莊翔麟 吉帥帥 趙昱杰 尹寧娜 劉乃勇

摘要 基于已發(fā)表的滅字脊虎天牛Xylotrechus quadripes的觸角轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，采用BLAST同源搜索的方法從轉(zhuǎn)錄組中一共鑒定到14個(gè)CSP基因，所有CSP均具有全長(zhǎng)序列、信號(hào)肽序列和4個(gè)保守的半胱氨酸。序列比對(duì)結(jié)果表明，滅字脊虎天牛CSP間氨基酸一致性差異較大（12%～73%），平均值為34%;具有C1-X6-C2-X18-C3-X2-C4的半胱氨酸保守模式。進(jìn)化分析表明，除XquaCSP8和XquaCSP12外，其余XquaCSPs聚類到不同分支。表達(dá)譜分析表明，XquaCSP7基因在觸角特異表達(dá);XquaCSP4、CSP5、CSP12和CSP14基因在觸角高表達(dá);XquaCSP13基因在足特異表達(dá);其余XquaCSPs基因在多個(gè)組織中有表達(dá)。結(jié)合測(cè)定結(jié)果發(fā)現(xiàn)，XquaCSP7與測(cè)試的21種寄主氣味結(jié)合能力均較弱，熒光取代率在4.5%～13.5%之間，其中與苯乙酮的結(jié)合能力最強(qiáng)，熒光取代率為13.5%。研究結(jié)果可為后續(xù)滅字脊虎天牛CSP基因的功能研究奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞 滅字脊虎天牛; 化學(xué)感受蛋白; 基因鑒定; 表達(dá)譜; 熒光競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合測(cè)定

中圖分類號(hào)： S 433.5

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2019123

Identification and expression pattern of chemosensory protein genes

from Xylotrechus quadripes Chevrolat （Coleoptera： Cerambycidae） and

functional studies of XquaCSP7 gene

ZHUANG Xianglin1， JI Shuaishuai1，2， ZHAO Yujie1， YIN Ningna1， LIU Naiyong1

（1. Key Laboratory of Forest Disaster Warning and Control of Yunnan Province， Southwest Forestry University， Kunming

650224， China; 2. Deyang Administration Branch of Giant Panda National Park， Deyang 618000， China）

Abstract

In this study， we identified 14 chemosensory protein genes from the antennal transcriptome of Xylotrechus quadripes by using a BLAST homology-based approach. All identified XquaCSPs had full-length sequences with signal peptides and four conserved cysteines. Sequence alignment results showed a varied amino acid identities with a range of 12%-73% （mean： 34%） among XquaCSPs. A conserved cysteine pattern of C1-X6-C2-X18-C3-X2-C4 was presented among XquaCSPs. Phylogenetic analysis indicated that XquaCSP8 and XquaCSP12 were grouped into a small clade and others were classified into different clades. Expression pattern analysis revealed that XquaCSP7 showed an antennae-specific expression， while XquaCSP4， CSP5， CSP12 and CSP14 were highly expressed in the antennae; XquaCSP13 expression was limited to legs. The remaining XquaCSP genes had a broad expression in various tissues. Binding assays showed that XquaCSP7 exhibited weak binding affinities to 21 odorants derived from host plants， with a range of fluorescent displacements of 4.5%-13.5%. Among these， acetophenone was the best ligand with a fluorescent displacement of 13.5%. The results laid a foundation for future functional studies of XquaCSP genes in this species.

Key words

Xylotrechus quadripes; chemosensory protein; gene identification; expression pattern; fluorescence competitive binding assay

云南省是我國(guó)小?？Х菴offea arabica Linn.的主產(chǎn)區(qū)，種植面積和產(chǎn)量均居全國(guó)之首[1]。長(zhǎng)期以來，滅字脊虎天牛Xylotrechus quadripes嚴(yán)重威脅和制約云南省小粒咖啡產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，有學(xué)者對(duì)定植5年的小?？Х日{(diào)查發(fā)現(xiàn)滅字脊虎天牛為害率高達(dá)80.6%[2]。該蟲隸屬于鞘翅目Coleoptera，天牛科Cerambycidae，天牛亞科Cerambycinae，主要以幼蟲蛀食小粒咖啡樹干，為害較為隱蔽，目前主要采取人工捕殺幼蟲、成蟲和噴灑化學(xué)農(nóng)藥等方法進(jìn)行防治，成本高昂且防治效果不理想，亟待研發(fā)新型的綠色防治技術(shù)[3]。

觸角是天牛等昆蟲的重要嗅覺感受器官，其表面著生有不同類型的感器，感器內(nèi)部的淋巴液中有兩種參與識(shí)別和運(yùn)輸氣味分子的嗅覺蛋白：氣味結(jié)合蛋白（odorant binding proteins，OBPs）和化學(xué)感受蛋白（chemosensory proteins，CSPs）[46]。昆蟲CSP是一類小分子可溶性蛋白，分子質(zhì)量約為15～17 kDa，一般多肽鏈全長(zhǎng)100～120個(gè)氨基酸，具有4個(gè)保守的半胱氨酸殘基（cysteine，Cys），能夠形成兩對(duì)二硫鍵，起穩(wěn)定蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)的作用[5，78]。1994年，在黑腹果蠅Drosophila melanogaster觸角中分別發(fā)現(xiàn)OS-D（olfactory specific-D）和A-10兩個(gè)CSP基因，這也是在昆蟲觸角中最早發(fā)現(xiàn)的CSP基因[910]。近年來，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展以及轉(zhuǎn)錄組和基因組測(cè)序技術(shù)的不斷更新，大量昆蟲的CSP基因已被鑒定，如在鞘翅目昆蟲云斑天牛Batocera horsfieldi[11]、紅脂大小蠹Dendroctonus valens[12]、松褐天牛Monochamus alternatus[13]、光肩星天牛Anoplophora glabripennis[14]、星天牛A.chinensis[15]和赤擬谷盜Tribolium castaneum[16]中分別鑒定到3、6、12、12、16和20個(gè)CSP基因;在非鞘翅目昆蟲家蠶Bombyx mori[8，17]、棉鈴蟲Helicoverpa armigera[18]、黑腹果蠅和意大利蜜蜂Apis mellifera[8]中分別鑒定到22、29、4和6個(gè)CSP基因。另外，研究發(fā)現(xiàn)昆蟲的CSP基因在觸角、頭、胸、腹、足、翅、下唇須等多個(gè)組織中均有表達(dá)，說明其功能具有多樣性[6，1417，19]。目前，一般認(rèn)為昆蟲的CSP具有嗅覺感受、運(yùn)輸氣味分子、發(fā)育和免疫調(diào)節(jié)等功能[2021]，如日本弓背蟻Camponotus japonicus的CjapCSP能夠特異性識(shí)別非同種巢穴螞蟻表皮的烴類物質(zhì)[22];2007年，Maleszka等人利用RNAi技術(shù)證明意大利蜜蜂的AmelCSP5基因參與了胚胎覆蓋膜的形成[23]。

在昆蟲體外，熒光競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合測(cè)定技術(shù)被廣泛用于研究CSP和氣味分子的結(jié)合能力，如華山松大小蠹Dendroctonus armandi的DarmCSP2與月桂烯和3-蒈烯具有較強(qiáng)的結(jié)合能力[24]。苜蓿盲蝽Adelphocoris lineolatus的AlinCSP1-3與順-3-己烯-1-醇、2-己烯醛和戊二醛具有較強(qiáng)的結(jié)合能力[25]。據(jù)此研究CSP與氣味分子（植物揮發(fā)物和性信息素）的結(jié)合能力，結(jié)合電生理測(cè)定、室內(nèi)行為學(xué)研究和田間誘捕試驗(yàn)，在篩選到害蟲防治潛在分子靶標(biāo)的同時(shí)，還可進(jìn)一步研發(fā)基于植物揮發(fā)物或性信息素的行為引誘劑或驅(qū)避劑。

國(guó)內(nèi)外學(xué)者在滅字脊虎天牛的蟲情調(diào)查、種群動(dòng)態(tài)和發(fā)生規(guī)律等方面已做了大量的研究[23，2628]，但是在分子生物學(xué)尤其是嗅覺方面的研究較少。先前，我們采用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序、生物信息學(xué)和分子生物學(xué)等技術(shù)研究了滅字脊虎天牛的5類化感基因家族：OBPs、氣味受體（odorant receptors，ORs）、味覺受體（gustatory receptors，GRs）、離子型受體（ionotropic receptors，IRs）和化學(xué)感受神經(jīng)元膜蛋白（sensory neuron membrane proteins， SNMPs）[2930]?；谝褱y(cè)序的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，本文進(jìn)一步鑒定了該天牛的CSP基因家族，并采用PCR研究了這些CSP基因的組織表達(dá)特征;在此基礎(chǔ)上選取觸角特異表達(dá)的XquaCSP7基因進(jìn)行原核表達(dá)和純化，研究了XquaCSP7與不同寄主氣味的結(jié)合特性。研究結(jié)果不僅豐富了滅字脊虎天牛的化感基因家族，還可為后續(xù)該種害蟲基于寄主揮發(fā)物的行為調(diào)控劑的研發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 試驗(yàn)昆蟲

滅字脊虎天牛采自云南省德宏熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所咖啡種植園，緯度24°1′32″N，經(jīng)度97°51′18″E，海拔767 m。田間采集受害的咖啡樹干，帶回室內(nèi)后將其用紗網(wǎng)套住，每天不定時(shí)觀察，將羽化當(dāng)天的滅字脊虎天牛雌雄成蟲分開飼養(yǎng)，并提供咖啡枝葉和蜂蜜水作為食物。然后，分別收集3～5日齡成蟲觸角、頭（去除觸角）、胸、腹、足、翅等組織。將雌雄成蟲同一組織按1∶1的比例混合，以便后續(xù)RT-PCR試驗(yàn)中同一組織雌雄蟲cDNA模板濃度相等。收集好的組織立即用液氮速凍，保存于-80℃冰箱。

1.1.2 試驗(yàn)試劑

TRIzol試劑購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司;反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScriptTM RT reagent Kit、DNA rTaq酶、dNTP Mixture、10×PCR Buffer （Mg2+）和6×Loading buffer購(gòu)自TaKaRa寶生物工程有限公司;SuperRed/GelRed核酸染料購(gòu)自BioSharp公司。

1.2 基因的鑒定

基于已發(fā)表的滅字脊虎天牛觸角轉(zhuǎn)錄組（SRA登錄號(hào)：SRP143591），采用BLAST同源搜索的方法鑒定滅字脊虎天牛的CSP基因。首先，從NCBI（National Center for Biotechnology Information）數(shù)據(jù)庫(kù)中下載松褐天牛、星天牛、光肩星天牛、赤擬谷盜、大猿葉蟲Colaphellus bowringi的CSP作為目標(biāo)序列，在BioEdit中采用本地BLAST鑒定候選的CSP基因。然后，將鑒定的所有CSP基因再次在NCBI nr蛋白序列（NCBI non-redundant protein sequence database）數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行比對(duì)，確定候選的CSP基因。最后，根據(jù)鞘翅目昆蟲CSP氨基酸序列中4個(gè)保守Cys及其位置（C1-X6-C2-X18-C3-X2-C4），進(jìn)一步確定候選的CSP基因[8，16，3132]。

1.3 序列分析

利用NCBI上的open reading frame finder（ORF finder）預(yù)測(cè)開放閱讀框（https：∥www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/）。利用在線軟件SingalP 4.1 Sever（http：∥www.cbs.dtu.dk/services/SingalP）預(yù)測(cè)信號(hào)肽[33]。CSP氨基酸序列間的一致性采用GeneDoc進(jìn)行計(jì)算;序列比對(duì)采用Clustal X 1.83。在進(jìn)化樹分析中，選取了天?？评ハx松褐天牛、云斑天牛、光肩星天牛和星天牛共42條CSP序列，利用MEGA 7.0軟件鄰位相連法（neighbour-joining）構(gòu)建進(jìn)化樹，對(duì)結(jié)果進(jìn)行1 000次bootstrap驗(yàn)證[34]。

1.4 基因的表達(dá)譜分析

根據(jù)TRIzol試劑盒使用說明書，分別提取滅字脊虎天牛各組織總RNA;然后，采用NanoDrop 1000測(cè)定其濃度。利用DNase Ⅰ去除各組織中的基因組DNA，之后采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScriptTM RT reagent Kit合成cDNA。選取滅字脊虎天牛肌動(dòng)蛋白actin基因作為內(nèi)參基因[32]，以檢測(cè)各組織cDNA模板質(zhì)量及完整性。采用RT-PCR研究CSP基因在以上各組織的表達(dá)情況。PCR引物采用Primer Premier 5軟件設(shè)計(jì)，引物序列送昆明奧基生物科技有限公司進(jìn)行合成（表1）。PCR反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性3 min;94℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸40 s，35個(gè)循環(huán);72℃延伸5 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用1.2%的瓊脂糖膠進(jìn)行電泳分析，最后根據(jù)目的條帶的有無及亮度判斷CSP基因在不同組織中的表達(dá)情況。

1.5 重組蛋白XquaCSP7的表達(dá)和純化

1.5.1 原核表達(dá)載體的構(gòu)建

根據(jù)XquaCSP7基因的開放閱讀框序列（去除信號(hào)肽）設(shè)計(jì)原核表達(dá)引物，并在正向和反向引物中分別加入Nde Ⅰ和Xba Ⅰ酶切位點(diǎn)（表1），從而將目的基因更好地連入載體pCzn1中。用相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶（Nde Ⅰ和Xba Ⅰ）酶切表達(dá)載體pCzn1，然后與PCR擴(kuò)增獲得的XquaCSP7基因進(jìn)行連接，獲得重組質(zhì)粒pCzn1-XquaCSP7。重組質(zhì)粒陽(yáng)性克隆進(jìn)一步通過測(cè)序進(jìn)行驗(yàn)證，以確定序列及插入方向的正確性。

1.5.2 重組蛋白的表達(dá)和純化

將測(cè)序正確的重組質(zhì)粒pCzn1-XquaCSP7轉(zhuǎn)入大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞Arctic-Express中，離心后全部涂于含50 μg/mL氨芐青霉素（ampicillin，Amp+）的LB平板上，挑取單克隆接種于3 mL LB液體培養(yǎng)基（50 μg/mL Amp+）中，37℃，220 r/min振蕩過夜。次日，按1∶100的比例接種于1 L LB液體培養(yǎng)基（50 μg/mL Amp+）中，37℃，220 r/min培養(yǎng)至菌體OD600值為0.6～0.8時(shí)，向培養(yǎng)液中加入終濃度為0.5 mmol/L的異丙基硫代半乳糖苷（isopropyl β-D-thiogalactoside，IPTG）;然后，在37℃，220 r/min繼續(xù)振蕩培養(yǎng)4 h進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。

4℃離心后棄上清;然后用磷酸鹽緩沖液重懸菌體，超聲波破碎后分別取上清和沉淀進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分析，以確定重組蛋白的可溶性。采用鎳離子親和層析柱對(duì)目的蛋白進(jìn)行純化，純化后的目的蛋白液采用超濾管對(duì)其進(jìn)行濃縮。

1.6 熒光競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合測(cè)定

在熒光競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合測(cè)定中，N-苯基-1-萘胺（N-phenyl-1-naphthylamine，1-NPN）和所有化合物均購(gòu)自Sigma Aldrich有限公司，純度大于或等于90%（表2）。以色譜級(jí)甲醇為溶劑，分別配制濃度為10 mmol/L的熒光探針1-NPN和21種氣味配基的母液，-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩Ｊ褂脮r(shí)再用色譜級(jí)甲醇將探針和氣味配基母液稀釋為1 mmol/L的工作液。

首先，在96 Micro Well TM微孔板（Nunclon TM）加入2 μmol/L的蛋白和2 μmol/L的1-NPN，判斷XquaCSP7與探針是否能夠結(jié)合;然后，在2 μmol/L蛋白液中加入終濃度為2、4、6、8、12、16 μmol/L和20 μmol/L的1-NPN，計(jì)算XquaCSP7與1-NPN的結(jié)合常數(shù)（Kd）;最后，在2 μmol/L蛋白和2 μmol/L 1-NPN的混合液中分別加入不同濃度的氣味配基，用多功能酶標(biāo)儀（VARIOSKAN FLASH）進(jìn)行結(jié)合測(cè)定。測(cè)定參數(shù)為：激發(fā)波長(zhǎng)為337 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為370～550 nm，激發(fā)和發(fā)射狹縫均為5 nm。

2 結(jié)果與分析

2.1 滅字脊虎天牛CSP基因的鑒定

利用BLAST同源性搜索的方法，從滅字脊虎天牛觸角轉(zhuǎn)錄組中共鑒定到14個(gè)CSP基因。所有CSP基因均具有完整的開放閱讀框，編碼101～148個(gè)氨基酸，且在N端均具有信號(hào)肽序列（16～26個(gè)氨基酸）。NCBI BLAST比對(duì)結(jié)果表明，所有CSP均比對(duì)到鞘翅目其他昆蟲的CSP，其中XquaCSP6與松褐天牛的MaltCSP2具有最高的氨基酸一致性，為87%;而XquaCSP14與中歐山松大小蠹的DponCSP1的氨基酸一致性最低，僅為50%（表3）。

2.2 滅字脊虎天牛CSP的序列及進(jìn)化分析

利用Clustal X 1.83對(duì)滅字脊虎天牛14個(gè)CSP的氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果表明所有CSP均具有4個(gè)保守的Cys，模式為C1-X6-C2-X18-C3-X2-C4（圖1）。

為了明確滅字脊虎天牛14個(gè)CSP與鞘翅目其他昆蟲CSP的進(jìn)化關(guān)系，我們構(gòu)建了星天牛、光肩星天牛、云斑天牛、松褐天牛和滅字脊虎天牛CSP的進(jìn)化樹。結(jié)果表明，除XquaCSP8和XquaCSP12聚類到同一個(gè)小分支外，其余XquaCSPs聚類到不同的分支（圖2）。

2.3 滅字脊虎天牛CSP基因的表達(dá)譜分析

為了明確CSP基因的可能功能，利用RT-PCR技術(shù)研究了14個(gè)CSP基因在觸角、頭（去除觸角）、胸、腹、足和翅等組織的表達(dá)情況。結(jié)果表明，除XquaCSP13基因外，其他XquaCSPs基因在觸角中均有表達(dá)。其中XquaCSP7基因在觸角特異表達(dá);XquaCSP4、CSP5、CSP12和CSP14基因在觸角高表達(dá);XquaCSP13基因在足特異表達(dá);其余XquaCSPs基因在除觸角以外的多個(gè)組織中有表達(dá)（圖3）。

2.4 滅字脊虎天牛XquaCSP7的表達(dá)及純化

首先，檢測(cè)了重組蛋白pCzn1-XquaCSP7在大腸桿菌的可溶性表達(dá)形式，超聲波破碎后分別取上清液和沉淀進(jìn)行SDS-PAGE分析。結(jié)果表明，pCzn1-XquaCSP7主要以包涵體的形式存在，因此采用包涵體變性和復(fù)性的方法進(jìn)行純化。將處理好的蛋白混合液過柱，純化后得到約14 kDa的高純度單一目的蛋白（圖4）。

2.5 滅字脊虎天牛XquaCSP7與不同配基的結(jié)合能力測(cè)定

采用熒光競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合測(cè)定方法，研究了XquaCSP7與21種寄主氣味的結(jié)合能力。首先，測(cè)定了XquaCSP7與1-NPN的結(jié)合能力。結(jié)果表明，該蛋白與1-NPN探針具有好的結(jié)合能力，結(jié)合常數(shù)Kd為6.50 μmol/L（圖5）。結(jié)合測(cè)定結(jié)果表明，XquaCSP7與21種氣味配基的結(jié)合能力均較弱，1-NPN的熒光取代率在4.5%～13.5%之間。在測(cè)試的所有化合物中，XquaCSP7與苯乙酮的結(jié)合能力最強(qiáng)，熒光取代率為13.5%;XquaCSP7與順-3-己烯乙酸酯的結(jié)合能力最弱，熒光取代率僅為4.5%（圖6）。

3 討論

滅字脊虎天牛是小?？Х壬蠟楹^為嚴(yán)重的蛀干害蟲之一，嗅覺在其寄主定位中起著重要作用。與其他大部分昆蟲的觸角功能類似，天牛的觸角能夠感受同種性信息素和普通植物氣味，在其種群繁衍和生存中必不可少[3537]。近年，轉(zhuǎn)錄組測(cè)序已成為基因鑒定的主要手段，基于觸角轉(zhuǎn)錄組可鑒定到嗅覺相關(guān)的基因及害蟲防治的潛在分子靶標(biāo)，然后采用反向化學(xué)生態(tài)學(xué)技術(shù)可篩選到用于害蟲防治的行為調(diào)控劑。從滅字脊虎天牛的觸角轉(zhuǎn)錄組中我們已鑒定了該種害蟲的5類化感基因家族：ORs、GRs、IRs、SNMPs和OBPs，并研究了它們各自的進(jìn)化關(guān)系及組織表達(dá)特征[2930]。為了進(jìn)一步完善該天牛的化感基因家族，本文研究了參與嗅覺感受的另一類重要化感蛋白基因：CSPs。研究結(jié)果極大地豐富了滅字脊虎天牛的化感基因家族，并為后續(xù)化感基因的功能研究奠定基礎(chǔ)。

從滅字脊虎天牛的觸角轉(zhuǎn)錄組中，一共鑒定到14個(gè)CSP基因，其數(shù)量多于銅綠異麗金龜Anomala corpulenta（5個(gè)）[37]、云杉八齒小蠹Ips typographus（6個(gè)）[31]、紅脂大小蠹（6個(gè)）[12]、華山松大小蠹（9個(gè)）[24]、中歐山松大小蠹Dendroctonus ponderosae（11個(gè)）[31]、大猿葉蟲（12個(gè)）[38]、松褐天牛（12個(gè)）[13]、光肩星天牛（12個(gè)）[14]和紅棕象甲R(shí)hynchophorus ferrugineus（12個(gè)）[39]，考慮到以上鞘翅目昆蟲的CSP基因均來自于成蟲觸角轉(zhuǎn)錄組，因此推測(cè)滅字脊虎天牛有更多的CSP基因參與嗅覺感受;此外，也有可能是由于不同昆蟲觸角轉(zhuǎn)錄組測(cè)序深度和組裝技術(shù)的差異導(dǎo)致。但是少于星天牛（16個(gè)）[15]和赤擬谷盜（20個(gè)）[16]，其中與赤擬谷盜CSP基因的數(shù)量差異較大，原因很可能是赤擬谷盜的CSP基因來源于基因組，而滅字脊虎天牛的CSP基因僅從觸角轉(zhuǎn)錄組中獲得，在其他組織特異或高表達(dá)的CSP基因并未被鑒定。

在滅字脊虎天牛中，所有CSP均具有4個(gè)保守的Cys，其保守模式“C1-X6-C2-X18-C3-X2-C4”與鞘翅目其他昆蟲的CSP類似[8，16，3131]，這種保守的Cys模式極大地幫助了鞘翅目昆蟲CSP基因的鑒定。此外，研究發(fā)現(xiàn)不同物種同源的CSP間氨基酸一致性較高，如云南切梢小蠹Tomicus yunnanensis的CSP與鞘翅目其他昆蟲的CSP一致性大于45%[32];星天牛[15]和光肩星天牛[14]的CSP與鞘翅目其他昆蟲的CSP一致性均大于50%;類似的結(jié)果在滅字脊虎天牛中也有發(fā)現(xiàn)。然而，同一物種不同CSP間氨基酸一致性差異較大，如光肩星天牛CSP間的一致性為8.9%～71.8%[14];家蠶CSP間的一致性為20%～60%[17]。與其他昆蟲的CSP類似，滅字脊虎天牛的14個(gè)CSP間氨基酸一致性變化較大（12%～73%），其中XquaCSP8和XquaCSP12一致性最高，在進(jìn)化樹中聚類到同一個(gè)小分支，且它們具有相似的組織表達(dá)特征，說明它們很可能具有相似的功能。

昆蟲的CSP基因具有多樣性的組織表達(dá)特征，說明其在嗅覺和非嗅覺感受中均具有重要功能。在鞘翅目中，光肩星天牛的CSP基因在觸角、足、下顎須、下唇須等組織中均有表達(dá)[14]，類似的結(jié)果在星天牛[15]、銅綠異麗金龜[37]、赤擬谷盜[16]、黃曲條跳甲Phyllotreta striolata[40]、榆紫葉甲Ambrostoma quadriimpressum[41]等昆蟲中也有發(fā)現(xiàn)。在滅字脊虎天牛中，除XquaCSP7和XquaCSP13基因外，其余XquaCSPs基因在除觸角以外的多個(gè)組織中有表達(dá)，說明這些CSP基因具有多種功能。其中，XquaCSP7基因呈現(xiàn)觸角特異表達(dá)的特點(diǎn)，很可能參與性信息素或是寄主氣味的感受;XquaCSP13基因在足特異表達(dá)，與光肩星天牛[14]和赤擬谷盜[16]的部分CSP基因表達(dá)特征類似。在美洲大蠊Periplaneta americana中，PameCSP10（p10）基因在再生足中表達(dá)，很可能與足的再生有關(guān)[42]，滅字脊虎天牛的XquaCSP13基因是否與足的發(fā)育有關(guān)仍需進(jìn)一步的功能驗(yàn)證。在功能研究中，選取觸角特異表達(dá)的XquaCSP7基因，主要考慮到觸角是滅字脊虎天牛主要的嗅覺器官，在其寄主定位中具有重要作用。此外，在結(jié)合測(cè)定中主要選取了寄主植物的氣味。雖然XquaCSP7能夠很好地與熒光探針1-NPN結(jié)合（Kd=6.50 μmol/L），但是在測(cè)試的21種氣味物質(zhì)中，XquaCSP7與所有氣味配基的結(jié)合能力均較弱，沒有一種配基的相對(duì)熒光值下降到50%以下。據(jù)此分析認(rèn)為XquaCSP7可能是一個(gè)非廣譜的結(jié)合蛋白，即結(jié)合譜較窄，僅對(duì)一種或幾種氣味具有結(jié)合能力;而在結(jié)合測(cè)定中，由于測(cè)試的配基數(shù)量有限，因此沒能夠篩選到XquaCSP7親和力較好的配基。

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（責(zé)任編輯：田 喆）

收稿日期： 20190313?? 修訂日期： 20190425

基金項(xiàng)目：云南省科技廳青年項(xiàng)目（2017FD101）

致? 謝： 參加本試驗(yàn)部分工作的還有江代禮、譚翰杰、張能和紀(jì)燁斌等同學(xué)，特此一并致謝。

通信作者?E-mail：naiyong_2013@163.com

#?為并列第一作者