馬俊豐 李小宇 張春雨 周雪平 王永志

摘要? 利用RT-PCR結(jié)合RACE方法，從感染SPVG的甘薯葉片中獲得甘薯G病毒吉林分離物Jilin-gzl的全基因組序列。測序獲得的Jilin-gzl分離物（GenBank No.Mk392509）基因組為10 797 nt。該病毒基因組含有一個10 464 nt的開放閱讀框，編碼由3 488個氨基酸構(gòu)成的多聚蛋白。在P1和P3基因中也發(fā)現(xiàn)了由移碼翻譯產(chǎn)生的PISPO蛋白和PIPO蛋白。比對分析顯示，在開放閱讀框水平上Jilin-gzl與6個不同分離物核苷酸序列一致性為79%～99%，氨基酸一致性為92%～99%，其中與SC11、IS103、HG167和Jesus_Maria分離物一致性最高，與WT325和AI一致性最低。系統(tǒng)發(fā)育分析顯示，Jilin-gzl與HG167和WCFR11系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系最近，與中國臺灣地區(qū)分離物WT325系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系較遠。這是中國大陸地區(qū)關(guān)于SPVG分離物全基因序列的首次報道，同時也是首次在中國東北地區(qū)發(fā)現(xiàn)SPVG。該研究探明了Jilin-gzl分離物的基因結(jié)構(gòu)，系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，豐富了SPVG基因組序列信息，為后續(xù)開展SPVG種群的遺傳進化及功能研究奠定了基礎。

關(guān)鍵詞? 甘薯G病毒（SPVG）; 全基因組; 比對分析; 系統(tǒng)發(fā)育

中圖分類號： S 432.41

文獻標識碼： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2019163

Complete genome sequencing and analysis of Sweet potato

virus G isolate from Jilin， China

MA Junfeng1，2， LI Xiaoyu2， ZHANG Chunyu2， ZHOU Xueping3， WANG Yongzhi2

（1. Jilin Agricultural University， Changchun 130118， China; 2. Jilin Academy of Agricultural

Sciences， Gongzhuling 136100， China; 3. Institute of Plant Protection， Chinese Academy of

Agricultural Sciences， Beijing 100193， China）

Abstract

The complete genome of Jilin-gzl was determined by using rapid-amplification of cDNA ends （RACE） and RT-PCR. The complete sequence of Jilin-gzl （GenBank No.Mk392509） had 10 797 nucleotides， excluding the 3′-terminal poly （A） tail. Its genome contained an open reading frame of 10 464 nucleotides and encoded a polyprotein of 3 488 amino acids. Two additional proteins， termed ‘PISPO and ‘PIPO， were also translated by frame shifting within the P1 and P3 cistron. The results of sequence identity analysis of Jilin-gzl isolate with the 6 reference SPVG isolates showed that Jilin-gzl isolate shared a 79%-99% nucleotide identity and 92%-99% amino acid identity with other SPVG isolates at the ORF sequence level. Jilin-gzl isolate shared a highest sequence identity with SC11， IS103， HG167， Jesus_Maria isolates， and a lowest identity with WT325 and AI isolates. Phylogenetic analysis indicated that Jilin-gzl shared high sequence homology with HG167 and WCFR11 isolates， and shared low sequence homology with WT325 isolate from Taiwan， China. This work was the first report about the complete sequence of SPVG in Mainland China and it was also the first time that SPVG has been found in Northeast China. This research elucidated the genetic structure and phylogenetic relationship of Jilin-gzl isolate， and enriched the information of SPVG genome sequence. These will provide useful information for further study of the phylogenesis and function of this pathogen.

Key words

Sweet potato virus G （SPVG）; complete genome; comparative analysis; phylogeny

甘薯Ipomoea batatas為旋花科Convolvulaceae薯蕷屬Dioscorea代表植物，是中國主要糧食作物之一。中國是世界第一大甘薯生產(chǎn)國[1]，據(jù)聯(lián)合國糧食及農(nóng)業(yè)組織（FAO）統(tǒng)計，2017年中國甘薯總產(chǎn)量約7 203萬t，占世界甘薯總產(chǎn)量（11 283萬t）的63.8%。甘薯作為無性繁殖作物，主要通過塊莖進行繁殖，這種繁殖方式極易積累病毒。被侵染后的甘薯，其產(chǎn)量和品質(zhì)大幅降低，造成嚴重的經(jīng)濟損失。據(jù)Clark等2012年報道，在世界范圍內(nèi)已發(fā)現(xiàn)的能夠侵染甘薯的病毒共有30多種[2]，其中有20多種病毒已經(jīng)在中國被發(fā)現(xiàn)[39]。甘薯G病毒Sweet potato virus G（SPVG），是馬鈴薯Y病毒科Potyviridae馬鈴薯Y病毒屬Potyvirus成員之一，于1994年最早在中國被發(fā)現(xiàn)，之后美國、秘魯、韓國、阿根廷等國家也相繼報道了該病毒[1013]。SPVG在自然條件下通過蚜蟲以非持久性方式傳播，同時也可以通過汁液摩擦、嫁接等機械方式傳播。近幾年在中國各個甘薯種植區(qū)，SPVG時有發(fā)生，并且已成為影響甘薯品質(zhì)與產(chǎn)量的重要病毒之一。

SPVG基因組由正單鏈RNA組成，含有一個較大開放閱讀框（open reading frame，ORF），編碼一個多聚蛋白（polyprotein）。基因組5′和3′端各有一段非編碼區(qū)（untranslated regions，UTRs），3′非編碼區(qū)末尾具有poly（A）尾序列。多聚蛋白經(jīng)自身編碼的蛋白酶切割后，得到不同的功能蛋白。除此之外，SPVG基因組中還有兩個小的開放閱讀框，通過移碼翻譯（read frame shift）的方式編碼蛋白PISPO和蛋白PIPO，這兩個蛋白分別與P1和P3蛋白的N端以P1N-PISPO和P3N-PIPO融合形式存在[14]。SPVG基因組通過這兩種方式生成12個成熟的功能蛋白，使各個基因呈現(xiàn)不同程度的遺傳多樣性。目前，中國大陸地區(qū)關(guān)于SPVG基因組序列的報道僅集中在部分基因區(qū)段，如外殼蛋白（CP）基因等[15]，尚未見有關(guān)SPVG全基因組序列的報道。本次研究擬通過對SPVG吉林分離物Jilin-gzl的全基因序列測定，對其序列特征、系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系等進行系統(tǒng)分析，為后續(xù)開展SPVG相關(guān)功能研究奠定基礎。

1 材料與方法

本試驗于2018年11月至2019年1月在吉林省農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所微生物實驗室完成。

1.1 試驗材料

SPVG吉林分離物Jilin-gzl于2018年9月采集自吉林省長春市甘薯種植區(qū)，呈典型明脈、花葉癥狀，前期經(jīng)血清學檢測和CP基因擴增初步確定為SPVG分離物，將新鮮樣品置于密封袋中，于-80℃凍存。

1.2 主要試劑

RNeasy Plant Mini Kit為QIAGEN公司產(chǎn)品，ReverAid First Strand cDNA Synthesis Kit為賽默飛世爾科技公司（Thermo Fisher Scientific）產(chǎn)品，AxyPrep DNA Gel Extraction Kit為愛思進生物技術(shù)公司（Axygen）產(chǎn)品，SMARTer RACE 5′/3′ Kit、TaKaRa LA Taq、pMD18-T Vector Cloning Kit、RNA Marker、DNA Marker為寶生物工程公司（TaKaRa）產(chǎn)品。

1.3 試驗方法

1.3.1 RNA提取及基因組克隆

采用TRIzol試劑法從確定感染SPVG的甘薯葉片中提取總RNA，提取步驟參照RNeasy Plant Mini試劑盒（QIAGEN）說明書。以總RNA為模板，參照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進行反轉(zhuǎn)錄，反應體系：Oligo dT Primer 1 μL、dNTP Mixture 1 μL、Total RNA 1 μL、RNase Free H2O 7 μL，于65℃溫浴5 min，然后立即冰上冷卻，并依次加入：RNase Inhibitor （40 U/μL） 0.5 μL、PrimeScript Ⅱ RTase （200 U/μL） 1 μL、5×PrimeScript Ⅱ Buffer 4 μL，30℃反應10 min，42℃反應60 min。根據(jù)GenBank中已登錄的12個SPVG不同分離物（登錄號及名稱見圖3）全基因序列的保守區(qū)，設計用于合成全基因序列的簡并引物和特異性引物（表1），以上引物委托吉林省庫美生物科技有限公司合成。

PCR擴增采用50 μL反應體系：TaKaRa LATaq（5 U/μL） 0.5 μL、10×LA PCR Buffer Ⅱ （Mg2+Plus） 5 μL、dNTP Mixture 5 μL、cDNA 1 μL、正向引物（10 μmol/L）1 μL、反向引物（10 μmol/L）1 μL、超純水36.5 μL。PCR反應體系：94℃預變性5 min;94℃變性30 s，退火30 s（退火溫度視基因片段而定，表1），72℃延伸若干分鐘（延伸時間按1 kb/min計算），共30個循環(huán);最后72℃再延伸5 min。

PCR反應結(jié)束后，取3 μL產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，檢測后切取目的條帶，利用膠回收試劑盒進行純化，純化產(chǎn)物與pMD18-T載體進行連接，并轉(zhuǎn)化到E.coli DH5α感受態(tài)細胞中。通過菌落PCR篩選出陽性克隆子，隨機選取3～5個，委托吉林省庫美生物科技有限公司進行測序。根據(jù)測序結(jié)果設計用于擴增5′非編碼區(qū)的引物（表1），5′非編碼區(qū)的擴增采用SMARTer RACE 5′/3′試劑盒（TaKaRa），步驟依照說明書進行。

1.3.2 序列分析

利用DNAMAN軟件進行序列拼接，在網(wǎng)站http：∥www.dpvweb.net/potycleavage/index.html上進行多聚蛋白剪切位點分析，在http：∥blast.ncbi.nlm.nih.gov/上進行序列一致性分析。

1.3.3 系統(tǒng)發(fā)育分析

為探究SPVG不同分離物的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，從GenBank中選取11個其他SPVG分離物的核苷酸序列作為參考，使用最大似然法（maximum likehood， ML）基于全基因序列編碼區(qū)（coding sequence， CDS）核苷酸序列構(gòu)建SPVG系統(tǒng)發(fā)育樹。建樹之前，采用DAMBE軟件檢測核苷酸序列替換是否飽和。利用MEGA 6軟件選擇最優(yōu)化的核苷酸替換模型，并參照BIC（Bayesian information criterion）標準設置相應參數(shù)，最后通過自舉法（bootstrap）來對各分支節(jié)點的置信度（bootstrap confidence level）進行評估。

2 結(jié)果與分析

2.1 Jilin-gzl分離物的全基因組序列特征

Jilin-gzl分離物全基因組分段擴增結(jié)果如圖1所示，各片段大小均符合預期。

通過測序、拼接獲得的Jilin-gzl分離物基因組全長為10 797 nt （GenBank No.Mk392509），5′端和3′端非編碼區(qū)（untranslated regions， UTRs）的長度分別為113 nt和238 nt，其中3′末端具有poly（A）尾序列（圖2）。該分離物僅包含一個開放閱讀框，位于11410 577 nt，翻譯出一個包含3 488個氨基酸殘基的多聚蛋白，屬于典型的Potyvirus屬病毒的基因結(jié)構(gòu)。剪切位點分析顯示，Jilin-gzl分離物的9個剪切位點分別為PYMEQY/S、KHYLVG/G、DEVQHQ/A、GPVYHQ/S、NCVQHQ/S、EIVQHQ/A、TVVEHE/S、VPVYTQ/S、NNVHHQ/S。Jilin-gzl分離物不同基因的位置、大小以及編碼蛋白的大小如表2所示。

2.2 Jilin-gzl分離物的序列一致性分析

序列一致性分析顯示，在開放閱讀框水平上Jilin-gzl與其他6個分離物的核苷酸和氨基酸相似性分別為79%～99%、92%～99%（表2），其中與Jesus_Maria、SC11、IS103、HG167相似性最高，均為99%，與WT325相似性最低，僅為79%和88%。在5′和3′非編碼區(qū)上，核苷酸一致性分別為65%～98%和91%～99%，其中在5′非編碼區(qū)上Jilin-gzl與Jesus_Maria、WT325一致性較低，僅為76%和65%，而與SC11、IS103、HG167、AI一致性較高，均超過90%;在3′非編碼區(qū)上一致性較高，均超過90%。在單個基因區(qū)段上Jilin-gzl與Jesus_Maria、SC11、IS103、HG167的核苷酸和氨基酸一致性分別為98%～99%和97%～100%，一致性均非常高;而與WT325和AI的核苷酸和氨基酸一致性為66%～87%和37%～97%，一致性較低。綜上所述，Jilin-gzl與分離物SC11、IS103、HG167、Jesus_Maria一致性非常高，與WT325、AI一致性較低。

2.3 系統(tǒng)發(fā)育分析

建樹序列經(jīng)過多重比對與Gblock剪裁后，得到長度為10 231 bp的序列保守區(qū)。根據(jù)MEGA軟件的BIC標準，建樹序列最合適的核苷酸替換模型為GTR+I+G。ML法構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹如圖3所示，12個分離物共形成4個區(qū)域，其中系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系較近的分離物聚為一簇，GWB-2（JN613807，SPVG2）和SPFMV-UNB-01（MF185715，SPFMV）為外族。從圖中可以看到，區(qū)域Ⅲ的各個分離物并未像區(qū)域Ⅰ和區(qū)域Ⅱ那樣聚為一簇，但是從圖中的拓撲結(jié)構(gòu)來看，Jilin-gzl與HG167和WCFR11系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系最近，而與該區(qū)域其他分離物系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系相對較遠。同時Jilin-gzl與中國臺灣地區(qū)分離物WT325系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系相對較遠而與兩個國外分離物系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系較近，表明SPVG各分離物在遺傳多樣性上與地理分布無顯著聯(lián)系。

3 結(jié)論與討論

本研究通過克隆、測序等手段獲得了SPVG吉林分離物Jilin-gzl的全基因組序列，并且通過序列一致性比對，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹等方法對其基因組結(jié)構(gòu)特征及其系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系進行了全面的探究與分析。這是中國大陸地區(qū)首次關(guān)于SPVG全基因組序列的報道，同時也是首次在中國東北地區(qū)發(fā)現(xiàn)SPVG。本研究結(jié)果為后續(xù)深入開展SPVG種群的遺傳進化及相關(guān)功能研究奠定了基礎。

序列一致性比對分析結(jié)果中有一部分數(shù)據(jù)值得注意，首先在Jilin-gzl與Jesus_Maria和AI比對結(jié)果中發(fā)現(xiàn)，Jilin-gzl與Jesus_Maria在5′非編碼區(qū)核苷酸序列差異性較大，而在編碼區(qū)和3′非編碼區(qū)核苷酸序列差異性較小，與此相反的是，Jilin-gzl與AI在5′和3′非編碼區(qū)核苷酸序列差異性較小，在編碼區(qū)核苷酸序列差異性較大，類似數(shù)據(jù)差異在同為Potyvirus的馬鈴薯Y病毒Potato virus Y（PVY）全基因組序列一致性比對分析中也有發(fā)現(xiàn)，并且研究已表明這種數(shù)據(jù)差異是由PVY不同株系重組造成的[16]，據(jù)此推斷，Jilin-gzl分離物的形成也可能與不同SPVG分離物的重組有關(guān)。其次，在Jilin-gzl與WT325和AI的比較中發(fā)現(xiàn)，Jilin-gzl與這兩個分離物在全基因組水平上序列差異較大，同時在系統(tǒng)發(fā)育樹中也發(fā)現(xiàn)WT325和AI這兩個分離物與Jilin-gzl系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系較遠，因此，SPVG可能存在多種株系。除此之外，本試驗基于SPVG全基因組序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，相較單基因序列建樹，全基因組序列建樹能夠從基因組水平上，更準確地探究不同分離物之間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系。

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（責任編輯：田 喆）

收稿日期： 20190402?? 修訂日期： 20190601

基金項目：國家重點研發(fā)計劃（2017YFD0201604）;吉林省農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新工程（CXGC2017JQ021）;吉林省農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系馬鈴薯（甘薯）綜合栽培技術(shù)示范與推廣（2018）

致? 謝： 參加本試驗部分工作的還有江代禮、譚翰杰、張能和紀燁斌等同學，特此一并致謝。

通信作者?E-mail：周雪平zzhou@zju.edu.cn; 王永志yzwang@126.com

#??為并列第一作者