閆鑫磊，張宏博，韓汶熒，高智慧，汪洋，何雨

(1. 內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018；2. 內(nèi)蒙古自治區(qū)食品檢測(cè)檢驗(yàn)中心，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010090；3. 內(nèi)蒙古科鴻科技服務(wù)有限責(zé)任公司，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010010)

剛地弓形蟲(Toxoplasmagondii，T.gondii)是一種重要的人畜共患寄生蟲，其對(duì)宿主沒有選擇性，能夠寄生于幾乎所有溫血?jiǎng)游锏挠泻思?xì)胞，并給人和動(dòng)物造成嚴(yán)重的危害[1-3]。全球約三分之一的人口感染弓形蟲，我國(guó)人群弓形蟲抗體陽性率約為10.00%[4]。人感染弓形蟲可導(dǎo)致全身器官和組織異常，尤其對(duì)孕婦和新生兒危害更為嚴(yán)重[5-6]。動(dòng)物感染會(huì)導(dǎo)致動(dòng)物生殖障礙及流產(chǎn)，給畜牧業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失[7-8]；同時(shí)弓形蟲可通過動(dòng)物性產(chǎn)品直接或間接地傳播給人類，也對(duì)居民食品安全和公眾健康構(gòu)成了嚴(yán)重威脅[9-10]。

內(nèi)蒙古自治區(qū)是畜牧業(yè)大省，羊肉產(chǎn)品是當(dāng)?shù)鼐用裰饕娜馐称分?，并以其?yōu)良的肉質(zhì)暢銷各地。然而羊弓形蟲感染不僅影響當(dāng)?shù)匦竽翗I(yè)發(fā)展，還會(huì)對(duì)消費(fèi)者的食品安全造成威脅。牛羊等反芻動(dòng)物感染主要通過攝入被含有卵囊的貓糞便污染的草料、牧草和飲水[11-12]，其中羊血清陽性率明顯高于牛[13-14]。錫林郭勒盟作為內(nèi)蒙古重要的羊肉產(chǎn)品基地，目前針對(duì)該地區(qū)綿羊弓形蟲感染的系統(tǒng)報(bào)道較少。本研究深入錫林郭勒盟8個(gè)旗縣，以綿羊?yàn)檠芯繉?duì)象展開弓形蟲感染的血清學(xué)檢測(cè)，應(yīng)用間接ELISA方法檢測(cè)其弓形蟲感染率，以期為保障居民食品安全及家畜弓形蟲病的防控提供參考。

1 材料與方法

1.1 樣品采集及血清分離

綿羊血液樣品采集于錫林郭勒盟東烏珠穆沁旗、西烏珠穆沁旗、蘇尼特左旗、蘇尼特右旗、太仆寺旗、正鑲白旗、多倫縣、正藍(lán)旗等8個(gè)旗縣。樣品以5 000 r/min離心15 min，取上清轉(zhuǎn)入經(jīng)高壓滅菌的1.5 mL離心管中，編號(hào)后于-20 ℃冰箱保存待用。

1.2 試劑

綿羊弓形蟲間接ELISA抗體檢測(cè)試劑盒，購自泉州市睿信生物科技有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

每次試驗(yàn)均設(shè)空白對(duì)照1孔，陰性對(duì)照、陽性對(duì)照各3孔，其余為待檢樣品孔。提前將需要的板條在室溫中平衡20 min；在陰陽對(duì)照孔中加入試劑盒中的陰、陽性對(duì)照血清各50 μL，樣本孔中加入分離的血清上清液10 μL后，再加入樣本稀釋液40 μL，37 ℃恒溫箱中靜置45 min；其后將孔內(nèi)液體倒掉，每孔加入350 μL洗滌液，洗板機(jī)洗滌1 min，重復(fù)洗滌5次；每孔中加入HRP標(biāo)記的檢測(cè)抗體100 μL，封板膜封孔后于37 ℃恒溫箱孵育30 min。孵育結(jié)束后倒掉液體，每孔加入350 μL洗滌液，洗板機(jī)洗滌1 min，重復(fù)洗滌5次。其后每孔加入底物A、B各50 μL，37 ℃度避光孵育15 min。每孔中加入50 μL終止液，15 min內(nèi)在450 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)各孔OD值。

1.4 結(jié)果判定

在陽性對(duì)照樣本OD值≥1且陰性對(duì)照樣本OD值≤0.15的條件下，判定結(jié)果的臨界值等于陰性對(duì)照樣本的平均OD值加0.15。若被測(cè)樣的OD值大于臨界值，被測(cè)樣為陽性；若被測(cè)樣的OD值小于臨界值，被測(cè)樣為陰性；若被測(cè)樣的OD值等于臨界值則對(duì)該樣品進(jìn)行二次測(cè)定。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

利用Excel 2007建立數(shù)據(jù)庫，SPSS 23.0進(jìn)行卡方檢驗(yàn)分析，數(shù)據(jù)以感染陽性率表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 錫林郭勒盟各旗縣綿羊弓形蟲病流行病學(xué)調(diào)查情況

從錫林郭勒盟8個(gè)地區(qū)共采集樣品624份，經(jīng)弓形蟲抗體檢測(cè)，總體陽性率為12.02%。高于總體陽性率的有2個(gè)地區(qū)，其中最高為蘇尼特左旗(20.12%)；低于總體陽性率的有6個(gè)地區(qū)，其中最低為正藍(lán)旗(5.00%)。具體結(jié)果見表1。

2.2 不同性別綿羊弓形蟲病流行病學(xué)調(diào)查情況

由表2可知，所檢測(cè)的261份雄性綿羊血清中，檢測(cè)結(jié)果為陽性的有39份，陽性率為14.94%；363份雌性綿羊樣品中，陽性樣品數(shù)為36份，陽性率為9.92%。經(jīng)卡方檢驗(yàn)分析，二者無顯著性差異(P>0.05)。

表1 弓形蟲血清抗體陽性率檢測(cè)結(jié)果

地區(qū)樣品數(shù)量陽性數(shù)量陽性率/%東烏珠穆沁旗6669.09西烏珠穆沁旗70811.43蘇尼特左旗1693420.12蘇尼特右旗55712.73太仆寺旗7068.57正鑲白旗5658.93多倫縣5858.62正藍(lán)旗8045.00合計(jì)6247512.02

表2 不同性別綿羊弓形蟲感染血清學(xué)檢測(cè)結(jié)果

地區(qū)雄性雌性樣品數(shù)量陽性率/%樣品數(shù)量陽性率/%東烏珠穆沁旗329.38348.82西烏珠穆沁旗3912.82319.68蘇尼特左旗5228.8511716.24蘇尼特右旗3112.902412.50太仆寺旗3312.12375.41正鑲白旗2213.64345.88多倫縣2611.54326.25正藍(lán)旗267.69543.70合計(jì)26114.943639.92

2.3 不同飼養(yǎng)方式綿羊弓形蟲病流行病學(xué)調(diào)查情況

由表3可知，在所檢測(cè)的435份放牧綿羊樣品中，弓形蟲血清抗體陽性率為8.74%；舍飼綿羊的陽性率為19.58%。對(duì)二者陽性率進(jìn)行卡方檢驗(yàn)，顯示差異極顯著(P<0.01)。

表3 不同飼養(yǎng)方式綿羊弓形蟲感染血清學(xué)檢測(cè)結(jié)果

地區(qū)放牧舍飼樣品數(shù)量陽性率/%樣品數(shù)量陽性率/%東烏珠穆沁旗248.33429.52西烏珠穆沁旗7011.4300.00蘇尼特左旗4411.3612523.20蘇尼特右旗339.0922 18.18太仆寺旗708.5700.00正鑲白旗568.9300.00多倫縣588.6200.00正藍(lán)旗805.0000.00合計(jì)435 8.7418919.58**

注：**表示合計(jì)組陽性率差異極顯著(P<0.01)。下同

2.4 不同年齡綿羊弓形蟲感染血清學(xué)檢測(cè)

以12月齡及以上的綿羊?yàn)槌赡暄颍?2月齡以下為未成年羊。結(jié)果顯示成年羊的陽性率為15.20%；未成年羊的陽性率為8.16%。成年的綿羊弓形蟲血清抗體陽性率大于未成年綿羊，且二者差異極顯著(P<0.01)，詳細(xì)結(jié)果見表4。

表4 不同年齡綿羊弓形蟲感染血清學(xué)檢測(cè)結(jié)果

地區(qū)12月齡以下12月齡及以上樣品數(shù)量陽性率/%樣品數(shù)量陽性率/%東烏珠穆沁旗345.8832 12.50西烏珠穆沁旗326.2538 15.79蘇尼特左旗9313.9876 27.63蘇尼特右旗306.6725 20.00太仆寺旗283.5742 11.90正鑲白旗195.2637 10.81多倫縣355.7123 13.04正藍(lán)旗110.0069 5.80合計(jì)282 8.1634215.20**

2.5 不同月份綿羊弓形蟲病流行病學(xué)調(diào)查情況

由表5可知，全年每個(gè)月份均有陽性樣品檢出。其中8月感染率最高(20.83%)，1月最低(3.57%)。綜合分析發(fā)現(xiàn)春冬季節(jié)感染率較低，夏秋季節(jié)較高的趨勢(shì)，但各月份間感染率不存在顯著性差異(P>0.05)。

表5 不同月份綿羊弓形蟲感染血清學(xué)檢測(cè)結(jié)果

月份樣品數(shù)量陽性數(shù)量陽性率/%12813.5725359.43332412.547068.5756269.6862229.097811113.588481020.8391051615.241036616.67115359.43123438.82合計(jì)6247512.02

3 討論

本研究利用間接ELISA方法檢測(cè)了錫林郭勒盟8個(gè)旗縣共624份綿羊血樣。結(jié)果顯示，弓形蟲血清陽性率為12.02%。與已報(bào)道的國(guó)內(nèi)[15-17]和自治區(qū)其他地區(qū)[18-19]調(diào)查結(jié)果相比處于相對(duì)較高水平。就研究結(jié)果而言，該地區(qū)綿羊弓形蟲感染情況需引起相關(guān)單位和人員重視。

結(jié)果顯示舍飼綿羊(19.58%)弓形蟲血清陽性率極顯著高于放牧綿羊(8.74%)，造成這種情況的原因可能是由于舍飼綿羊飼養(yǎng)密度大，聚集性高，因此易發(fā)生群體性感染。同時(shí)需要指出的是，本研究所采集的舍飼綿羊樣品來自東烏珠穆沁旗、蘇尼特左旗、蘇尼特右旗3個(gè)地區(qū)，且大多數(shù)采集于蘇尼特左旗(125/189)，這是蘇尼特左旗樣品陽性率(20.12%)高于其他旗縣的一個(gè)重要原因。此外本研究發(fā)現(xiàn)年齡也是造成弓形蟲感染的風(fēng)險(xiǎn)因素之一，研究數(shù)據(jù)顯示12個(gè)月齡及以上綿羊弓形蟲感染率(15.20%)高于12個(gè)月齡以下綿羊(8.16%)，且二者呈極顯著差異。這可能是由于隨著年齡增加，動(dòng)物與外界環(huán)境接觸時(shí)間較長(zhǎng)，接觸弓形蟲卵囊的可能性隨之增加，因此感染幾率較大。最后研究發(fā)現(xiàn)錫林郭勒盟不同月份綿陽弓形蟲血清陽性率呈現(xiàn)差異，各月間雖無顯著性差異，但可明顯看出春冬季節(jié)感染率低，夏秋季節(jié)高的趨勢(shì)，說明秋冬季節(jié)為弓形蟲感染的高發(fā)時(shí)期，提示在此期間相關(guān)人員應(yīng)加強(qiáng)該疫病的防控力度。

總之，本研究結(jié)果為地區(qū)性動(dòng)物疫病防控、畜牧業(yè)發(fā)展及居民肉類食品安全保障提供了一定數(shù)據(jù)參考。錫林郭勒盟草場(chǎng)面積廣大，綿羊養(yǎng)殖量很大，但本研究樣本量有限，因此上述結(jié)果仍具有一定的局限性。為獲得更加準(zhǔn)確的數(shù)據(jù)，擴(kuò)大采樣范圍及采樣量是今后研究努力的方向。