蔣福升 李石清 張 婷 袁 強(qiáng) 張春椿

1.浙江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院 杭州 310053 2.浙江中醫(yī)藥大學(xué)生命科學(xué)院 3.浙江中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)技術(shù)學(xué)院

多花黃精（Polygonatum cyrtonema）系百合科黃精屬植物，是中藥材黃精主要基源之一，為一種重要的野生中藥資源。多花黃精為藥食同源的多年生草本植物，其味甘、平，歸脾、肺、腎經(jīng)，具有補(bǔ)氣養(yǎng)陰、健脾、潤(rùn)肺、益腎等功效，主要用于脾胃氣虛、體倦乏力、口干食少、肺虛咳嗽、勞嗽咳血、精血不足、須發(fā)早白、內(nèi)熱消渴等病癥[1]。現(xiàn)代研究表明，多花黃精主要含有多糖[2-3]、甾體皂苷[4-5]、黃酮、生物堿、木脂素、果糖[6]、氨基酸[7]等化學(xué)成分，具有抗衰老、抗腫瘤、降血糖、降血脂、免疫調(diào)節(jié)、改善記憶障礙、保護(hù)腎功能等多種藥理作用[8-13]。

黃精的“九蒸九曬”加工方法始載于《食療本草》：“餌黃精……可取甕子，去底，釜上安置，令得所盛黃精，令滿，密蓋，蒸之，令氣溜，即暴之第一遍，蒸之亦如此，九蒸九曝。”[14]經(jīng)九制的黃精油潤(rùn)軟糯，味道甘甜，且儲(chǔ)存時(shí)間延長(zhǎng)，因此，此炮制方法仍延續(xù)至今。但九蒸九制的炮制機(jī)理和意義尚未進(jìn)行系統(tǒng)科學(xué)詮釋且其研究較少。本研究通過(guò)對(duì)多花黃精炮制過(guò)程中物理化學(xué)性質(zhì)、物質(zhì)含量等變化規(guī)律的探索，為多花黃精九蒸九制的優(yōu)化提供理論依據(jù)。

1 試藥與儀器

1.1 試藥 多花黃精，采集于浙江麗水景寧，經(jīng)浙江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院張春椿副教授鑒定為百合科黃精屬植物多花黃精Polygonatum cyrtonema Hua的根莖，樣品采收后除去泥沙及須根、60℃烘干至恒重；九蒸九制多花黃精（自制）；乙醇分析純（天津科密歐化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：20161105）；蒽酮（上海展云化工有限公司，批號(hào)：160115）；硫酸（西隴科學(xué)股份有限公司，批號(hào)：161009）；甲酸（上海凌峰化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：090610）；乙腈 （Spectrum Chemical Mfg.Corp，批號(hào)：16075051）；5-羥甲基糠醛對(duì)照品（上海源葉生物科技有限公司，批號(hào)：H12M9Z61023）；娃哈哈純凈水。

1.2 儀器 戴安U3000分析型高效液相（美國(guó)賽默飛戴安），Waters XB-C18（250mm×4.6mm，5μm）（JL科技股份有限公司），超聲波清洗器（上海科導(dǎo)超聲儀器有限公司），HC-3618R高速冷凍離心機(jī)（安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司），AL104電子天平 （上海梅特勒-托利多儀器有限公司），UV3300紫外分光光度計(jì) （美國(guó)Amersham Biosciences），HH-8數(shù)顯恒溫水浴鍋（金壇市城東盛聯(lián)實(shí)驗(yàn)儀器廠），SHB-Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵 （鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司），GZX-970 MBE電熱鼓風(fēng)干烘箱（上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠），DJ-04中藥粉碎機(jī) （上海定久中藥機(jī)械知道有限公司），F(xiàn)iveEasy Plus pH計(jì)（上海梅特勒-托利多儀器有限公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 九蒸九制多花黃精樣品及其水提液的制備 挑選大小相近的多花黃精切片，置蒸鍋隔層上，多花黃精體質(zhì)量與水量1:1，隔水蒸4h后取出，放入60℃烘箱中干燥12h，此為“一蒸一制”，標(biāo)記為PCH1。在此基礎(chǔ)上重復(fù)循環(huán)，直至 “九蒸九制”并標(biāo)記為多花黃精PCH1-9。同時(shí)收集每次蒸制后的剩余水提液，標(biāo)記為S1-9，裝入凍存管中并放至-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 外觀、氣味、水提液pH、干物質(zhì)體質(zhì)量變化結(jié)果 分別取100mL多花黃精S1-9批次水提液放置于常溫解凍，測(cè)定水提液的pH值及蒸干后得到的干物質(zhì)體質(zhì)量。隨著多花黃精蒸制次數(shù)的增多，其顏色會(huì)由淺黃變?yōu)樯钭厣咏谏湔糁频玫降乃嵋簆H也逐漸減小。不同批次外觀、氣味、水提液pH、干物質(zhì)體質(zhì)量變化結(jié)果見(jiàn)表1、圖1。

2.3 九蒸九制多花黃精多糖含量測(cè)定

2.3.1 對(duì)照品溶液的制備 精密稱(chēng)取在105℃下干燥至恒重的無(wú)水葡萄糖對(duì)照品33mg，置于100mL容量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度線，搖勻，即得標(biāo)準(zhǔn)品溶液（每1mL溶液中含無(wú)水葡萄糖300μg）。

2.3.2 供試品溶液的制備 樣品烘干至恒重，打粉，過(guò)60目篩。精密稱(chēng)取各批次樣品10.0g，加入80%乙醇回流1h抽濾，再加水100mL，回流2h，趁熱抽濾，合并濾液濃縮至50mL，取1mL稀釋至200mL容量瓶中，定容。

2.3.3 波長(zhǎng)的選擇 按照2015版《中國(guó)藥典》一部黃精多糖檢測(cè)項(xiàng)下規(guī)定，黃精多糖在紫外可見(jiàn)光區(qū)582nm處有最大吸收峰[1]，故檢測(cè)波長(zhǎng)設(shè)定為582nm。

2.3.4 線性關(guān)系考察 分別精密移取對(duì)照品溶液0.0mL、0.1mL、0.2mL、0.3mL、0.4mL、0.5mL、0.6mL 于10mL干燥潔凈的具塞刻度試管中，依次加入超純水使溶液的最終體積為2mL，0.2%蒽酮-硫酸溶液緩緩加入到試管至刻度線，搖勻，紫外分光光度計(jì)測(cè)定吸光度。以濃度為橫坐標(biāo)、吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，其回歸方程C=39.039x-0.0167（R2=0.9991），表明葡萄糖對(duì)照品在0.033～0.0198g·L-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.3.5 精密度考察 精密移取6份0.2mL對(duì)照品溶液，按上述方法在波長(zhǎng)582nm處測(cè)定吸光度。其多糖含量分別為71.13、70.37、71.64、70.88、70.37、71.90mg·g-1，計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）值為0.90%，表明檢測(cè)儀器精密度良好符合試驗(yàn)要求。

表1 多花黃精外觀、氣味、水提液pH、干物質(zhì)重量Tab.1 Appearance，odor，water extracts pH，dry matter weight of Polygonatum cyrtonema

2.3.6 重復(fù)性考察 精密稱(chēng)量6份0.25g多花黃精樣品粉末，按照“2.3.2”方法制成樣品溶液，測(cè)定吸光度。其多糖提取率分別為7.449%、7.297%、7.362%、7.177%、7.377%、7.444%，計(jì)算RSD值為1.39%，表明該測(cè)定方法的重復(fù)性良好。

2.3.7 穩(wěn)定性考察 取供試品溶液分別于1、2、3、4、5、6h后測(cè)定吸光度。其多糖提取率分別為72.16、71.13、72.67、74.21、74.72、73.69mg·g-1，計(jì)算RSD值為1.85%，表明供試品溶液在制備后6h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.8 加樣回收考察 取已知含量的多花黃精粉末1.0g，制備成9份供試品溶液，各按照樣品中總多糖含量的80%、100%、120%加入無(wú)水葡萄糖對(duì)照品，測(cè)定吸光度。計(jì)算其平均回收率為99.96%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）值為0.91%，表明準(zhǔn)確度良好。

2.3.9 九蒸九制多花黃精多糖含量測(cè)定結(jié)果 PCH1-9多糖含量分別為11.60%、6.98%、2.99%、3.04%、3.87%、3.40%、2.96%、3.34%、3.99%。

2.4 5-羥甲基糠醛含量變化

2.4.1 色譜條件 色譜柱（Waters XB-C18，250mm×4.6mm，5μm），柱溫為30℃，檢測(cè)波長(zhǎng)為281nm，流動(dòng)相為A（乙腈）及B（0.1%甲酸-水溶液），兩相等度（5:95）洗脫，流速為1.0mL·min-1，進(jìn)樣量為10μL，采用UV檢測(cè)檢測(cè)器。

2.4.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱(chēng)取5-羥甲基糠醛對(duì)照品適量，加甲醇溶解，配成濃度為14.17mg·L-1的母液。采用逐級(jí)稀釋的方法，分別得到濃度為0.4427、0.8854、1.771、3.542、7.083、14.17mg·L-1的 對(duì)照品溶液。

2.4.3 供試品溶液的制備 取多花黃精粉末約1g（過(guò)3號(hào)篩），精密稱(chēng)定，置具塞錐形瓶中，加入60%乙醇20mL，密塞，稱(chēng)重，超聲30min，放冷后用60%乙醇補(bǔ)足體質(zhì)量，搖勻后取1.5mL于離心管中，10000轉(zhuǎn)離心10min，將上清液過(guò)膜轉(zhuǎn)移至液相瓶中。

2.4.4 線性關(guān)系考察 將“2.4.2”中對(duì)照品溶液，精密吸取10μL，注入液相色譜儀，測(cè)得峰面積積分值。以濃度mg·L-1為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算回歸方程為y=16.456x-5.0144（R2=0.9994），結(jié)果表明5-羥甲基糠醛在0.4427mg·L-1～14.17mg·L-1的濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，符合試驗(yàn)要求。

2.4.5 精密度考察 取5-羥甲基糠醛標(biāo)準(zhǔn)品溶液，在上述色譜條件下進(jìn)行分析，進(jìn)樣6次，每次10μL，測(cè)定峰面積并計(jì)算RSD為0.82%，表明儀器的精密度良好。

2.4.6 重復(fù)性考察 平行稱(chēng)取PCH7的多花黃精粉末6份，按“2.4.3”方法制成樣品溶液，精密吸取10μL，在上述色譜條件下進(jìn)行分析，測(cè)定峰面積并計(jì)算RSD為0.67%，表明可重復(fù)性良好。

2.4.7 穩(wěn)定性考察 取PCH9的供試品溶液10μL分別于0、2、4、8、12、24h進(jìn)樣測(cè)定5-羥甲基糠醛的峰面積并計(jì)算RSD為0.41%，表明樣品溶液在24h內(nèi)穩(wěn)定。

2.4.8 加樣回收考察 精密稱(chēng)取已知含量的多花黃精樣品粉末，制備成9份供試品溶液，各按照樣品中5-HMF含量的80%、100%、120%加入5-羥甲基糠醛對(duì)照品，測(cè)定峰面積。計(jì)算其平均回收率為100.49%，RSD為0.98%，表明準(zhǔn)確度良好。

2.4.9 5-羥甲基糠醛含量測(cè)定結(jié)果 PCH1-9中5-羥甲基糠醛含量分別為0.00619、0.00714、0.00964、0.0180、0.0602、0.109、0.205、0.214、0.277mg·g-1。 5-HMF標(biāo)準(zhǔn)品高效液相色譜圖（High Performance Liquid Chromatograph，HPLC）見(jiàn)圖2，不同蒸制次數(shù)的多花黃精樣品HPLC色譜圖見(jiàn)圖3。

3 分析與討論

隨著多花黃精蒸制次數(shù)的增加、時(shí)間的延長(zhǎng)，外觀顏色由淺轉(zhuǎn)深，九蒸九曬的多花黃精呈烏黑色，且微有光澤，質(zhì)堅(jiān)且柔軟，氣味香甜醇厚，表明炮制過(guò)程中多花黃精可能發(fā)生較為復(fù)雜的物理化學(xué)變化。文獻(xiàn)報(bào)道美拉德反應(yīng)過(guò)程中產(chǎn)生新的有色化合物（如類(lèi)黑素）[15-16]，多花黃精水提液呈弱酸性，九次蒸制后，水提液pH值由5.81下降為3.72，可能原因是美拉德反應(yīng)會(huì)產(chǎn)生的甲酸和乙酸，因此導(dǎo)致水提液酸性增強(qiáng)[17-19]。多花黃精的干物質(zhì)量在第一次蒸制時(shí)含量最多，后面趨于平緩，可能是由于第一次蒸制，細(xì)胞吸水膨脹，細(xì)胞壁破裂嚴(yán)重，導(dǎo)致開(kāi)始析出的物質(zhì)較多，隨后幾次蒸制逐漸趨于平穩(wěn)。多糖大都存在于植物細(xì)胞壁或細(xì)胞內(nèi)部，隨著蒸制時(shí)間加長(zhǎng)，高溫炮制導(dǎo)致細(xì)胞中核膜和液泡膜的破裂[28]，也可能是由于黃精炮制后的糖類(lèi)成分和氨基酸多肽蛋白類(lèi)成分在高溫下發(fā)生了十分復(fù)雜的美拉德反應(yīng)所致[20]。七次蒸制的多花黃精的多糖含量達(dá)13.51%，而隨著繼續(xù)蒸制，多糖易流失，因此七蒸之后的多糖提取率呈下降趨勢(shì)[21]。

每一蒸制的多花黃精樣品中都檢測(cè)到5-HMF，且隨著蒸制次數(shù)變多，其含量逐漸上升。研究表明，5-羥甲基糠醛具有防治神經(jīng)退行性疾病和抗心肌缺血等作用，但也對(duì)黏膜、眼睛、皮膚有刺激性，可與人體蛋白質(zhì)結(jié)合而引起毒性，造成橫紋肌麻痹和內(nèi)臟損害，并且具有神經(jīng)毒性和潛在的遺傳及生殖毒性[22-23]。故通過(guò)對(duì)九蒸九制過(guò)程中5-HMF的含量進(jìn)行測(cè)定，可為多花黃精九蒸九制的優(yōu)化提供理論依據(jù)。

七蒸七制時(shí)，多糖含量較高且外觀、氣味、水提液pH與八蒸八制、九蒸九制時(shí)基本無(wú)異，同時(shí)5-HMF含量也相對(duì)較高，這為多花黃精九蒸九制的必要性提供了參考，且為多花黃精發(fā)揮最佳功效蒸制次數(shù)試驗(yàn)提供了新思路。