肖彩仙， 段 恒， 唐立明

（重慶醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院，重慶400016）

近年來(lái)，由于生活方式和社會(huì)環(huán)境的改變，晚婚晚育者、卵巢功能不全者和腫瘤年輕患者等增多，不孕癥患者比例逐年上升［1］。卵母細(xì)胞體外成熟（in vitro maturation，IVM）成為治療不孕癥的一種潛在有效的方法［2］。目前，全世界應(yīng)用IVM技術(shù)誕生的試管嬰兒有5 000多名，中國(guó)也廣泛應(yīng)用該技術(shù)治療多囊卵巢綜合征的不孕患者［3-4］。盡管IVM實(shí)踐有了很大發(fā)展，但仍然存在成熟率低、穩(wěn)定性差等問題，不能得到全面推廣［5］。中藥可用于輔助生殖，減輕卵巢過度刺激綜合征，改善卵泡發(fā)育和卵子質(zhì)量［6］。養(yǎng)精種玉湯（Yangjing-Zhongyu decoctin，YZD）為治療不孕癥的經(jīng)典名方，臨床和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究顯示，養(yǎng)精種玉湯可以治療女性不孕，提高卵母細(xì)胞成熟率［7-8］。

血小板源性生長(zhǎng)因子（platelet-derived growth factor，PDGF）家族的成員是由4種不同基因編碼的4種不同多肽鏈（A、B、C和D）組成的二聚糖蛋白，這些多肽鏈合成時(shí)為無(wú)活性前體，在蛋白水解加工后，4個(gè)PDGF鏈通過同源二聚化或異二聚化組裝成二硫鍵連接的二聚體，產(chǎn)生5種不同的二聚體同種型：PDGF-AA、PDGF-AB、PDGF-BB、PDGF-CC和PDGFDD［9］。有研究顯示，PDGF的A亞基（PDGF subunit A，PDGFA）和 PDGF受 體 α（PDGF receptorα，PDGFRα）在卵母細(xì)胞中表達(dá)，向培養(yǎng)基中添加PDGF可以促進(jìn)原始卵泡的發(fā)育，而PDGFRα基因的突變則會(huì)導(dǎo)致小鼠卵巢變小，進(jìn)而影響卵母細(xì)胞的成熟［10-12］。因此，本研究觀察養(yǎng)精種玉湯對(duì)小鼠卵母細(xì)胞體外成熟的影響，并進(jìn)一步觀察養(yǎng)精種玉湯對(duì)小鼠卵母細(xì)胞體外成熟PDGFA和PDGFRα表達(dá)的影響，探討PDGFA和PDGFRα對(duì)小鼠卵母細(xì)胞體外成熟的作用機(jī)制。

材料和方法

1 材料

1.1 動(dòng)物 SPF級(jí)雌性KM小鼠140只，8～10周齡，體質(zhì)量25～30 g，SPF級(jí)雄性KM小鼠12只，12周齡，體質(zhì)量30～35 g，均由重慶醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，許可證號(hào)為SYXK（渝）2018-0003。

1.2 藥物和試劑 養(yǎng)精種玉湯含熟地90 g、當(dāng)歸45 g、白芍45 g和山萸肉45 g，購(gòu)自重慶桐君閣大藥房，經(jīng)重慶醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院中藥教研室制備成含生藥1.5 kg/L的浸膏；由費(fèi)耀教授根據(jù)2015版《中國(guó)藥典》鑒定為正品，生產(chǎn)批號(hào)為20181102。注射用尿促卵泡激素（follicle stimulating hormone，F(xiàn)SH；麗珠制藥廠，生產(chǎn)批號(hào)H20052130）；孕馬血清促性腺激素（pregnant mare serum gonadotropin，PMSG；浙江寧波三生藥業(yè)有限公司，生產(chǎn)批號(hào)110044564）；胎牛血清（Biological Industries，04-400-1B）；M199培養(yǎng)基（Gibco，12340030）；抗PDGFA抗體（Affinity，AF5179）；抗PDGFRα抗體（Affinity，AF0241）；抗 β-actin抗體（CST，4970T）；goat anti-rabbit IgG（博奧森，0295G）；RNA提取試劑盒（Axygen，AP-MN-MS-RNA-50）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（Bimake，B24403）。

1.3 儀器 CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱（Thermo）；XTL-400型體視顯微鏡（重慶澳浦光電技術(shù)有限公司）；Synergy HTX全自動(dòng)酶標(biāo)儀和CFX PCR檢測(cè)系統(tǒng)（Bio-Rad）；Odyssey Fc雙色紅外熒光成像系統(tǒng)（LI-COR Biosciences）；NanoDrop 2000超微量核酸測(cè)定儀（Thermo）。

2 方法

2.1 養(yǎng)精種玉湯血清的制備 將16只雌性小鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為對(duì)照組和養(yǎng)精種玉湯組，每組各8只，按20 g/kg劑量灌胃給藥，正常組給等體積的生理鹽水，每天1次，連續(xù)3 d。我們前期采用高效液相色譜監(jiān)測(cè)養(yǎng)精種玉湯的最佳取血時(shí)點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)養(yǎng)精種玉湯灌胃后0.5 h達(dá)最高藥物吸收峰值，因此我們選擇末次給藥0.5 h后摘眼球取血。常溫下靜置2 h，4℃、3 000 r/min離心15 min，0.22μm微孔濾膜過濾除菌后分裝，于-80℃冷藏備用。

2.2 小鼠卵母細(xì)胞的采集與分組 小鼠處死前46～48 h腹腔注射10 U PMSG，每只0.1 mL，無(wú)菌打開腹腔，取出卵巢，清洗3次。在解剖鏡下，用1 mL注射針頭刺破卵巢中的卵泡，用巴氏吸管收集未成熟的卵母細(xì)胞-顆粒細(xì)胞復(fù)合體（oocyte-granulosa cell complexes，OCCs），反復(fù)清洗4次，將多只小鼠OCCs混合后分為空白（blank）組、空白血清（blank serum）組、養(yǎng)精種玉湯血清（YZD）組和FSH組。將各組分別放入加有10%胎牛血清的M199培養(yǎng)液中，空白血清組、養(yǎng)精種玉湯血清組和FSH組分別加入2%的小鼠血清、養(yǎng)精種玉湯小鼠血清和75 U FSH。放入37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

2.3 卵母細(xì)胞成熟率的計(jì)算 OCCs體外培養(yǎng)24 h后，用透明質(zhì)酸酶消化去除顆粒細(xì)胞，在顯微鏡下觀察并計(jì)算各組卵母細(xì)胞成熟率（成熟卵母細(xì)胞個(gè)數(shù)/卵母細(xì)胞總數(shù)×100%），有第1極體排出為成熟卵母細(xì)胞。

2.4 小鼠體外受精率及卵裂率的計(jì)算 雄性小鼠處死后取出附睪及附睪尾，PBS清洗3次，剪成段，釋出精子于含10%胎牛血清的培養(yǎng)液中，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1～2 h使精子獲能。將培養(yǎng)24 h的各組OCCs用透明質(zhì)酸酶消化去除顆粒細(xì)胞，調(diào)整精子密度，按精卵約為10 000∶1的比例將精子加入含有卵母細(xì)胞的培養(yǎng)液中繼續(xù)孵育5 h。顯微鏡下觀察并計(jì)算卵母細(xì)胞的受精率（受精卵個(gè)數(shù)/成熟卵個(gè)數(shù)×100%），出現(xiàn)兩個(gè)原核的細(xì)胞為受精卵；24 h后計(jì)算卵裂率（卵裂球個(gè)數(shù)/受精卵數(shù)×100%）。

2.5 Western blot檢測(cè)PDGFA和PDGFRα蛋白的表達(dá) 每組收集20只KM小鼠的OCCs，培養(yǎng)24 h后去除顆粒細(xì)胞。各組卵母細(xì)胞于4℃、5 000 r/min離心5 min，棄上清，加入裂解液，超聲破碎細(xì)胞，提取總蛋白。采用10%的預(yù)制凝膠，140 V電泳，待溴酚藍(lán)至凝膠底部結(jié)束電泳；300 mA轉(zhuǎn)膜60 min，室溫封閉1.5 h；加入I抗［抗PDGFA（1∶500）和抗PDGFRα（1∶1 000）］4℃過夜；II抗（1∶5 000）室溫?fù)u床孵育1.5 h；配制ECL發(fā)光液，暗室中曝光2 min；用ImageJ軟件對(duì)目的條帶進(jìn)行灰度分析，以β-actin為內(nèi)參照進(jìn)行比對(duì)。

2.6 real-time PCR檢測(cè)PDGFA和PDGFRα的mRNA表達(dá)水平 每組收集6只小鼠的OCCs，培養(yǎng)24 h后去除顆粒細(xì)胞，每組卵母細(xì)胞加入Buffer RⅠ，用21號(hào)注射器反復(fù)抽吸10次，轉(zhuǎn)入1.5 mL離心管，然后加入Buffer RⅡ，渦漩振蕩，離心，取上清加入異丙醇，混勻。將上述液體移入離心柱內(nèi)芯，離心，棄濾液，加Buffer W1A，離心，棄濾液，加Buffer W2清洗2次，離心，棄濾液。將離心柱芯轉(zhuǎn)移到1.5 mL離心管，加入Buffer TE，室溫靜置1 min，離心洗脫得RNA。反應(yīng)條件為：逆轉(zhuǎn)錄42℃15 min，85℃2 min；預(yù)變性95℃ 30 s；擴(kuò)增95℃ 5 s，60℃ 30 s，共40個(gè)循環(huán)；熔解曲線95℃ 5 s，60℃ 1 min。以GAPDH為內(nèi)參照，統(tǒng)計(jì)分析PDGFA和PDGFRα的mRNA表達(dá)。引物信息見表1。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

用軟件SPSS17.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。率的比較用χ2檢驗(yàn)；蛋白和mRNA表達(dá)的數(shù)據(jù)表示為均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD），組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 real-time PCR實(shí)驗(yàn)的引物序列Table 1.The sequences of the primers for real-time PCR

結(jié) 果

1 養(yǎng)精種玉湯對(duì)小鼠卵母細(xì)胞體外成熟的影響

與空白組和空白血清組比較，養(yǎng)精種玉湯血清組小鼠卵母細(xì)胞成熟率顯著提高（P＜0.01）；與FSH組比較，養(yǎng)精種玉湯血清組卵母細(xì)胞成熟率的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性（P＞0.05），見圖1及表2。這說(shuō)明養(yǎng)精種玉湯能提高卵母細(xì)胞的體外成熟率。

Figure 1.Immature oocytes of each group were cultured in vitro for 24 h（×100）.圖1 各組未成熟卵母細(xì)胞體外培養(yǎng)24 h的形態(tài)變化

表2 養(yǎng)精種玉湯對(duì)小鼠卵母細(xì)胞體外成熟的影響Table 2.Effect of YZDon in vitro maturation of mouse oocytes

2 養(yǎng)精種玉湯對(duì)小鼠體外受精和受精卵發(fā)育的影響

與空白組比較，養(yǎng)精種玉湯血清組受精率明顯提高（P＜0.05）；與空白血清組比較，養(yǎng)精種玉湯血清組受精率的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性（P＞0.05），但受精率較空白血清組提高，見表3。這提示養(yǎng)精種玉湯能提高卵母細(xì)胞受精率。

3 養(yǎng)精種玉湯對(duì)PDGFA和PDGFRα蛋白表達(dá)的影響

表3 養(yǎng)精種玉湯血清對(duì)小鼠體外受精和受精卵發(fā)育的影響Table 3.The effect of YZDon in vitro fertilization and fertilized egg development in mice

Western blot結(jié)果顯示，與空白組和空白組血清組比較，養(yǎng)精種玉湯血清組PDGFA和PDGFRα蛋白的表達(dá)減少（P＜0.01），見圖2。

Figure 2.The protein expression of PDGFA and PDGFRα in the oocytes of each group.Mean±SD.n=3.**P＜0.01 vs blank group；##P＜0.01 vs blank serumgroup.圖2 各組卵母細(xì)胞中PDGFA和PDGFRα蛋白的表達(dá)

4 養(yǎng)精種玉湯對(duì)PDGFA和PDGFRαmRNA表達(dá)的影響

real-time PCR結(jié)果顯示，與空白組和空白血清組比較，養(yǎng)精種玉湯血清組PDGFA和PDGFRα的mRNA表達(dá)量減少（P＜0.01），見圖3。

Figure 3.The mRNA expression of PDGFA and PDGFRα in the oocytes of each group.Mean±SD.n=3.**P＜0.01 vs blank group；##P＜0.01 vs blank serumgroup.圖3 PDGFA和PDGFRα的mRNA在各組卵母細(xì)胞中表達(dá)的變化

討 論

養(yǎng)精種玉湯出自《傅青主女科》，由熟地、當(dāng)歸、白芍和山萸肉組成。功效平補(bǔ)肝腎，填精益血，本方所治之證因精血不足，肝腎陰虛，沖任失養(yǎng)而成，故立補(bǔ)血養(yǎng)精之法，精血充足，沖任得養(yǎng)而種子成孕［13］。中醫(yī)認(rèn)為：“腎藏精，腎為天癸之源，沖任之本，腎氣盛，沖任滿盈，天癸蓄極泌至，月事以時(shí)下，經(jīng)調(diào)而有子?！泵t(yī)羅元愷曾指出天癸是非肉眼所能見的元陰，溶于血中，與西醫(yī)的雌激素尤其相似。在血分雌激素的影響下，卵泡不斷發(fā)育，當(dāng)雌激素亦即“陰”的水平達(dá)到重陰時(shí)卵泡發(fā)育成熟，排出卵子，故“女精”即卵子。卵子之精在血分“陰”提高的前題下溢瀉，所以有“精血”同源和“精、陰、血”同源之說(shuō)。傅山所創(chuàng)養(yǎng)精種玉湯，說(shuō)明血中補(bǔ)陰，陰中養(yǎng)精，養(yǎng)精才能種玉的道理，同時(shí)又把血、陰、精聯(lián)系在一起，從中醫(yī)的腎-天癸-沖任這一生殖軸確立治療原則［14-15］。后歷經(jīng)無(wú)數(shù)醫(yī)家的反復(fù)臨床實(shí)踐及療效驗(yàn)證，現(xiàn)已成為治療不孕癥的基礎(chǔ)方［16］。

PDGF是機(jī)體內(nèi)一種重要的促分裂劑和趨化劑，能刺激機(jī)體內(nèi)各種類型的細(xì)胞分裂和增殖［17］。Nilsson等［18］提出PDGF由卵母細(xì)胞產(chǎn)生，其作用于周圍的顆粒和卵泡膜/間質(zhì)細(xì)胞以促進(jìn)原始卵泡發(fā)育。一些研究報(bào)道了哺乳動(dòng)物卵巢中PDGF及其受體存在于大鼠［11］、人類［19］和豬［10］等，這些實(shí)驗(yàn)研究以卵泡或卵巢為研究對(duì)象，利用免疫組化研究PDGF蛋白對(duì)卵泡發(fā)育的作用。但有研究者指出雖然卵泡中卵母細(xì)胞的免疫反應(yīng)性似乎非常特異，但尚不清楚在發(fā)育的后期階段卵泡中觀察到的卵母細(xì)胞染色是由于蛋白質(zhì)的存在，還是非特異性抗體結(jié)合導(dǎo)致的［11］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，養(yǎng)精種玉湯血清組較空白組卵母細(xì)胞成熟率明顯提高，且PDGFA和PDGFRα表達(dá)較空白組減少，表明養(yǎng)精種玉湯可以提高小鼠卵母細(xì)胞的體外成熟率，同時(shí)也證實(shí)了在卵泡發(fā)育的后期階段中觀察到的卵母細(xì)胞PDGFA和PDGFRα染色是由于其蛋白質(zhì)的存在。

PDGF作為重要的促有絲分裂原，通過與靶細(xì)胞膜上的α和β蛋白酪氨酸激酶受體結(jié)合，促使有絲分裂信號(hào)向胞內(nèi)傳遞，從而引起DNA合成、細(xì)胞分裂及增殖［17，20］。PDGF結(jié)合使PDGFRα二聚化，并激活受體的激酶活性，觸發(fā)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，包括Ras-MAPK、PI3K和PLCγ途徑，這些途徑都參與了卵母細(xì)胞的成熟過程。例如：PDGFR主要通過銜接蛋白Grb2和Shc連接到Ras-MAPK，Grb2通過其SH2結(jié)構(gòu)域結(jié)合激活的PDGFR，并通過其SH3結(jié)構(gòu)域復(fù)合Sos1激活Raf-1和MAPK級(jí)聯(lián)的下游，從而刺激細(xì)胞生長(zhǎng)［21］。此外，PDGF在培養(yǎng)細(xì)胞中的表達(dá)是動(dòng)態(tài)的［21］。Pascuali等［22］研究發(fā)現(xiàn)，青春期前（卵泡正處于發(fā)育階段）大鼠PDGF受體的抑制導(dǎo)致卵泡膜和顆粒細(xì)胞增殖減少，雌激素濃度降低，他們認(rèn)為局部抑制PDGF會(huì)增加卵巢細(xì)胞凋亡，從而發(fā)生大量卵泡閉鎖。有研究表明，PDGF家族成員的表達(dá)受激素調(diào)節(jié)，用雌激素治療未成熟小鼠24 h可降低卵巢PDGF及其受體的表達(dá)，且免疫組化結(jié)果顯示PDGFRs的免疫染色隨著卵泡發(fā)育至竇前期（卵母細(xì)胞成熟之前）而增強(qiáng)，但此后減弱［23］。上述研究表明，PDGF及其受體的蛋白表達(dá)在發(fā)育的卵母細(xì)胞中升高，而在卵母細(xì)胞成熟時(shí)表達(dá)下降。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示養(yǎng)精種玉湯血清組PDGFA和PDGFRα水平較空白組下降，說(shuō)明養(yǎng)精種玉湯可能通過下調(diào)PDGFA和PDGFRα的蛋白和mRNA表達(dá)來(lái)促進(jìn)小鼠卵母細(xì)胞的體外成熟。

本實(shí)驗(yàn)將養(yǎng)精種玉湯與輔助生殖相結(jié)合，豐富了“腎主生殖”的內(nèi)涵，有利于中醫(yī)藥在輔助生殖中的應(yīng)用與發(fā)展，為輔助生殖領(lǐng)域開辟新途徑。