周 雯，方 穎，儲(chǔ)全根，王亞東，黃萬秋，張澳門，梁 雯，孫玉敏

(1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，安徽 合肥 230012；2.安徽中醫(yī)藥大學(xué)研究生院，安徽 合肥 230012；3.安徽中醫(yī)藥大學(xué)發(fā)展規(guī)劃處，安徽 合肥 230012；4.安徽中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院，安徽 合肥 230012)

糖尿病神經(jīng)病變是糖尿病常見的慢性并發(fā)癥，根據(jù)中國2型糖尿病防治指南，其主要分為周圍神經(jīng)病變(diabetic peripheral neuropathy，DPN)和自主神經(jīng)病變[1]。DPN好發(fā)于下肢，多不可逆轉(zhuǎn)，主要表現(xiàn)為疼痛、麻木、針刺感、蟻行感、電擊感、燒灼感、冷感、各種深淺感覺減退或缺失等感覺癥狀。其中又以累及雙側(cè)末梢神經(jīng)的感覺癥狀和自主神經(jīng)癥狀為主[2]。DPN可引起多系統(tǒng)功能障礙，故也是糖尿病患者致殘、致死的主要原因[3]，且目前西醫(yī)對其缺乏理想的治療方法[4]。DPN發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，近年來的研究逐步證實(shí)神經(jīng)生長因子(nerve growth factor，NGF)在該病發(fā)病中的作用[5]。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為DPN屬于“痹證”“血痹”“痿證”等范疇，為消渴之變證。黃芪桂枝五物湯出自《金匱要略》，有益氣通陽、和營行痹之效，該方為治“血痹”而設(shè)，亦為治療DPN的常用經(jīng)方，臨床研究也發(fā)現(xiàn)此方治療DPN安全有效[6-8]。有研究表明，黃芪桂枝五物湯可提高患者血清NGF水平[9]，提示黃芪桂枝五物湯可能是通過影響NGF mRNA的表達(dá)來發(fā)揮治療DPN的作用。本實(shí)驗(yàn)通過建立DPN大鼠模型，觀察黃芪桂枝五物湯對大鼠坐骨神經(jīng)中NGF mRNA及血清白細(xì)胞介素1β(interleukin-1β，IL-1β)、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、NGF表達(dá)水平的影響，并探討其治療DPN的可能機(jī)制。

1 材料

1.1 動(dòng)物 72只SPF級雄性健康Wistar大鼠，體質(zhì)量(160±20)g，由安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[動(dòng)物生產(chǎn)許可證號：SCXK(皖)2018-002]提供。大鼠自由攝食飲水，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，按照隨機(jī)數(shù)字表法將其分為空白對照組，模型組，黃芪桂枝五物湯高、中、低劑量組和甲鈷胺組，每組12只。

1.2 藥品 黃芪桂枝五物湯由黃芪、芍藥、桂枝各9 g，生姜18 g，大棗4枚組成，飲片由安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院提供，水煎后濃縮，含生藥量1 g/mL，4 ℃冰箱保存。甲鈷胺(批號18160118)購自北京星昊醫(yī)藥股份有限公司。

1.3 試劑 大鼠試劑盒(JYM0419Ra)、TNF-α試劑盒(JYM0419Ra)：武漢基因美科技有限公司；鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ)(批號S17049)：美國Sigma公司； SYBR qPCR SuperMix Plus(批號 0512841)：江蘇近岸蛋白質(zhì)科技有限公司； first Strand cDNA Synthesis試劑盒(批號00691399)：美國賽默飛世爾科技； DEPC水(批號 1803G26)：北京靖瑞百康生物技術(shù)有限公司；引物合成：生工生物工程上海(股份)有限公司。

1.4 儀器 GL-88B漩渦混合器：海門其林貝爾儀器制造有限公司；RT-6000酶標(biāo)儀：深圳雷杜生命科學(xué)股份有限公司；熒光定量PCR儀(PIKOREAL 96)、上樣輔助儀(10212432C)：美國賽默飛世爾科技；微孔板迷你離心機(jī)(MINI-P25)：杭州奧盛儀器有限公司；普通PCR儀(K960)：杭州晶格科學(xué)儀器有限公司。

2 方法

2.1 DPN動(dòng)物模型復(fù)制 采用高脂飲食加腹腔注射STZ方法誘導(dǎo)DPN模型[10]。6組大鼠飼養(yǎng)環(huán)境(溫度 20～22 ℃，濕度 40%～60%)相同，空白對照組以普通飼料喂養(yǎng)，保持自由攝食飲水，其余各組連續(xù)4周喂飼高脂飼料(普通飼料70%、豬油10%、蔗糖20%)和水，4周后，禁食12 h，自由飲水，于大鼠左下腹腹腔按35 mg/kg單次注射2% STZ溶液，用藥后72 h，于尾尖處取血測空腹血糖，空腹血糖≥16.7 mmol/L及觀察機(jī)械痛閾值(paw mechanical withdrawal threshold，PMWT)降低和足底熱敏反應(yīng)時(shí)間延長者作為DPN模型復(fù)制成功標(biāo)志。模型復(fù)制成功后，黃芪桂枝五物湯高、中、低劑量組每日分別采用黃芪桂枝五物湯19.40、4.85、2.43 g/kg灌胃，連續(xù)給藥12周；甲鈷胺組每日用甲鈷胺0.25 mg/kg灌胃；空白對照組和模型組每日給予等容積生理鹽水灌胃。

2.2 標(biāo)本取材 模型復(fù)制結(jié)束時(shí)，用0.3%戊巴比妥鈉麻醉大鼠，打開腹腔，腹主動(dòng)脈取血，分離血清。用彎剪剪去大鼠左后肢的被毛，露出皮膚，沿著股骨干后緣剪開皮膚、肌肉，小心剝離筋膜肌肉，暴露坐骨神經(jīng)，用玻璃分針游離坐骨神經(jīng)，剪下，放置液氮凍存。

2.3 檢測指標(biāo)

2.3.1 大鼠血清NGF、IL-1β、TNF-α水平測定 采用ELISA法測定血清中NGF、IL-1β、TNF-α水平，嚴(yán)格按照酶聯(lián)免疫分析試劑盒說明書進(jìn)行操作。

2.3.2 熒光定量PCR檢測NGF mRNA水平 以β-actin為內(nèi)參照，熒光定量PCR檢測NGF mRNA表達(dá)水平。

2.3.2.1 提取總RNA ①稱取坐骨神經(jīng)組織50～100 mg，剪碎，液氮研磨，加入1 mL Trizol勻漿。②加入0.2 mL氯仿，劇烈振蕩15 s，室溫放置5 min。③4 ℃ 12 000 r/min 離心10 min，取上清(約500 μL)，加入另一個(gè)EP管中。④加入0.5 mL預(yù)冷的異丙醇，溫和混勻，冰上孵育30 min。⑤4 ℃、12 000 r/min 離心15 min，棄去上清。⑥加入1 mL預(yù)冷的75%乙醇。4 ℃、12 000 r/min離心5 min，棄上清。⑦重復(fù)步驟⑥。⑧室溫干燥RNA沉淀，加入20～50 μL DEPC水，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3.2.2 合成引物 β-actin引物序列：上游5′-GAGCGCAAGTACTCTGTGTG-3′，下游5′-CCTGCTTGCTGATCCACATC-3′，82 bp。NGF引物序列：上游5′- CTATCCTGGCCACTCTGAGG-3′，下游5′- TTAGTCCAGTGGGCTTCAGG-3′，147 bp。由安徽欣樂生物技術(shù)有限公司設(shè)計(jì)并合成引物。依據(jù)以下步驟測定各基因mRNA的表達(dá)水平。

2.3.2.3 RT反應(yīng) ①在0.2 mL EP管中，加入總RNA(質(zhì)量為1 μg)、10 μmol/L Oligo(dT)1 μL DEPC水補(bǔ)足至11 μL，輕輕混勻，點(diǎn)動(dòng)離心。②PCR儀上65 ℃加熱5 min，立即冰浴3 min。③在上述EP管中加入5倍反應(yīng)緩沖液4.0 μL、10 mmol/L脫氧核糖核苷三磷酸混合物2 μL、核糖核酸酶抑制劑1 μL、逆轉(zhuǎn)錄酶 1 μL。④42 ℃延伸60 min； 70 ℃滅活逆轉(zhuǎn)錄酶5 min。⑤取出上述反應(yīng)液，即為cDNA，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3.2.4 熒光定量PCR反應(yīng) 取出cDNA作為熒光定量的模板，反應(yīng)體系為cDNA 1 μL、2倍SYBR Green 混合物 5 μL、引物(10 μmol/L)1 μL、無RNA酶的水 2 μL。反應(yīng)條件：預(yù)變性95 ℃，1 min；變性95 ℃，20 s；退火與延伸60 ℃，1 min，擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)后，用RQ值(2-ΔΔCt)表示待測基因mRNA的相對表達(dá)量。

3 結(jié)果

3.1 各組大鼠血清NGF、IL-1β、TNF-α水平比較 由于實(shí)驗(yàn)人員采血操作不當(dāng)，導(dǎo)致部分大鼠沒有取得血液樣本，故獲取每組數(shù)據(jù)10份。與空白對照組比較，模型組大鼠血清NGF水平降低，IL-1β、TNF-α水平升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與模型組比較，各治療組大鼠血清IL-1β、TNF-α水平顯著降低，NGF水平顯著升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。黃芪桂枝五物湯升高血清NGF，降低血清IL-1β、TNF-α的作用呈現(xiàn)明顯的劑量依賴性，以高劑量的作用最顯著。見表1。

表1 各組大鼠血清IL-1β、TNF-α、NGF水平比較

注：與空白對照組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05；與甲鈷胺組比較，△P<0.05；與黃芪桂枝五物湯高劑量組比較，◇P<0.05

3.2 各組大鼠坐骨神經(jīng)組織NGF mRNA表達(dá)水平比較 與空白對照組比較，模型組大鼠坐骨神經(jīng)NGF mRNA表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)；與模型組比較，各治療組大鼠坐骨神經(jīng)NGF mRNA表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)；黃芪桂枝五物湯升高大鼠坐骨神經(jīng)NGF mRNA表達(dá)水平的作用呈現(xiàn)劑量依賴性，以高劑量的作用最顯著。見表2。

表2 各組大鼠坐骨神經(jīng)組織NGF mRNA表達(dá)水平比較

注：與空白對照組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05；與甲鈷胺組比較，△P<0.05；與黃芪桂枝五物湯高劑量組比較，◇P<0.05

4 討論

DPN的發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚，在其發(fā)病機(jī)制研究中，氧化應(yīng)激、調(diào)控炎癥反應(yīng)和神經(jīng)營養(yǎng)素缺乏等[11]越來越引起人們的關(guān)注。大量研究表明，周圍神經(jīng)損傷后，體內(nèi)可以啟動(dòng)一系列神經(jīng)修復(fù)再生機(jī)制，產(chǎn)生多種細(xì)胞因子和神經(jīng)營養(yǎng)因子，促進(jìn)神經(jīng)的修復(fù)。DPN的發(fā)病機(jī)制可能與各種致病因素抑制周圍神經(jīng)受損后的再生修復(fù)能力有關(guān)[3]。NGF是神經(jīng)營養(yǎng)因子中最重要的生物活性分子之一，具有營養(yǎng)神經(jīng)細(xì)胞，促進(jìn)突起生長和促進(jìn)血管細(xì)胞增生的雙重生物學(xué)功效，在神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育、成熟及損傷修復(fù)期均發(fā)揮重要作用[12]。NGF在DPN中的重要作用提示，提高NGF的表達(dá)及其生物學(xué)效應(yīng)是防止和延緩DPN的重要途徑。

對DPN的治療，中醫(yī)古典文獻(xiàn)并無相關(guān)闡述。隨著現(xiàn)代醫(yī)學(xué)科技的發(fā)展，有學(xué)者提出DPN的發(fā)病癥狀與《金匱要略》中“血痹”相似，也有學(xué)者對DPN的中醫(yī)證候進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)黃芪桂枝五物湯可以有效對癥治療DPN。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為該病為氣虛血瘀、陰虛血瘀、痰瘀阻絡(luò)、肝腎虧虛所致，治療當(dāng)益氣通陽、和營行痹通絡(luò)。仝小林[13]認(rèn)為氣滯血瘀、氣血虛弱為DPN的基本病機(jī)，治療當(dāng)益氣養(yǎng)血、行氣活血通絡(luò)，其從“絡(luò)病”辨治DPN，認(rèn)為該病以涼、麻、痛、脹為主癥，以氣虛血瘀為基本病機(jī)，選用黃芪桂枝五物湯為基本方加減，獲得良好療效。朱學(xué)敏等[14]用本方治療DPN 70例，總有效率為92.1%，證明本方對改善DPN引起的肢體涼、麻、痛等癥狀效果較好。經(jīng)大量動(dòng)物實(shí)驗(yàn)亦發(fā)現(xiàn)，黃芪桂枝五物湯可改變大鼠坐骨神經(jīng)組織中神經(jīng)營養(yǎng)因子的表達(dá)含量[15]，減少DPN模型大鼠坐骨神經(jīng)中氧化應(yīng)激帶來的周圍神經(jīng)損傷[16],降低血糖[17],從而達(dá)到治療DPN的作用。研究顯示，黃芪桂枝五物湯對糖尿病大鼠周圍神經(jīng)功能的改善作用與其劑量成正比[18]。

本研究運(yùn)用RT-PCR技術(shù)，從基因及蛋白水平觀察黃芪桂枝五物湯對DPN大鼠坐骨神經(jīng)NGF mRNA的表達(dá)和血清NGF水平的影響。結(jié)果顯示，與空白對照組比較，模型組大鼠血清IL-1β、TNF-α水平上升，坐骨神經(jīng)NGF mRNA水平明顯下調(diào)，血清NGF水平下降(P<0.05)，提示糖尿病時(shí)體內(nèi)IL-1β、TNF-α上升造成的炎癥反應(yīng)及NGF減少造成的神經(jīng)組織保護(hù)和修復(fù)功能減弱，是引起DPN發(fā)生后神經(jīng)纖維不能修復(fù)的主要原因。各組藥物治療后大鼠血清IL-1β、TNF-α水平，坐骨神經(jīng)NGF mRNA水平，血清NGF水平均有不同程度的回調(diào)，血清IL-1β、TNF-α水平明顯降低，相關(guān)炎癥介質(zhì)的釋放減少，神經(jīng)組織炎癥損傷減輕。NGF mRNA基因表達(dá)水平增加，促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞修復(fù)，且各治療組與模型組相比差異顯著。本實(shí)驗(yàn)中，黃芪桂枝五物湯與西藥甲鈷胺比較，其中高劑量組與甲鈷胺組效果相當(dāng)。甲鈷胺是目前臨床上治療DPN的常用西藥，但其不良反應(yīng)的發(fā)生率可達(dá)8.2%[19]，嚴(yán)重者甚至可出現(xiàn)致命性的呼吸心跳驟停[20]。與甲鈷胺相比，黃芪桂枝五物湯臨床安全性較高。該方出自《金匱要略》，由黃芪、芍藥、桂枝、生姜、大棗五味藥物組成。方中君藥黃芪補(bǔ)氣行血。桂枝通陽益氣，既可祛除外邪，又可溫通經(jīng)絡(luò)，與黃芪相伍，共奏益氣和血、溫經(jīng)通絡(luò)之效。芍藥養(yǎng)血和營、緩急止痛，與桂枝合為臣藥，調(diào)和營衛(wèi)，共助君藥益氣行血之力。生姜助黃芪、桂枝通痹之功，為佐藥。大棗補(bǔ)中益氣、調(diào)和諸藥，可助桂枝、芍藥調(diào)和營衛(wèi)之功，為使藥?，F(xiàn)代藥理研究表明，黃芪有效成分如黃芪皂苷、黃芪多糖、黃酮類化合物具有雙向調(diào)節(jié)血糖、清除自由基、增強(qiáng)神經(jīng)生長因子、保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞的作用[21-22]。桂枝有較強(qiáng)的解痙鎮(zhèn)痛功效[24]。芍藥中主要的活性成分可通過抗炎、降血糖、解熱鎮(zhèn)痛、清除自由基等多個(gè)環(huán)節(jié)發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用[25-26]。生姜中含有豐富的黃酮類化合物，有較強(qiáng)的抗氧化、清除自由基、降糖、消炎作用[27-28]。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，黃芪桂枝五物湯可有效降低血清IL-1β、TNF-α水平，減輕周圍神經(jīng)組織炎癥損傷；可有效上調(diào)坐骨神經(jīng)NGF mRNA表達(dá)水平，升高血清NGF水平，促進(jìn)損傷神經(jīng)的修復(fù)與再生。