張國麗 謝宗銘 馮自力 李全勝 朱荷琴 呂寧 孫國清

摘要 為明確新疆不同地區(qū)造成棉花萎蔫，維管束變褐的病原菌種類及其發(fā)生現(xiàn)狀，本研究對新疆47個(gè)主要植棉區(qū)有萎蔫癥狀且維管束變褐的棉花病株進(jìn)行了分離鑒定，并對其快速分離鑒定方法進(jìn)行了改進(jìn)。結(jié)果表明：南疆20個(gè)地點(diǎn)，得到358個(gè)純化菌株，黃萎病菌占81.8%，枯萎病菌占18.2%;北疆27個(gè)地點(diǎn)，得到495個(gè)純化菌株，黃萎病菌占93.9%，枯萎病菌占6.1%。南北疆均以黃萎病為主，枯萎病南疆重于北疆。維管束病害的快速分離方法每分離一個(gè)樣品只需2 min，污染率僅為6.7%。

關(guān)鍵詞 棉花; 黃萎病; 枯萎病; 快速分離鑒定方法

中圖分類號： S 435.621.2

文獻(xiàn)標(biāo)識碼： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2019092

Occurrence of cotton Fusarium and Verticillium wilt in Xinjiang and the rapid isolation method

ZHANG Guoli1， XIE Zongming1， FENG Zili2， LI Quansheng1， ZHU Heqin2， L Ning1， SUN Guoqing1，3

（1. Xinjiang Production & Construction Group Key Laboratory of Crop Germplasm Enhancement and

Gene Resources Utilization， Biotechnology Research Institute， Xinjiang Academy of Agricultural and

Reclamation Sciences， Shihezi 832003， China; 2. State Key Laboratory of Cotton Biology， Institute of

Cotton Research， Chinese Academy of Agricultural Sciences， Anyang 455000， China; 3. Biotechnology

Research Institute， Chinese Academy of Agricultural Sciences， Beijing 100081， China）

Abstract

In order to identify the species and the occurrence of the pathogen which cause cotton wilting and vascular browning， cotton wilting and vascular browning plants collected from 47 main cotton planting areas in Xinjiang were separated and identified. And the isolation method was also improved. The result showed that 358 purified strains were obtained from 20 sites in South Xinjiang， Verticillium dahliae accounting for 81.8%， and Fusarium oxysporum for 18.2%. 495 were obtained from 27 sites in Northern Xinjiang， V.dahliae accounting for 93.9%， and F.oxysporum for 6.1%. Fusarium wilt in South is more serious than that in North Xinjiang. The improved isolation method only needed 2 min and its contamination rate was only 6.7%.

Key words

cotton; Verticillium wilt; Fusarium wilt; rapid isolation method

新疆是我國最大的優(yōu)質(zhì)棉生產(chǎn)基地，近年來由于高密度栽培、寬膜覆蓋、膜下滴灌等新技術(shù)的應(yīng)用，使得棉花單產(chǎn)、品質(zhì)等得到大幅度提高，但各種病蟲害也逐漸加重，特別是土傳病害枯、黃萎病危害尤為明顯。

棉花枯萎病病原菌為尖鐮孢萎蔫?；訤usarium oxysporum f. sp. vaxinfectum （Atk.） Synder and Hansen，屬半知菌亞門鐮孢屬，該病原菌分布于土壤層60 cm以上且在土壤中可存活6～7年。病菌在浸水條件下容易死亡[12]。該病最早于1891年在美國發(fā)現(xiàn)[3]，20世紀(jì)70-80年代初期，隨棉種的大量調(diào)運(yùn)，該病遍布于全國各主要產(chǎn)棉區(qū)，每年因此病損失皮棉約200萬擔(dān)[2]。20世紀(jì)80年代中后期，抗病品種開始大量推廣，該病在我國主要產(chǎn)棉區(qū)得到了控制，但長絨棉枯萎病仍然很嚴(yán)重。陸地棉枯萎病也時(shí)有發(fā)生，且個(gè)別地塊特別嚴(yán)重，仍是棉花生產(chǎn)上一個(gè)重要的問題[4]。

棉花黃萎病是由大麗輪枝菌Verticillium dahliae Kleb.引起的土傳維管束病害，可嚴(yán)重影響棉花的品質(zhì)和產(chǎn)量，是制約新疆棉花生產(chǎn)的主要障礙之一，發(fā)生嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致減產(chǎn)80%[5]。該病原菌可侵染200余種經(jīng)濟(jì)作物，是世界性的重大植物病害[67]。大麗輪枝菌的微菌核抵抗不良環(huán)境能力強(qiáng)，可以在沒有寄主的條件下存活十幾年之久[8]，在0～20 cm的土壤中成聚集或均勻分布[9]。棉田中的黃萎病菌是一個(gè)混合基因型群體[10]，易于變異，防治困難。在生產(chǎn)上，抗黃萎病育種工作的進(jìn)展與棉花生產(chǎn)的要求還有很大的差距[11]。棉花枯萎病和黃萎病都屬于土傳維管束病害，都可產(chǎn)生萎蔫癥狀，有的同株混發(fā)，難以區(qū)分。因此，明確新疆棉花維管束病害發(fā)生的現(xiàn)狀，以及新疆棉花上致病菌的類型對于棉花病害防治具有非常重要的意義。

維管束病害分離采用常規(guī)組織分離法，該方法耗時(shí)費(fèi)力，因此本研究對其分離方法進(jìn)行了改進(jìn)，加速了病原菌分離的速度，為棉花枯、黃萎病后期深入系統(tǒng)研究奠定堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 樣品采集

本課題組于2016年-2017年5月至10月從新疆主要植棉區(qū)（包括新疆維吾爾自治區(qū)和新疆建設(shè)兵團(tuán)）采集有萎蔫癥狀的棉花病株，每個(gè)地塊10～20株并觀察記錄植株發(fā)病癥狀。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 常規(guī)組織分離法和改進(jìn)方法比較

本試驗(yàn)對維管束病害的分離方法進(jìn)行了改進(jìn)，并比較改進(jìn)和常規(guī)組織分離方法的優(yōu)缺點(diǎn)，每種方法檢測樣品都為30株有萎蔫癥狀的棉花植株，樣品采自145團(tuán)多年連作的棉花重病田。

常規(guī)組織分離方法：以5%次氯酸鈉作為消毒劑。（1）用修枝剪將棉稈剪成10 cm左右的小段，用75%酒精棉擦拭干凈;（2）在盛有75%乙醇的培養(yǎng)皿中浸泡5 min，然后5%次氯酸鈉消毒5 min，75%乙醇再浸泡5 min，無菌水沖洗4遍，滅菌濾紙吸干殘余液體，將棉稈剪成0.5 cm左右的小段于滅菌培養(yǎng)皿中，然后用滅菌鑷子將小段插在PDA平板上，每平板5個(gè)，為防止交叉污染，每分離1個(gè)樣品，需要換1套器皿;（3）待培養(yǎng)基上的小段棉稈長出菌絲時(shí)，用接種環(huán)刮取少量菌絲于放有200 μL無菌水的離心管中，振蕩搖勻，制成孢子和菌絲懸浮液，用滅菌的接種環(huán)蘸取懸浮液在新的PDA平板上劃線，于26℃黑暗培養(yǎng)2～3 d;（4）用接種針挑取單菌落接到新的PDA培養(yǎng)基中央，26℃黑暗培養(yǎng)15 d，病原菌長至直徑為6 cm的菌落，為純化菌株。

改進(jìn)方法：（1）用滅菌的修枝剪將兩節(jié)果枝之間表皮無損傷的棉稈截成10 cm的小段;（2）以下操作在無菌操作臺中進(jìn)行：用75%酒精棉擦棉稈兩次，然后捏住棉稈一段，將棉稈剝皮，剝皮時(shí)注意不要碰觸已經(jīng)剝皮部分，用滅菌的修枝剪減去頭端，然后將剩余剝皮部分剪成0.5 cm左右的小段于滅菌培養(yǎng)皿中，用滅菌鑷子將小段棉稈部分埋進(jìn)培養(yǎng)基，每皿放5個(gè)小段，26℃黑暗培養(yǎng)3～4 d，之后步驟同1.2中的（2）和（3）。

1.2.2 新疆不同地區(qū)棉花病株的分離鑒定

采用1.2.1中的改進(jìn)方法對新疆不同地區(qū)的棉花病株進(jìn)行分離鑒定。

1.3 數(shù)據(jù)處理

利用Excel 2007進(jìn)行數(shù)據(jù)處理分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 棉花枯、黃萎病田間主要癥狀

棉花枯萎病主要出現(xiàn)在苗期，癥狀與環(huán)境條件有一定關(guān)系。新疆早春氣溫較低，較易出現(xiàn)紫紅型，葉片變紫紅色或呈紫紅色的斑塊，以后逐漸萎蔫、枯死、脫落（圖1 a）;黃色網(wǎng)紋型子葉或真葉的葉脈局部或全部褪綠，葉肉仍保持綠色，隨后逐漸枯死脫落（圖1 b）;矮縮型植株矮化，節(jié)間縮短，頂葉發(fā)生皺縮、畸形（圖1 b、c）;黃化型多從葉尖或葉緣開始，局部或全部褪綠變黃，也伴有矮縮現(xiàn)象，隨后逐漸變褐枯死或脫落（圖1 c、d）。不同癥狀類型有時(shí)同時(shí)出現(xiàn)，例如黃色網(wǎng)紋型和矮縮型，黃化型和矮縮型等。剖稈檢查，維管束有變褐現(xiàn)象。

棉花黃萎?。禾镩g表現(xiàn)最多的為普通型，感病初期葉片葉肉失綠，黃綠相間斑駁成塊，葉片挺而不萎;當(dāng)病害進(jìn)一步發(fā)展，葉肉間出現(xiàn)不規(guī)則嵌狀病斑，主脈仍保持綠色，病葉向上蜷曲，呈掌狀斑駁（“花西瓜皮”狀）（圖2 a），嚴(yán)重時(shí)葉片焦枯（圖2 b）。棉花黃萎病在田間的癥狀有時(shí)表現(xiàn)為多數(shù)或全株葉片萎蔫下垂，夏季暴雨過后也會(huì)出現(xiàn)急性青萎（圖2 c），病葉似開水燙傷狀萎蔫，后轉(zhuǎn)為褐色枯死，葉片向上蜷曲呈勺狀，很快脫落呈光稈（圖2 d）。剖稈檢查時(shí)，維管束都有變褐現(xiàn)象。

2.2 新疆棉花枯、黃萎病菌的發(fā)生情況

2016-2017年每年5月至9月，我們對新疆主要植棉區(qū)的陸地棉有萎蔫癥狀的病株進(jìn)行分離鑒定，涉及47個(gè)植棉縣市、團(tuán)場。分離結(jié)果表明，陸地棉主要是黃萎病，但枯萎病也時(shí)有發(fā)生，個(gè)別地塊還特別嚴(yán)重。在分離鑒定的911株棉花病株中，853個(gè)樣品都得到了純化病原菌株，占總樣品的93.6%?？菸【技兓甑?1.1%，黃萎病菌占88.9%。南疆涉及20個(gè)地點(diǎn)，共檢測了391株病株，得到358個(gè)純化菌株，枯萎病菌占18.2%，黃萎病菌占81.8%;北疆涉及27個(gè)地點(diǎn)，共檢測了520株病株，得到495個(gè)純化菌株，枯萎病菌占6.1%，黃萎病菌占93.9%。從達(dá)勒特鎮(zhèn)（博爾塔拉蒙古自治州棉花抗病品種選育基地，連續(xù)種植棉花30年）和145團(tuán)（新疆惠遠(yuǎn)種業(yè)病圃地）采集的樣品中都可以分離出枯萎病菌和黃萎病菌，說明這兩個(gè)天然病圃均為枯、黃萎病混發(fā)。達(dá)勒特鎮(zhèn)病圃分離的枯萎病菌占20.0%，黃萎病菌占80.0%;145團(tuán)惠遠(yuǎn)病圃地分離的枯萎病菌占30.0%，黃萎病占70.0%。南疆枯萎病發(fā)生要比北疆重，且有明顯的地域特征，主要集中于農(nóng)二師29團(tuán)、30團(tuán)和31團(tuán)，所檢測的病株均為枯萎病，占南疆枯萎病總檢測株數(shù)的76.9%;農(nóng)一師11團(tuán)和12團(tuán)枯萎病分別占檢測菌株的50.0%和25.0%。具體分離情況見表1。北疆枯萎病零星發(fā)生，主要為黃萎病。

2.3 棉花枯、黃萎病改進(jìn)分離方法與常規(guī)組織分離方法比較

針對枯、黃萎病菌維管束病害分離鑒定速度慢、消毒步驟繁瑣、易污染等問題，本試驗(yàn)改進(jìn)了分離方法。改進(jìn)方法每分離一個(gè)樣品只需2 min，30株病株經(jīng)分離純化后，除2個(gè)皿有雜菌污染外，其余均無污染，污染率6.7%，得到28個(gè)純化菌株，占93.3%（圖3 a），實(shí)際應(yīng)用中的純化率為93.6%（表1），說明該方法準(zhǔn)確可靠，實(shí)用性強(qiáng)。常規(guī)組織分離方法每分離一個(gè)樣品需要15～20 min，分離的30株病株中，21個(gè)皿有其他雜菌污染，污染率70.0%，9個(gè)無其他雜菌污染，占30.0%。單孢純化的菌株有12株，占40.0%（圖3 b）;為防止交叉污染，消毒處理時(shí)每個(gè)樣品都要用單獨(dú)的滅菌容器進(jìn)行滅菌、無菌水沖洗，無菌濾紙吸干殘留的液體，每個(gè)樣品至少需要8個(gè)器皿，而改進(jìn)方法只需要一個(gè);改進(jìn)方法所需時(shí)間為常規(guī)組織分離方法的1/10，純化率卻比常規(guī)組織分離方法高53.3百分點(diǎn)，提高了1倍以上。

3 討論

3.1 新疆棉花枯、黃萎病發(fā)生情況

棉花枯萎病一般在苗期或現(xiàn)蕾期出現(xiàn)發(fā)病高峰，現(xiàn)蕾期是植株抗病性發(fā)生的轉(zhuǎn)折點(diǎn)，前期抗病性較弱，后期抗病性增強(qiáng)[12]。南疆棉花調(diào)查時(shí)間集中于7月中旬，此時(shí)個(gè)別條田枯萎病仍然發(fā)生嚴(yán)重。從調(diào)查結(jié)果可以看出，陸地棉枯萎病主要發(fā)生于南疆地區(qū)，與繆衛(wèi)國和田逢秀報(bào)道的結(jié)果一致[13]?？菸“l(fā)生具有明顯的地域特征，主要集中于農(nóng)二師的29團(tuán)、30團(tuán)和31團(tuán)，農(nóng)一師11團(tuán)和12團(tuán)也有發(fā)生。1997年以后隨著陸地棉抗病品種的引進(jìn)和本地高抗枯萎病品種的育成，陸地棉的枯萎病基本得到控制[4]，但仍然有零星發(fā)生，個(gè)別條田發(fā)生嚴(yán)重。因此，病原菌可能仍然存活于條田中或種子帶菌。隨著連年耕作，棉花品種的更換，氣候條件的變化，選擇壓力的增加，病原菌本身發(fā)生變異或生理小種優(yōu)勢群體的變化，使得個(gè)別條田枯萎病發(fā)生嚴(yán)重，該問題仍然值得注意。

石河子地區(qū)2008年棉花黃萎病發(fā)病面積30%以上，比2001年增加了857.8%[14]。劉海洋等[15]對新疆主要棉區(qū)黃萎病進(jìn)行了調(diào)查，在調(diào)查的79塊棉田中，有黃萎病發(fā)生的病田占比為87.3%，其中棉花黃萎病發(fā)生程度為中度以上病田占比為48.1%，嚴(yán)重發(fā)生病田占到24.1%，甚至部分調(diào)查棉田棉花黃萎病發(fā)病率高達(dá)80%（143團(tuán)）。本研究在檢測的911株萎蔫病株中，黃萎病菌占到88.9%，北疆地區(qū)更是占到了93.9%，棉花黃萎病仍然是陸地棉上的主要病害，這些病原菌株的致病力、變異情況等還有待進(jìn)一步研究。

從達(dá)勒特鎮(zhèn)病圃地（博爾塔拉蒙古自治州棉花抗病品種選育基地，連續(xù)種植棉花30年）和145團(tuán)（新疆惠遠(yuǎn)種業(yè)病圃地）采集的樣品中都可以分離出枯萎病菌和黃萎病菌。因此，自然條件下的病圃一般為枯、黃萎病混發(fā)，但人工病圃也不能完全排除混發(fā)的可能。在鑒定一個(gè)品種的抗性時(shí)，對枯、黃萎病都達(dá)到耐或抗的條件，才能評價(jià)這個(gè)品種是耐病或抗病品種。雖然這樣選擇出來的品種對兩種病害都達(dá)到了耐或抗，更接近育種家和種植者的目的，但這種情況可能會(huì)淘汰一些高抗或耐一種病害的品種，造成種質(zhì)資源的流失。

3.2 棉花枯、黃萎病菌分離方法

棉花苗期主要病害為枯萎病，在棉花現(xiàn)蕾后，棉花發(fā)生的枯、黃萎病就難以區(qū)分，給調(diào)查的準(zhǔn)確性帶來了一定的挑戰(zhàn)，研究人員在調(diào)查時(shí)因受試驗(yàn)條件及人力限制，基本混在一起調(diào)查。本試驗(yàn)通過改進(jìn)組織分離鑒定方法，極大地縮短了病菌分離時(shí)間，同時(shí)也減少了繁瑣的步驟，分離純化率非常高，可快速分離鑒定兩種病原菌。但改進(jìn)方法必須是新鮮樣品，若不能及時(shí)分離可在4℃存放3～4 d。因該方法簡單易操作，采樣路途遙遠(yuǎn)時(shí)也可在簡單的酒精燈火焰無菌環(huán)境周圍隨時(shí)對病株進(jìn)行分離。

常規(guī)組織分離方法[1618]耗時(shí)費(fèi)力，有時(shí)還需要流水沖洗30 min以上。消毒時(shí)需無菌器皿繁多，容易混亂。消毒處理后無菌水沖洗，殘留液體需要滅菌濾紙吸干，否則影響病原菌的生長。升汞有劇毒，雙氧水或次氯酸鈉等也都有腐蝕性，因此操作要十分謹(jǐn)慎。但常規(guī)組織分離方法可以分離晾干的樣品，不能及時(shí)分離時(shí)可將樣品在通風(fēng)處晾干（避免暴曬或不透氣），保存，后期需要時(shí)再做分離。因此，如果需要大量采集樣品做研究時(shí)，兩種方法可結(jié)合使用，提高工作效率，加快研究速度。

本試驗(yàn)采用改進(jìn)方法分離維管束病害時(shí)，采用的新鮮樣品，選取表皮沒有破損的地方，只用乙醇對表面進(jìn)行了簡單處理，對維管束沒有做任何消毒處理，分離的病原菌純度非常高，很少有其他細(xì)菌或真菌污染，說明維管束中內(nèi)生菌是非常少的。常規(guī)組織分離方法采用的也是新鮮樣品，但沒有做去皮處理，分離的樣品純度都比較低。一是可能消毒不夠徹底，表皮一些頑固性微生物仍有存活，或在分離過程中造成了污染。因此采用常規(guī)組織分離方法時(shí)一定要及時(shí)更換消毒和沖洗器皿;二是可能木本類植物內(nèi)生菌主要存在表皮組織中，維管束中非常少。因此在研究木本類植物內(nèi)生菌時(shí)，可根據(jù)需要，選擇合適的部位進(jìn)行分離。此外，可能因?yàn)榫S管束中內(nèi)生菌非常少，病原菌侵入之后沒有競爭壓力，沒有與之相拮抗的微生物，加之品種抗病性弱時(shí)，一旦侵染成功對植物來說就是毀滅性的，這可能也是棉花黃萎病難以防治的原因之一。

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（責(zé)任編輯：楊明麗）

收稿日期： 20190228?? 修訂日期： 20190528

基金項(xiàng)目：棉花生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放課題（CB2018A14）;新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)重點(diǎn)領(lǐng)域創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)建設(shè)計(jì)劃（2019CB008）;新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技攻關(guān)（2015AC008）

致? 謝： 參加本試驗(yàn)部分工作的還有江代禮、譚翰杰、張能和紀(jì)燁斌等同學(xué)，特此一并致謝。

通信作者E-mail：sunguoqing02@caas.cn

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