王曉雯 晏振 陳夙 袁良杰 陳文芳

[摘要] 目的 探討胰島素樣生長因子-1（IGF-1）對6-羥基多巴胺（6-OHDA）誘導(dǎo)的人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞（SK-N-SH細(xì)胞）神經(jīng)毒性反應(yīng)的抑制作用。方法 將SK-N-SH細(xì)胞種于96孔板，首先用不同濃度的IGF-1（6.25、12.50、25.00、50.00 μg/L）預(yù)處理細(xì)胞24 h，然后與6-OHDA（100 μmol/L）共同孵育細(xì)胞24 h，采用MTT法檢測細(xì)胞活力。再將SK-N-SH細(xì)胞分為對照組（細(xì)胞不處理）、6-OHDA組（用100 μmol/L 6-OHDA處理細(xì)胞24 h）、6-OHDA+IGF-1組（細(xì)胞先用6.25 μg/L IGF-1預(yù)處理24 h，再與100 μmol/L 6-OHDA共同作用24 h），應(yīng)用Western blot方法檢測Bcl-2及Bax蛋白表達(dá)。結(jié)果 6.25～50.00 μg/L IGF-1均能夠明顯對抗6-OHDA誘導(dǎo)的神經(jīng)毒性作用，提高細(xì)胞的存活率（F=11.53，q=4.795～5.556，P<0.05）。與對照組相比較，6-OHDA組Bcl-2蛋白的表達(dá)水平明顯降低，而Bax蛋白的表達(dá)水平明顯升高，差異有顯著性（F=22.92、35.80，q=8.223、8.727，P<0.01）;6.25 μg/L IGF-1能夠明顯對抗6-OHDA誘導(dǎo)的Bcl-2蛋白表達(dá)的下調(diào)和Bax蛋白表達(dá)的上調(diào)（q=8.361、11.450，P<0.01）。結(jié)論 IGF-1可對抗神經(jīng)毒素6-OHDA誘導(dǎo)的SK-N-SH細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2及Bax的蛋白表達(dá)變化，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。

[關(guān)鍵詞] 胰島素樣生長因子1;細(xì)胞凋亡;帕金森病;神經(jīng)母細(xì)胞瘤

[中圖分類號] R742.5;R338 ?[文獻(xiàn)標(biāo)志碼] A ?[文章編號] 2096-5532（2020）02-0161-04

doi：10.11712/jms.2096-5532.2020.56.090 [開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識碼（OSID）]

[網(wǎng)絡(luò)出版] http：//kns.cnki.net/kcms/detail/37.1517.R.20200519.1433.007.html;2020-05-19 17：24

[ABSTRACT] Objective To investigate the inhibitory effect of insulin-like growth factor-1 （IGF-1） on the neurotoxic response of SK-N-SH human neuroblastoma cells induced by 6-hydroxydopamine （6-OHDA）. ?Methods SK-N-SH cells were ino-culated into 96-well plates and pretreated with different concentrations of IGF-1 （6.25，12.50，25.00， and 50.00 μg/L） for 24 h. After that， the cells were co-incubated with 6-OHDA （100 μmol/L） for another 24 h. MTT assay was performed to determine the cell viability. In order to explore the protective mechanisms of IGF-1 on dopaminergic neurons， SK-N-SH cells were divided into control group （cells were left untreated）， 6-OHDA group （cells were treated with 100 μmol/L 6-OHDA for 24 h）， and 6-OHDA+IGF-1 group （cells were pre-treated with 6.25 μg/L IGF-1 for 24 h and then co-incubated with 100 μmol/L 6-OHDA for 24 h）. Western blot was used to measure the expression of anti-apoptotic protein Bcl-2 and pro-apoptotic protein Bax in the SK-N-SH cells. Results Compared with the 6-OHDA group， 6.25-50.00 μg/L IGF-1 could significantly protect against the neurotoxic effects of 6-OHDA and improve the survival rate of SK-N-SH cells （F=11.53，q=4.795-5.556，P<0.05）. Compared with the control group， the 6-OHDA group had significantly down-regulated protein expression of Bcl-2 and significantly up-regulated protein expression of Bax （F=22.92，35.80;q=8.223，8.727;P<0.01）; 6.25 μg/L IGF-1 could significantly protect against 6-OHDA-induced down-regulation of Bcl-2 protein expression and up-regulation of Bax protein expression （q=8.361，11.450;P<0.01）. Conclusion IGF-1 can protect against the neurotoxin 6-OHDA-induced apoptosis-related Bcl-2 and Bax protein expression changes in SK-N-SH cells， and exert a neuroprotective effect.

[KEY WORDS] insulin-like growth factorⅠ; apoptosis; Parkinson disease; neuroblastoma

帕金森?。≒D）又名震顫麻痹，是一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病[1]。PD的主要臨床表現(xiàn)為運(yùn)動癥狀，如靜止性震顫、肌強(qiáng)直、運(yùn)動遲緩和姿勢不穩(wěn)等;其次為非運(yùn)動癥狀，比如嗅覺功能異常、睡眠異常、腸道功能障礙等[2]。PD的主要病理表現(xiàn)是中腦黑質(zhì)多巴胺（DA）能神經(jīng)元的漸進(jìn)性缺失，紋狀體投射神經(jīng)纖維的丟失以及嗜酸性包涵體路易小體（LBs）沉積[3-4]。導(dǎo)致PD病理改變的原因極其復(fù)雜，主要有環(huán)境因素、免疫炎癥反應(yīng)、遺傳因素、線粒體功能異常、自噬功能的紊亂等[5-7]。一些神經(jīng)毒素，如1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氫吡啶（MPTP）、6-羥基多巴胺（6-OHDA）、百草枯和魚藤酮等被用于PD模型的制備，這些藥物大多與增強(qiáng)細(xì)胞凋亡有關(guān)[8]。6-OHDA屬于DA與去甲腎上腺素類似物，其結(jié)構(gòu)與兒茶酚胺相似，有研究顯示其可以損毀神經(jīng)末梢，導(dǎo)致遞質(zhì)減少，被廣泛用于制備PD的細(xì)胞和動物模型[9]。胰島素樣生長因子-1（IGF-1）是一種含有70個氨基酸的多肽激素，其通過細(xì)胞膜表面的IGF-1受體（IGF-1R）發(fā)揮生物學(xué)作用[10]。IGF-1通過促進(jìn)不同類型細(xì)胞的存活和增殖在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育和成熟中起著關(guān)鍵作用[11-12]。已有研究顯示，血清IGF-1水平隨著年齡增加而降低，PD病人早期血清IGF-1水平升高，隨著病情的進(jìn)展，IGF-1水平明顯下降，提示其與PD的發(fā)病有關(guān)[13]。因此，探討IGF-1的神經(jīng)保護(hù)作用能夠?yàn)榉乐蜳D奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。本研究在前期研究的基礎(chǔ)上，采用分子生物學(xué)技術(shù)，探討IGF-1對6-OHDA誘導(dǎo)的人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞（SK-N-SH細(xì)胞）多巴胺能細(xì)胞損傷的作用。現(xiàn)將結(jié)果報告如下。

1 材料與方法

1.1 試劑及其來源

SK-N-SH細(xì)胞由中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫提供;IGF-1購自BioVision公司，用生理鹽水配制成1 g/L的溶液;DMEM購自Gibco公司;青霉素/鏈霉素儲存液購自新華制藥廠，分裝后，-20 ℃保存?zhèn)溆?胎牛血清購自Hyclone公司，分裝后，-40 ℃保存?zhèn)溆?二甲基亞砜（DMSO）購自Sigma公司;兔抗-Bcl-2抗體購自CST公司;兔抗-Bax抗體購自CST公司;6-OHDA由Sigma公司提供;BCA試劑盒由碧云天公司提供。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

將SK-N-SH細(xì)胞接種于25 cm2的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，加入含有體積分?jǐn)?shù)0.10胎牛血清、100 mg/L鏈霉素和100 kU/L青霉素的DMEM培養(yǎng)液，置于37 ℃含體積分?jǐn)?shù)0.05 CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中。當(dāng)細(xì)胞達(dá)到80%～90%融合時進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.3 MTT法檢測細(xì)胞活力

將SK-N-SH細(xì)胞接種于96孔板上，每孔加細(xì)胞懸浮液100 μL（含6×104個細(xì)胞），放置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至細(xì)胞達(dá)80%～90%融合時，開始加藥處理。先加入不同濃度的IGF-1（6.25、12.50、25.00、50.00 μg/L）預(yù)保護(hù)SK-N-SH細(xì)胞24 h，然后再與100 μmol/L 6-OHDA共同作用24 h。棄去培養(yǎng)液，每孔加入20 μL MTT溶液（5 g/L），繼續(xù)避光培養(yǎng)4 h。小心吸除多余MTT，每孔加100 μL 的DMSO，搖床80～90 r/min避光振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解。應(yīng)用酶標(biāo)儀（490 nm）檢測各孔的吸光度（A）值。細(xì)胞活力以實(shí)驗(yàn)組A值/對照組A值表示。

1.4 Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)檢測

應(yīng)用Western blot方法。將SK-N-SH細(xì)胞接種于96孔板中，分為對照組、損傷組、保護(hù)藥組。對照組細(xì)胞不處理;損傷組細(xì)胞應(yīng)用100 μmol/L的6-OHDA處理24 h;保護(hù)藥組細(xì)胞先用6.25 μg/L的IGF-1預(yù)保護(hù)24 h，再與100 μmol/L 6-OHDA共同作用24 h。棄去細(xì)胞培養(yǎng)液，每孔加入裂解液（lysis∶PMSF=99∶1）100 μL，冰上裂解30 min，然后用細(xì)胞刮輕輕刮下細(xì)胞，收集至1.5 mL的EP管中[14]。置于離心機(jī)中離心20 min （4 ℃，12 000 r/min），吸取80 μL上清，用BCA法檢測蛋白濃度。電泳30～40 min （80 V穩(wěn)壓），上樣量為15 μg;待蛋白Maker的不同分子量條帶分離開時，將電壓改為120 V，繼續(xù)電泳，根據(jù)所檢測蛋白分子量的大小來確定具體的電泳結(jié)束時間。然后，將膠和PVDF膜置于轉(zhuǎn)膜夾中進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，條件為300 mA、90 min。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后將PVDF膜使用50～100 g/L的脫脂奶粉封閉1 h，清洗掉殘留的奶粉加一抗，4 ℃搖床過夜后洗膜3次，每次10 min;二抗孵育1～2 h后洗膜3次，每次10 min，以發(fā)光液顯影。檢測Bcl-2、Bax與β-actin蛋白A值，以Bcl-2、Bax與β-actin的A值比值表示蛋白表達(dá)[15]。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理

應(yīng)用Graph Pad Prism 5.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計量資料結(jié)果以±s表示，數(shù)據(jù)間比較用單因素方差分析（One-Way ANOVA），并繼以Tukey法進(jìn)行兩兩比較。P<0.05表示差異有顯著性。

2 結(jié) ?果

2.1 不同濃度IGF-1對6-OHDA誘導(dǎo)SK-N-SH細(xì)胞活力影響

與對照組（A組）相比，6-OHDA組（B組）的細(xì)胞活力明顯降低 （F=11.53，q=5.967，P<0.05）;6.25 μg/L（C組）、12.50 μg/L（D組）、25.00 μg/L（E組）和50.00 μg/L（F組） IGF-1均可對抗6-OHDA的神經(jīng)毒性作用，提高SK-N-SH細(xì)胞的活力（q=4.857～5.556，P<0.05）。見表1。

2.2 IGF-1對6-OHDA誘導(dǎo)SK-N-SH細(xì)胞Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)的影響

與對照組（A組）相比較，6-OHDA組（B組）SK-N-SH細(xì)胞Bcl-2蛋白表達(dá)水平明顯降低（F=22.92，q=8.223，P<0.01），Bax蛋白表達(dá)明顯升高（F=35.80，q=8.727，P<0.01）;與6-OHDA組（B組）相比，IGF-1+6-OHDA組（C組）Bcl-2蛋白的表達(dá)明顯上升（q=8.361，P<0.01），Bax蛋白表達(dá)明顯下降（q=11.45，P<0.001）。見表2。

3 討 ?論

PD是一種遲發(fā)性、進(jìn)行性、神經(jīng)退行性的運(yùn)動障礙疾病，占65歲及以上人口的1%[16-17]，隨著中國人口老齡化狀況的日益加劇，PD的發(fā)病率也逐年增高，造成的家庭和社會負(fù)擔(dān)也日益嚴(yán)重[18]。目前，PD病人尚無有效的治療方法，開發(fā)研制有效防治PD的藥物迫在眉睫。6-OHDA是目前常用的建立PD模型的神經(jīng)毒素，能夠引起DA能神經(jīng)元的大量變性死亡，繼而導(dǎo)致錐體外系運(yùn)動功能障礙，如震顫、強(qiáng)直、運(yùn)動過緩等表現(xiàn)[19]。

IGF-1是一種天然存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的強(qiáng)效神經(jīng)營養(yǎng)和抗凋亡因子，可以促進(jìn)不同類型細(xì)胞的發(fā)育分化[20-22]。IGF-1主要是通過IGF-1R信號通路，促進(jìn)細(xì)胞的生長、分化和存活，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。有研究顯示，IGF-1R在腦組織內(nèi)廣泛表達(dá)，其中在黑質(zhì)幾乎所有的DA能神經(jīng)元以及多數(shù)的膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)均存在[23]。許多研究表明，人體內(nèi)IGF-1水平與年齡相關(guān)，幼兒期含量相對較低，成年后達(dá)到高峰，之后隨著年齡的增加逐漸降低[24]。臨床研究發(fā)現(xiàn)，PD早期病人血清中IGF-1的水平升高，隨著病情的進(jìn)展IGF-1的水平逐漸下降。在認(rèn)知障礙病人中，IGF-1水平亦明顯降低[25-26]。

AYADI等[27]的研究顯示，IGF-1能夠通過激活下游的Ras/ERK1/2和PI3K/Akt信號通路，對抗6-OHDA對大鼠黑質(zhì)紋狀體系統(tǒng)DA能神經(jīng)元的損傷。在氧葡萄糖剝奪/再灌注SH-SY5Y神經(jīng)細(xì)胞模型中，miR-186-5p可通過降低IGF-1的表達(dá)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[28]。離體細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證明IGF-1通過抗凋亡和抗氧化應(yīng)激發(fā)揮神經(jīng)元保護(hù)功能[29-30]。本研究應(yīng)用6-OHDA損傷SK-N-SH細(xì)胞，制備PD細(xì)胞模型，探究IGF-1的神經(jīng)保護(hù)作用及其可能機(jī)制。MTT結(jié)果顯示，6-OHDA明顯損傷了SK-N-SH細(xì)胞，而IGF-1能夠明顯對抗6-OHDA的這種神經(jīng)毒性作用。為了進(jìn)一步探討IGF-1的保護(hù)作用及其機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用Western blot技術(shù)，檢測了凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2及Bax蛋白表達(dá)情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對照組相比，6-OHDA組抗凋亡蛋白Bcl-2蛋白的表達(dá)明顯降低，促凋亡蛋白Bax蛋白的表達(dá)顯著升高;而給予IGF-1預(yù)處理細(xì)胞后，Bcl-2蛋白表達(dá)明顯上調(diào)，而Bax蛋白的表達(dá)明顯下調(diào)。表明IGF-1神經(jīng)元保護(hù)功能與抑制6-OHDA誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡有關(guān)。

綜上所述，IGF-1可對抗神經(jīng)毒素6-OHDA誘導(dǎo)的SK-N-SH細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2及Bax蛋白表達(dá)變化，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。

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（本文編輯 黃建鄉(xiāng)）