王祺安，馬 賀，肖 炎，黎循航，2*

（1.江西農業(yè)大學生物科學與工程學院，江西南昌 330045；2.江西農業(yè)大學應用微生物研究所，江西南昌 330045）

果膠主要由雜多糖構成，是植物組織結構的重要組成部分。其主碳鏈骨架結構以1,4-糖苷鍵將α-D-半乳糖醛酸聚合而成[1]。果膠酶是已獲重要工農業(yè)應用的酶，其使用量約占商業(yè)酶產量的25%。這些酶在食品工業(yè)中有多種應用，如果汁的澄清、植物油的提取、咖啡和可可的固化、植物纖維的精制和無果膠淀粉的制造[2-4]。果膠酶由復雜多樣的果膠降解復合酶系組成，可通過不同的反應機制和作用模式水解或裂解果膠。它們可分為果膠酯酶和解聚酶，前者將果膠鏈的酯化部分皂化，而后者作用為裂解和水解果膠鏈。在復合酶系中，聚半乳糖醛酸酶是起水解作用的主要酶，可催化半乳糖醛酸α-1,4-糖苷鍵的水解斷裂[5]。聚半乳糖醛酸酶的最適pH值通常在酸性范圍內，適用于果汁、蔬菜汁和葡萄酒等的浸漬、液化、提取、澄清[6-7]，而受到廣泛關注。

果膠酶廣泛存在于高等植物中，參與某些果實成熟過程果膠物質的修飾。雖然果膠酶可從植物、動物等多種來源獲得，但只有微生物來源的果膠酶才能滿足工業(yè)化生產需求。但由于果膠酶生產成本高（培養(yǎng)基成本占總成本的30%～40%），而限制了它的應用。因此，探索利用特定微生物轉化廉價底物發(fā)酵合成胞外果膠酶成為一種有意義的嘗試[8]。許多研究表明，絲狀真菌是產生聚半乳糖醛酸酶的主要微生物，如黑曲霉（Aspergillus niger）[4]、煙曲霉菌（Aspergillus fumigatus）[9]、擴展青霉（Penicillium expansum）[10]等。

現(xiàn)今，人們更加關注固態(tài)發(fā)酵方式在聚半乳糖醛酸酶生產中應用。與深層發(fā)酵相比，固態(tài)發(fā)酵具有需水量少、所需溶劑少、真菌生長條件好、產液量少、濃度高、產酶量大等優(yōu)點。這些優(yōu)勢在生物質和農工業(yè)剩余物豐富的產業(yè)中獲得了特殊的經濟利益[11]。ZHENG Z等[6]研究以蘋果渣、蔓越橘渣和草莓渣作為底物對香菇（Lentinus edodes）CY-35合成聚半乳糖醛酸酶的影響，結果表明草莓渣有利于聚半乳糖醛酸的合成。BOTELLA C等[12]研究發(fā)現(xiàn)，葡萄渣可作為唯一營養(yǎng)物質以固態(tài)發(fā)酵方式合成聚半乳糖醛酸酶，結果表明聚半乳糖醛酸外切酶活性在發(fā)酵早期快速增長，隨培養(yǎng)時間延長而逐步降低，而聚半乳糖醛酸內切酶活性恰與之相反，且后者活性受培養(yǎng)基中還原糖分解代謝阻遏調節(jié)。MACIEL M等[13]以橙皮為支持物對黑曲霉URM 5162進行固定，探索用固定床反應器篩選聚半乳糖醛酸酶產生菌的方法。為提高聚半乳糖醛酸酶合成量，SOLIS-PEREIRA S等[14]研究黑曲霉采用固態(tài)發(fā)酵和液態(tài)深層發(fā)酵方式下，不同的碳源及各個碳源的不同濃度對聚半乳糖醛酸酶合成的影響，結果表明以果膠或聚半乳糖醛酸為誘導劑，可以促進聚半乳糖醛酸酶的合成，而較高濃度的葡萄糖會抑制聚半乳糖醛酸酶。

本研究的目的是確定黑曲霉18-23以固態(tài)發(fā)酵方式轉化不同食品加工廢棄物（葡萄渣、蘋果渣和柑橘渣）合成聚半乳糖醛酸的潛力，探索可溶性碳源對該酶的誘導作用，并測定溫度和pH值對該酶活性的影響。研究表明，具有工業(yè)應用潛力的聚半乳糖醛酸酶必須具備特定條件下的結構穩(wěn)定性。這有助于酶高效穩(wěn)定的發(fā)揮催化作用，擴大其應用領域。因此，本研究將為食品加工、酶工業(yè)及微生物學領域提供有益的參考信息。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

黑曲霉（A.niger）18-23：保存于江西農業(yè)大學應用微生物研究所；葡萄渣、蘋果渣、柑橘渣：從當?shù)厥袌鲑徺I3種水果，經破碎榨汁后獲得。果渣在干燥箱中80 ℃烘至恒質量，粉碎機粉碎，過20目篩，備用。

1.1.2 化學試劑

葡萄糖、乳糖、半乳糖、硫酸銨、檸檬酸、硝酸、檸檬酸鈉、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、氫氧化鈉、3,5-二硝基水楊酸（3,5-dinitrosalicylic acid，DNS）（均為分析純）：國藥集團化學試劑有限公司；槐糖（純度≥98%）：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；聚半乳糖醛酸（純度≥90%）、半乳糖醛酸（純度≥95%）：美國Sigma-Aldrich公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養(yǎng)基：按照文獻[15]配制。

礦物質溶液：硫酸銨0.1%，硫酸鎂0.5%，磷酸二氫鉀0.5%，硫酸亞鐵0.000 5%，pH 5。

1.2 儀器與設備

DHG-9030A鼓風干燥箱：上海一恒科學儀器有限公司；FW-200高速萬能粉碎機：常州市華怡儀器制造有限公司；UV-1800紫外可見光分光光度計：日本島津公司；雷磁PHSJ-4A型pH計：上海梅穎浦儀器儀表制造有限公司；H2500R-2高速冷凍離心機：湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司；HWS-12水浴鍋：上海五相儀器儀表有限公司；LC-1260Ⅱ高效液相色譜儀：美國安捷倫公司；YSD-8-13馬弗爐：上海姚氏儀器設備廠；LRH-250恒溫培養(yǎng)箱：廣東省醫(yī)療器械廠；LHS-250SC數(shù)顯恒溫恒濕培養(yǎng)箱：常州梅香儀器有限公司；BS-4G數(shù)顯振蕩培養(yǎng)箱：常州市國旺儀器制造有限公司。

1.3 方法

1.3.1 原料化學分析檢測

為了解果渣中相關成分的組成及含量，將葡萄渣、蘋果渣、柑橘渣粉碎烘干后進行以下測定：

灰分、木質素含量：按照文獻[16]的方法測定；粗蛋白含量：按照文獻[17]的方法測定；果膠含量：按照文獻[18]的方法測定；纖維素和半纖維素含量：按照文獻[19]的方法測定；聚半乳糖醛酸酶活性：按照文獻[20]的方法測定。

1.3.2 種子液制備

黑曲霉孢子懸浮液制備：將黑曲霉18-23孢子以涂布方式接種到PDA培養(yǎng)基平板上，30 ℃避光培養(yǎng)7 d，用無菌水洗脫黑曲霉孢子，無菌脫脂棉過濾，收集濾液，將濾液收集在無菌離心管中，黑曲霉孢子濃度調整至1×107～2×107個/mL，4 ℃保存。

1.3.3 固態(tài)發(fā)酵

將粉碎烘干后的葡萄渣、蘋果渣、柑橘渣分別裝入不同的500 mL三角瓶中，20 g/瓶，用礦物質溶液將果渣含水量調節(jié)至60%，121 ℃滅菌30 min。待培養(yǎng)基冷卻至室溫后，接種黑曲霉18-23孢子懸浮液，接種量為80 mL/kg，攪拌均勻，置于恒溫恒濕培養(yǎng)箱30 ℃培養(yǎng)10 d，相對濕度維持在70%。每天攪拌1次，并取樣測定聚半乳糖醛酸酶的酶活力。

1.3.4 粗酶的提取及酶活力測定

在固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)物中取1 g樣品，加入25 mL 100 mmol/L pH4.8檸檬酸鹽緩沖溶液，室溫條件下200 r/min振蕩浸提1 h，浸提液真空抽濾，濾液4 ℃、9 000×g離心20 min，上清液4 ℃保存，用于聚半乳糖醛酸酶的酶活力測定。

聚半乳糖酸酶酶活定義：在測試條件下，每分鐘產生1 μmol半乳糖醛酸所需酶的數(shù)量為1個酶活力單位（U/mL）。固態(tài)發(fā)酵酶活力用每克干培養(yǎng)基中的U表示（U/g）。相對酶活性定義為聚半乳糖醛酸酶經過不同溫度或pH緩沖液處理后酶活力與最適條件酶活力比值×100%。

1.3.5 半乳糖醛酸標準曲線的繪制

用半乳糖醛酸配制標準溶液，按DNS法[21]測定各個標準溶液在波長540 nm處的吸光度值，分別以半乳糖醛酸含量（x）為橫坐標，吸光度值（y）為縱坐標繪制半乳糖醛酸標準曲線。

1.3.6 添加不同可溶性碳源對聚半乳糖醛酸酶合成影響

為測定不同可溶性碳源對聚半乳糖醛酸酶合成的影響，將葡萄糖、半乳糖、乳糖、槐糖4種可溶性碳源分別添加到柑橘渣固態(tài)基質中。其中低濃度組的添加量為0.5%，高濃度組的添加量為1.0%，以不添加可溶性碳源固態(tài)基質為對照（CK）。用礦物質溶液將果渣含水量調節(jié)至60%，121 ℃滅菌30 min。冷卻后，按80 mL/kg接種黑曲霉18-23孢子懸浮液，攪拌均勻，置于30 ℃固態(tài)發(fā)酵8 d，相對濕度維持在70%左右。每天攪拌1次，并取樣測定聚半乳糖醛酸酶的酶活力。

1.3.7 溫度對聚半乳糖醛酸酶活力和穩(wěn)定性的影響

分別在20 ℃、25 ℃、30 ℃、35 ℃、40 ℃、45 ℃、50 ℃、55 ℃、60 ℃、65 ℃、70 ℃、75 ℃、80 ℃溫度條件下，保溫酶液與1%聚半乳糖醛酸底物反應混合物（pH 4.8）20 min，測定聚半乳糖醛酸酶活力，確定聚半乳糖醛酸酶的最適溫度。粗酶液在40 ℃、45 ℃、50 ℃、55 ℃、60 ℃溫度條件下，水浴保溫30 min和60 min后，測定聚半乳糖醛酸酶粗酶液熱穩(wěn)定性，并計算相對酶活。

1.3.8 pH值對聚半乳糖醛酸酶活力和穩(wěn)定性的影響

測定pH值分別為3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0條件下聚半乳糖醛酸酶活力，確定聚半乳糖醛酸酶的最適pH。粗酶液在不同pH值（3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0）的緩沖液于30 ℃水浴保溫2 h，測定聚半乳糖醛酸酶pH穩(wěn)定性并計算相對酶活。

1.3.9 數(shù)據(jù)處理

所有樣品一式3份，結果用均數(shù)±標準差表示。采用單因素方差分析（analysis of variance，ANOVA），并在5%的顯著水平上進行Tukey檢驗，采用Origin8.5作圖。

2 結果與分析

2.1 原料化學成分分析

三種果渣化學成分檢測結果見表1。

表1 3種果渣化學成分分析結果Table 1 Analysis results of chemical compositions of three kinds of pomaces

由表1可知，葡萄渣、蘋果渣和柑橘渣的化學組成中，灰分、粗蛋白、果膠、木質素、纖維素、半纖維素含量差異顯著（P＜0.05）。葡萄渣的粗蛋白含量為（11.1±0.1）g/100 g，顯著高于蘋果渣（4.6±0.3）g/100 g和柑橘渣（8.1±0.2）g/100 g（P＜0.05）；而蘋果渣和柑橘渣的纖維素含量接近，分別為（15.3±0.2）g/100 g和（16.9±0.4）g/100 g，顯著高于葡萄渣（P＜0.05）。葡萄渣木質素含量最高為（38.7±0.4）g/100 g，其次為蘋果渣（15.2±0.3）g/100 g，而柑橘渣最低（1.1±0.1）g/100 g。柑橘渣的半纖維素含量最高為（12.4±0.2）g/100 g，而葡萄渣和蘋果渣含量接近，分別為（4.5±0.2）g/100 g和（4.7±0.1）g/100 g。果渣中的纖維素、半纖維素可為微生物的生長提供良好的碳源，而木質素含量高會阻礙微生物接觸纖維素和半纖維素，影響誘導水解酶的分泌而導致微生物生長緩慢[22]。從原料分析結果來看，柑橘渣的果膠、纖維素和半纖維含量最高，有利于促進微生物的生長及果膠酶的產生。

2.2 固態(tài)發(fā)酵底物對聚半乳糖醛酸酶合成的影響

黑曲霉18-23能夠在葡萄渣、蘋果渣、柑橘渣培養(yǎng)基中生長，在葡萄渣、蘋果渣、柑橘渣培養(yǎng)基上，黑曲霉18-23固態(tài)發(fā)酵過程中產胞外聚半乳糖醛酸酶情況見圖1。由圖1可知，酶活性隨著培養(yǎng)時間的延長不斷增加，增速初期較緩，中后期增速較快，發(fā)酵8 d時達到最高，繼續(xù)培養(yǎng)，酶活力下降。三種培養(yǎng)基中的聚半乳糖醛酸酶產量不同，柑橘渣中酶產量最高，其次是蘋果渣。與柑橘渣和蘋果渣相比，葡萄渣不適合聚半乳糖醛酸酶的合成。以柑橘渣和蘋果渣為發(fā)酵培養(yǎng)基所產酶活力分別為56.9U/g和42.1 U/g，分別是以葡萄渣為培養(yǎng)基所得酶活力的2.3倍和1.7倍。三種果渣中，柑橘渣和蘋果渣的果膠相對含量較高（見表1），在發(fā)酵過程中能夠誘導更多的果膠酶的產生。因此，后續(xù)選擇柑橘渣培養(yǎng)基發(fā)酵產聚半乳糖醛酸酶。

圖1 不同果渣底物對黑曲霉18-23產聚半乳糖醛酸酶的影響Fig.1 Effect of different pomace substrates on polygalacturonase production by Aspergillus niger 18-23

2.3 可溶性碳源對聚半乳糖醛酸酶合成的影響

在柑橘渣中添加不同濃度、不同種類碳源，接種黑曲霉固態(tài)發(fā)酵8 d，所產聚半乳糖醛酸酶活力結果見圖2。由圖2可知，葡萄糖對聚半乳糖醛酸酶的形成起到顯著抑制作用，隨著葡萄糖濃度從0.5%提高到1.0%，聚半乳糖醛酸酶活力從16.2 U/g降低到10.3 U/g，均顯著低于對照酶活力（53.6 U/g）（P＜0.05）。與之相反，柑橘渣培養(yǎng)基中添加1.0%乳糖后，聚半乳糖醛酸酶酶活力達到66.6 U/g，比對照顯著增加（P＜0.05）。而添加半乳糖或槐糖對聚半乳糖醛酸酶的合成并沒有促進作用。乳糖由一個半乳糖和一個葡萄糖構成，葡萄糖是單糖，極易被微生物細胞利用，它的進入會抑制細胞中誘導酶基因的表達，進而降低相應蛋白酶的合成。葡萄糖或半乳糖的添加量與聚半乳糖醛酸酶合成呈負相關，乳糖主要發(fā)揮誘導作用導致聚半乳糖醛酸酶酶活力增加，而槐糖無誘導作用。

圖2 不同碳源添加量對黑曲霉18-23發(fā)酵柑橘渣產聚半乳糖醛酸酶的影響Fig.2 Effect of different carbon source addition on polygalacturonase production from citrus pomace by Aspergillus niger 18-23

2.4 溫度對聚半乳糖醛酸酶活力和穩(wěn)定性的影響

溫度對黑曲霉18-23以柑橘渣固態(tài)發(fā)酵所得的聚半乳糖醛酸酶酶活及熱穩(wěn)定性的影響結果見圖3。

圖3 溫度對黑曲霉18-23所產聚半乳糖醛酸酶的酶活（A）及熱穩(wěn)定性（B）的影響Fig.3 Effect of temperature on the enzyme activity (A) and thermal stability (B) of polygalacturonase produced by Aspergillus niger 18-23

由圖3A可知，當溫度在20～50 ℃范圍內升高，聚半乳糖醛酸酶粗酶酶活力隨之增大；當溫度為50 ℃，酶活最大，為56.3 U/g；當溫度達到60 ℃時，酶活力為41.2 U/g，仍然保持73%的酶活力；當溫度超過60 ℃之后，酶活力大幅下降，當溫度為80 ℃時，聚半乳糖醛酸酶粗酶喪失酶活性。因此，聚半乳糖醛酸酶最適溫度為50 ℃。

由圖3B可知，聚半乳糖醛酸酶在40℃和45℃保溫30 min和60 min都具有良好的穩(wěn)定性，相對酶活力均＞92%。在酶活最適溫度50 ℃條件下保溫30 min，聚半乳糖醛酸酶的熱穩(wěn)定性良好，酶的殘留活性為97%，而當保溫60 min時，相對酶活力降低約20%。55 ℃條件下保溫30 min和60 min，殘留活性分別為64%和42%。而當溫度超過60 ℃之后，酶的殘留活性急劇降低，保溫60 min后，相對酶活力僅為10%。因此，聚半乳糖醛酸酶在溫度40～50 ℃范圍熱穩(wěn)定性良好。

2.5 pH對聚半乳糖醛酸酶活力和穩(wěn)定性的影響

pH值對黑曲霉18-23所產聚半乳糖醛酸酶酶活及pH穩(wěn)定性影響結果見圖4。

圖4 pH值對黑曲霉18-23所產聚半乳糖醛酸酶的酶活（A）及pH穩(wěn)定性（B）的影響Fig.4 Effect of pH value on the enzyme activity (A) and pH stability(B)of polygalacturonase produced by Aspergillus niger 18-23

由圖4A可知，聚半乳糖醛酸酶在酸性范圍能夠維持較好的酶活力，當pH值在4.0～6.0范圍內，酶活力高于39.3 U/g；當pH值為5.5時，酶活力最大，為52.3 U/g；當pH值從4.0降至3.0時，酶活力有所降低；而當pH值＞6.5之后，酶活力顯著降低（P＜0.05）。因此，聚半乳糖醛酸酶最適pH值為5.5。

由圖4B可知，聚半乳糖醛酸酶在pH 4.0～5.5范圍之間，相對酶活力在95%以上；在pH 3.5和6.0，相對酶活力分別為80.5%和73.8%；當pH值＞7.0之后，相對酶活力喪失50%以上。因此，聚半乳糖醛酸酶在pH4.0～5.5范圍穩(wěn)定性良好。

3 結論

黑曲霉18-23具有以葡萄渣、蘋果渣和柑橘渣為底物固態(tài)發(fā)酵生產聚半乳糖醛酸酶的潛力，固態(tài)發(fā)酵可降低該酶的生產成本。3種底物中柑橘渣為最適底物，其酶活力達到56.9 U/g，為葡萄渣所產酶活力的2.3倍。

乳糖能夠誘導聚半乳糖醛酸酶的產生，酶活力達到66.6 U/g，比對照約提高24%，而槐糖、半乳糖對該酶產生無顯著作用，葡萄糖能夠抑制該酶的合成。

黑曲霉18-23所產聚半乳糖醛酸酶的粗酶最適溫度為50 ℃，最適pH值為5.5，且在溫度40～50 ℃、pH 4.0～5.5穩(wěn)定性良好，具有廣闊的推廣應用前景。