趙丹丹 陳景超 黃兆峰 姜翠蘭 黃紅娟 張朝賢 李香菊 魏守輝

摘要 入侵雜草刺萼龍葵Solanum rostratum Dunal傳播擴散的主要載體是種子，研究其種子休眠萌發(fā)基因的激素調(diào)控對于其防除具有重要意義，而選擇合適的內(nèi)參基因可以提高相關基因表達分析的準確性。本研究以赤霉素、脫落酸和水處理的刺萼龍葵種子為材料，利用geNorm、NormFinder、BestKeeper和RefFinder 4種軟件對15個候選內(nèi)參基因進行表達穩(wěn)定性評價，并通過檢測ABI5（abscisic acid-insensitive 5）的表達驗證所篩選的內(nèi)參基因的適用性。結(jié)果表明，對于赤霉素、脫落酸和水處理過的種子，最穩(wěn)定的內(nèi)參基因分別為eIF（eukaryotic initiation factor）、SAND（SAND protein family）和ACT（β-actin）;對所有種子樣本而言，PP2Acs（a catalytic subunit of protein phosphatase 2A）是最穩(wěn)定的內(nèi)參基因。研究結(jié)果將為刺萼龍葵種子休眠萌發(fā)的遺傳調(diào)控研究提供重要參考。

關鍵詞 刺萼龍葵; 內(nèi)參基因; 種子; 赤霉素; 脫落酸

中圖分類號： S 451.1

文獻標識碼： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2019105

Selection of suitable reference genes in Solanum rostratum seeds

ZHAO Dandan， CHEN Jingchao， HUANG Zhaofeng， JIANG Cuilan， HUANG Hongjuan，

ZHANG Chaoxian， LI Xiangju， WEI Shouhui

（Key Laboratory of Weed and Rodent Biology and Management， Institute of Plant Protection，

Chinese Academy of Agricultural Sciences， Beijing 100193， China）

Abstract

The main transmission way of the invasive weed buffalobur （Solanum rostratum） is seed dispersal. It is important to understand the hormonal regulation of seed dormancy or germination related genes in buffalobur. Selection of appropriate reference genes can improve the accuracy of expression analysis of these genes. Here， 15 candidate reference genes were selected to evaluate their expression stability in hormone-treated and water-treated seeds of buffalobur using geNorm， NormFinder， BestKeeper and RefFinder statistical algorithms. Validation of recommended reference genes were achieved by assessing the relative expression levels of abscisic acid-insensitive 5 （ABI5）. The results showed that the most stable reference genes for gibberellin， abscisic acid and water-treated seeds were eukaryotic initiation factor （eIF）， SAND protein family （SAND） and β-actin （ACT）， respectively. For total seeds， PP2Acs， the gene encoding a catalytic subunit of protein phosphatase 2A was the most stable reference gene. This work would provide references for further research on the genetic regulation of seed dormancy and germination in this invasive plant.

Key words

Solanum rostratum; reference gene; seed; gibberellin; abscisic acid

外來入侵雜草刺萼龍葵Solanum rostratum原產(chǎn)于北美洲，是茄科茄屬一年生草本植物[1]。1981年刺萼龍葵首次在我國遼寧朝陽被發(fā)現(xiàn)[2]，隨后逐漸擴散蔓延至吉林、河北、北京、內(nèi)蒙古、山西等地[3]。刺萼龍葵可以降低入侵地的生物多樣性、破壞其生態(tài)系統(tǒng)。入侵農(nóng)田的刺萼龍葵除了直接與農(nóng)作物競爭之外，還是多種病蟲害的中間寄主，其植株含有毒素茄堿，可以使誤食的牲畜中毒死亡[1]。刺萼龍葵的入侵對生態(tài)環(huán)境和農(nóng)業(yè)生產(chǎn)均造成了嚴重影響，其防控問題受到人們的廣泛關注[4]。由于化學除草劑的大量使用會對生態(tài)環(huán)境造成污染，而基于競爭替代的生態(tài)調(diào)控技術也存在應用范圍較窄的局限性。因此，從刺萼龍葵種子休眠與萌發(fā)的遺傳調(diào)控路徑入手，有望發(fā)掘更為有效的防控方法[56]。

刺萼龍葵主要通過種子進行傳播，其單株結(jié)實量可以達1萬～2萬粒。刺萼龍葵的種子具有復合休眠特性（物理休眠與生理休眠），在土壤中可以保持較長時間的種子活力[7]。前人研究發(fā)現(xiàn)赤霉素可以顯著提高刺萼龍葵種子的萌發(fā)率，其種子的休眠和萌發(fā)主要受激素相關的內(nèi)在遺傳基因調(diào)控[5]。明確刺萼龍葵種子休眠和萌發(fā)調(diào)控的分子機理對合理調(diào)節(jié)其萌發(fā)出苗，進而制定有效的雜草防治措施具有重要價值。基因表達分析是揭示植物生命周期中基因功能和調(diào)控機制的重要手段。因此，確保相關基因表達分析的準確性十分重要。熒光定量PCR（real-time quantitative PCR， qPCR）因其靈敏度高、特異性強等優(yōu)點，被廣泛用于基因表達檢測[8]。選用表達水平不隨組織類型、發(fā)育階段或浸種處理而顯著變化的內(nèi)參基因進行qPCR可以確保結(jié)果分析的準確性[9]。因此，在使用qPCR技術對基因表達進行檢測分析之前，應篩選合適的內(nèi)參基因并驗證其穩(wěn)定性。目前，有關刺萼龍葵種子適宜內(nèi)參基因篩選的研究尚未見報道。

本研究以外源激素（赤霉素、脫落酸）處理的刺萼龍葵種子為材料，檢測了三磷酸甘油醛脫氫酶基因（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）、肌動蛋白基因（β-actin，ACT）、谷氧還蛋白基因（glutaredoxin protein，GR）、泛素蛋白基因（ubiquitin，UBQ）、液泡膜內(nèi)在蛋白基因（tonoplast intrinsic protein/aquaporin，TIP41）、18S核糖體RNA基因（18S rRNA，18S）、核糖體蛋白L8基因（ribosomal protein L8，RPL8）、肌動蛋白真核起始因子基因（actin eukaryotic initiation factor，eIF）、熱休克蛋白40基因[DnaJ-like protein （hsp40），DNAJ]、β-微管蛋白基因（β-tubulin，TUB）、親環(huán)蛋白基因（cyclophilin，CYP）、轉(zhuǎn)錄延伸因子（elongation factor 1-alpha，EF1α）、蛋白磷酸酶2A的催化亞單位基因（a catalytic subunit of protein phosphatase 2A，PP2Acs）、1，5-二核酸核酮糖基因（ribulose 1，5 bisphosphate，RUBP）和SAND家族蛋白基因（SAND protein family，SAND）共15個內(nèi)參基因的表達情況，用geNorm[10]、NormFinder[11]、BestKeeper[12]和RefFinder[13]4種軟件對其表達穩(wěn)定性進行分析，并對篩選出的內(nèi)參基因進行了穩(wěn)定性驗證。其中geNorm和NormFinder均是通過計算內(nèi)參基因表達穩(wěn)定值大小來評價其穩(wěn)定性，前者可選擇出兩個或兩個以上基因作為標準化指標，而后者只能選擇一個合適的內(nèi)參基因;BestKeeper依據(jù)各基因間配對的相關系數(shù)、變異系數(shù)和標準偏差等值對內(nèi)參基因穩(wěn)定性進行評價;RefFinder內(nèi)置的算法包括以上3種，其對候選內(nèi)參基因的綜合排序結(jié)果更可靠，避免了單個軟件分析的片面性。本研究結(jié)果可以為準確檢測刺萼龍葵種子休眠萌發(fā)相關基因的表達提供參考。

1 材料與方法

1.1 植物材料

刺萼龍葵種子于2018年采于北京市密云區(qū)（40°24′4″N， 116°50′21″E）。選取成熟、飽滿、大小均勻的刺萼龍葵種子擺放在墊有兩層濾紙的培養(yǎng)皿（直徑15 cm）中，每皿擺放300粒。向培養(yǎng)皿中分別加入12 mL 0.35 mmol/L赤霉素（gibberellin，GA）、12 mL 0.35 mmol/L脫落酸（abscisic acid，ABA）或12 mL無菌水，以未處理的干種子作為空白對照。然后將培養(yǎng)皿轉(zhuǎn)入光照培養(yǎng)箱中，在30℃±2℃、黑暗條件下培養(yǎng)24、48 h和72 h后分別收集種子樣品。將所有的樣品分為4組，即赤霉素、脫落酸、水及以上3組的混合樣品（種子總體），每個樣品設3個生物學重復，取樣后立即放入液氮中冷凍并保存在-80℃冰箱中。

1.2 RNA提取及cDNA合成

使用RNAprep Pure植物總RNA提取試劑盒（天根生化科技（北京）有限公司）進行樣品RNA的提取，RNA樣品經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測在28S和18S處均顯示清晰單一的條帶，無明顯降解。利用NanoDrop TM One/OneC超痕量UV分光光度計測量RNA的濃度和純度，其A260/A280在1.90～2.10之間，RNA的總體質(zhì)量較好。采用TransScriptAll-in-One First-Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR（北京全式金生物技術有限公司）反轉(zhuǎn)錄試劑盒對質(zhì)量合格的RNA進行反轉(zhuǎn)錄，體系為20 μL，RNA質(zhì)量均為800 ng。合成的cDNA保存在-80℃冰箱中。

1.3 候選基因的選擇與引物設計

根據(jù)本實驗室建立的刺萼龍葵轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫以及文獻中報道的常見內(nèi)參基因，選擇了15個刺萼龍葵的內(nèi)參基因（GAPDH，ACT，GR，UBQ，TIP41，18S，RPL8，eIF，TUB，DNAJ，CYP，EF1α，PP2Acs，RUBP和SAND）作為候選。使用Oligo 7軟件設計用于qPCR的引物，具體信息如表1。引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。

1.4 常規(guī)PCR與qPCR反應

以刺萼龍葵種子的cDNA為模板，分別對15個候選內(nèi)參基因進行常規(guī)PCR。反應體系為25 μL，包括：12.5 μL 2×Taq Master Mix，1 μL cDNA，2? μL上下游引物混合物（10 μmol/L），9.5 μL超純水。反應程序為：94℃預變性5 min;94℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸15 s，35個循環(huán);最后72℃延伸10 min。反應完成后，取5 μL擴增產(chǎn)物用2%的瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，每對引物均擴增出了單一正確的產(chǎn)物，無可見的引物二聚體，說明引物的特異性良好（圖1）。

2.2.4 RefFinder分析

RefFinder可以綜合geNorm、NormFinder、BestKeeper和Delta-Ct 4種算法，列出15個候選內(nèi)參基因的表達穩(wěn)定性排名。對于赤霉素處理的種子，穩(wěn)定性排名前三的內(nèi)參基因是eIF、UBQ和EF1α;對于脫落酸處理的種子，最穩(wěn)定的前三個內(nèi)參基因是SAND、PP2Acs和GR;對于水處理的種子，最穩(wěn)定的內(nèi)參基因依次是ACT、SAND和PP2Acs;對所有樣品進行分析，穩(wěn)定性排名前三的內(nèi)參基因分別是PP2Acs、SAND和eIF（表2）。

2.3 內(nèi)參基因穩(wěn)定性的驗證

用不同處理的刺萼龍葵種子為材料，分別用篩選出的最穩(wěn)定和最不穩(wěn)定的基因為內(nèi)參，檢測了基因ABI5的表達。結(jié)果顯示，種子經(jīng)脫落酸處理后，用最穩(wěn)定的基因作為內(nèi)參，發(fā)現(xiàn)ABI5的表達水平?jīng)]有顯著差異;而用最不穩(wěn)定的內(nèi)參時，得出的結(jié)果是ABI5表達水平在24 h顯著升高，后又顯著降低（圖4a）。對于赤霉素處理的種子，當用最穩(wěn)定的內(nèi)參基因時，ABI5的相對表達水平在0.5～1倍之間;當用最不穩(wěn)定的內(nèi)參基因時，ABI5在24 h時的表達量是0 h時的5倍（圖4b）。對于水處理的種子，當用最穩(wěn)定的內(nèi)參基因時，ABI5的相對表達水平在0.8～1.6倍之間;當用最不穩(wěn)定的內(nèi)參基因時，ABI5的表達水平在處理后48 h之內(nèi)顯著升高，后又顯著降低（圖4c）。

3 討論

qPCR具有靈敏度高、定量準確、特異性強等優(yōu)點，是目前研究基因表達的常用方法。為了保證基因表達分析結(jié)果的準確性，除了規(guī)范操作流程之外，選擇表達穩(wěn)定的內(nèi)參基因作為參照標準也非常重要。國內(nèi)外大量研究表明，內(nèi)參基因表達的穩(wěn)定性會受到試驗處理的影響，因此在進行基因表達分析之前篩選適合的內(nèi)參基因有利于保證結(jié)果的準確性[15]。近年來，數(shù)字PCR（digital PCR，dPCR）技術發(fā)展迅速，雖然其較qPCR具有靈敏度更高、對抑制劑更耐受且不需要標準曲線與內(nèi)參基因的優(yōu)點，但易產(chǎn)生假陽性且成本較高;qPCR憑借更廣的檢測動態(tài)范圍和更低的成本，目前仍有很廣的應用范圍，不可能完全被dPCR取代[16]。刺萼龍葵在中國的快速傳播蔓延造成了嚴重的經(jīng)濟損失，由于化學防控與生物防控技術都存在一定的局限性，有學者利用刺萼龍葵種子具有復合休眠的特性，研究了其在不同脅迫處理下的萌發(fā)行為以及休眠相關基因的表達，力求找到更為高效的基于休眠萌發(fā)調(diào)控的防控措施[56]。為了篩選刺萼龍葵種子在激素處理下的最適內(nèi)參基因，本研究使用4種算法對15個候選內(nèi)參基因的表達穩(wěn)定性進行了評估，不同軟件得出的內(nèi)參基因的穩(wěn)定性排序有一定差異，這可能是因為每種軟件的算法不同。geNorm的缺點在于其傾向選擇具有相似表達譜的基因，例如最穩(wěn)定基因可能具有同一類功能[10];NormFinder在計算標準化因子時考慮了組內(nèi)和組間差異，但并不能排除樣品制備過程中產(chǎn)生的系統(tǒng)誤差[11];BestKeeper通過考慮單個樣本的內(nèi)在方差（InVar）克服了這一缺點，但是該軟件至少需要3個內(nèi)參基因的數(shù)據(jù)才能進行分析[12];RefFinder可以綜合4種統(tǒng)計算法（geNorm、NormFinder、BestKeeper和Delta-Ct）來得出基因表達穩(wěn)定性的綜合排名。因此，使用多種評價軟件來分析篩選內(nèi)參基因，可以確保結(jié)果的可靠性。

在本研究中，eIF在赤霉素處理的種子中表達穩(wěn)定;同樣的，eIF4A在亞麻Linum usitatissimum[17]以及干旱脅迫下的多花黑麥草Lolium multiflorum[18]中也表現(xiàn)出良好的穩(wěn)定性。對于脫落酸處理的刺萼龍葵種子，內(nèi)參基因SAND的表達最穩(wěn)定;在不同組織的番茄[19]以及脫落酸脅迫處理下的狼毒Stellera chamaejasme[20]中，SAND同樣穩(wěn)定表達。在水處理過的刺萼龍葵種子中，穩(wěn)定表達的基因為ACT，相似的結(jié)果也在成熟的花生Arachis hypogaea種子中發(fā)現(xiàn)[21];而在擬南芥Arabidopsis thaliana以及狗尾草Setaria viridis種子中，ACT的表達并不穩(wěn)定[2223]。PP2Acs在刺萼龍葵所有種子樣品中的表達最穩(wěn)定;相似的結(jié)果在不同非生物脅迫下的西伯利亞剪股穎Agrostis stolonifera[24]以及不同激素作用下的御谷Pennisetum glaucum[25]中也被發(fā)現(xiàn)。候選內(nèi)參基因TIP41和18S在試驗中穩(wěn)定性差，原因可能是其在刺萼龍葵種子中的表達水平過高或過低。由此可見，過高或過低的轉(zhuǎn)錄豐度不利于內(nèi)參基因在樣品中的穩(wěn)定表達。理想的內(nèi)參基因應具有高度或中度的表達水平，Cq值范圍在15～30之間為宜。

ABI5主要參與種子成熟和萌發(fā)過程中ABA信號的傳導過程[26]。在本研究中，用最佳內(nèi)參基因組合與用單個最穩(wěn)定內(nèi)參基因標準化后得出的ABI5的表達水平相似，而這兩者與用最不穩(wěn)定內(nèi)參基因得出的結(jié)果有顯著差異，說明本研究所篩選出的內(nèi)參基因是可靠的。

本研究評估了刺萼龍葵15個候選內(nèi)參基因在赤霉素、脫落酸以及水處理的種子中的表達穩(wěn)定性。在這些候選基因中，eIF在赤霉素處理的種子中表達最穩(wěn)定，SAND在脫落酸處理的種子中最穩(wěn)定，ACT在水處理的種子中最穩(wěn)定，在所有樣品中，PP2Acs是最穩(wěn)定的內(nèi)參基因。研究結(jié)果將為刺萼龍葵種子中相關功能基因的表達分析提供依據(jù)。

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（責任編輯：楊明麗）

收稿日期： 20190305?? 修訂日期： 20190402

基金項目：國家自然科學基金（31572022）;國家重點研發(fā)計劃（2018YFD0200602）;北京市自然科學基金（6182033）

致? 謝： 參加本試驗部分工作的還有江代禮、譚翰杰、張能和紀燁斌等同學，特此一并致謝。

通信作者E-mail：黃紅娟hjhuang@ippcaas.cn;魏守輝shwei@ippcaas.cn

#為并列第一作者