楊冠青，劉 娟，楊 陽，蔡春波，趙 燕，郭曉紅，曹果清，李步高，高鵬飛*

(1 山西省太谷縣畜牧獸醫(yī)局，山西 太谷 030800；2 山西農(nóng)業(yè)大學動物科技學院，山西 太谷 030801)

肉豬生產(chǎn)是我國畜牧業(yè)的中堅產(chǎn)業(yè)，加快肉豬產(chǎn)業(yè)的發(fā)展對推進畜牧業(yè)的發(fā)展、增加農(nóng)民收入以及推動社會進步有著重要的影響。我國的肉豬出欄量居世界之首，但生豬生產(chǎn)力還處于比較低的水平。近年來，隨著人們生活水平的不斷提高，消費者對豬肉的品質(zhì)及風味的要求也越來越高。畜禽肉品質(zhì)的評價指標包括嫩度、色澤、風味及多汁性等。消費者一直把嫩度作為肉質(zhì)評價最主要的指標[1]。嫩度以切割肌纖維阻力的大小來判斷。影響肉質(zhì)嫩度的因素有很多，如肌纖維的直徑、肉品質(zhì)、飼喂方式、胴體的儲存方式以及胴體不同部位的組織等[2-3]。

肌鈣蛋白(Troponin，Tn)為鈣離子結(jié)合蛋白多基因家族的成員，在細胞器轉(zhuǎn)運和肌肉收縮等多個細胞進程中都起著關鍵作用。肌鈣蛋白能夠抑制Ca2+濃度，與肌球蛋白共同調(diào)節(jié)鈣離子對肌動蛋白ATP酶的活性。肌鈣蛋白有3個亞單位，即肌鈣蛋白C、肌鈣蛋白I以及肌鈣蛋白T[4]。脊椎動物有兩種亞型的肌鈣蛋白：慢收縮亞型[Troponin C type 1 (slow)，TNNC1]和快收縮亞型[Troponin C type 2 (fast)，TNNC2][5]。TNNC2表達于快收縮骨骼肌，而TNNC1表達于慢收縮骨骼肌和心肌[6]。TNNC2被鈣離子激活于N-末端的低親和力鈣離子結(jié)合位點Ⅰ和高親和力鈣離子結(jié)合位點Ⅱ，而TNNC1僅在高親和力的鈣離子結(jié)合位點Ⅱ處與鈣離子結(jié)合[7]。田興國通過RT-PCR分析發(fā)現(xiàn)TNNC2基因僅在豬的骨骼肌(如肱二頭肌、股四頭肌和背最長肌)中表達，在其他組織中不表達或者低水平表達，該基因?qū)趋兰〉纳L、成肌細胞的分化以及肌肉的收縮起著重要的作用[8]。

新山西黑豬是由馬身豬、內(nèi)江豬、巴克夏豬和杜洛克豬經(jīng)復雜的雜交選育而育成的品種，與大白豬、長白豬和杜洛克豬等國外品種相比，具有產(chǎn)仔數(shù)多、肉品質(zhì)好以及抗逆性強等優(yōu)點。本研究選擇25日齡、70日齡和150日齡三個不同生長階段的大白豬和山西黑豬為研究對象，采用qPCR技術分析TNNC1基因和TNNC2基因在兩個豬種的肌肉組織中的表達差異，為研究豬肌肉發(fā)育的分子機理提供理論參考。

1 材料

1.1 試驗動物

本研究以大白豬和新山西黑豬為試驗動物，試驗豬統(tǒng)一飼養(yǎng)于山西省鄉(xiāng)寧縣永新康生態(tài)養(yǎng)殖有限公司。

1.2 主要試驗儀器

Mx 7500P 實時熒光定量PCR儀(美國Stratagene公司)，PCR擴增儀(型號：AB9902，美國BIO-RAD公司)，超凈工作臺(型號：BCM-1000，蘇州安泰公司)，ND-1000微量核酸蛋白測定儀(美國)，MLS-3020高溫全自動蒸汽滅菌器(型號：MLS-3020，日本三洋公司)，HERMLET 10型勻漿機(美國)，微型臺式冷凍離心機(型號：Z233MK-2，德國)；DYY-6C型電泳儀(北京)，凝膠成像系統(tǒng)(美國BIO-RAD公司)，制冰機(型號：SIM-F124，日本三洋公司)，超低溫冰箱(型號：FOMA700，美國)。

1.3 主要試驗試劑

Trizol(美國)；cDNA第一鏈合成試劑盒：PrimeScript? RT-PCR Kit(Takara公司)；實時熒光定量PCR試劑盒：SYBR?PremixEx Taq? II Kit(日本Takara公司)。乙醇和異戊醇等常規(guī)生化試劑均為分析純。

2 方法

2.1 樣本采集

分別在試驗豬25日齡(斷奶)、70日齡(保育期結(jié)束)和150日齡(快速生長期)各屠宰4頭豬(公豬和母豬各2頭)，摘取背最長肌、腰肌和股肌的肌肉組織，放入液氮中保存待用。

2.2 引物設計與合成

根據(jù)NCBI genbank中豬TNNC1基因和TNNC2基因的mRNA信息，以18S為內(nèi)參基因，應用Primer 5以及Oligo等軟件設計引物，引物委托上海生物工程有限公司合成。引物序列見表1。

2.3 qPCR反應體系及反應條件優(yōu)化

根 據(jù) SYBR?PrimeScript ? RT-PCR Kit試劑盒說明書建議的反應條件，以反轉(zhuǎn)錄合成的第一鏈cDNA進行常規(guī)梯度PCR擴增，分別篩選內(nèi)參基因和目的基因引物的最佳退火溫度和cDNA模板濃度，確定引物退火溫度后進行實時PCR檢測相應引物擴增熔解曲線、目的基因和內(nèi)參基因的擴增效率。

2.4 數(shù)據(jù)處理

將RT-PCR所得的數(shù)據(jù)導入到EXCEL表格中，采用2-ΔΔCt法計算每個基因的相對表達量，使用SPSS 統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行處理與分析，同一品種不同組織或不同時間點之間的基因表達差異采用單因素方差分析，選用鄧肯法進行多重比較；不同品種同一組織的基因表達變化采用獨立樣本t檢驗進行。使用GraphPad軟件繪制圖表。

3 結(jié)果

3.1 實時熒光定量PCR擴增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳檢測

對PCR擴增產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳后，電泳圖中的條帶整齊，無拖尾現(xiàn)象，長度符合，證明所提取的RNA具有高度的完整性與穩(wěn)定性，可用于后續(xù)的試驗操作，結(jié)果如圖1所示。

3.2 TNNC1基因在兩豬種肌肉組織中的發(fā)育性表達檢測結(jié)果

圖2為TNNC1基因在三個不同日齡大白豬和山西黑豬中的表達趨勢檢測結(jié)果。試驗中，以25日齡大白豬腰肌中TNNC1基因的表達值作為對照，采用2—ΔΔCt方法計算該基因在不同日齡的豬的三種肌肉組織中的相對表達量。

圖2中“①圖”顯示了TNNC1基因在背最長肌中的相對表達檢測結(jié)果。由該圖可知，TNNC1基因在大白豬背最長肌中的表達量隨豬日齡的增大呈下降趨勢，在山西黑豬中的表達量呈現(xiàn)較穩(wěn)定的趨勢。在大白豬上，TNNC1基因在25日齡的表達量極顯著高于70日齡和150日齡的，150日齡的表達量最低，極顯著低于70日齡的(P＜0.01)。TNNC1基因在25日齡和70日齡的大白豬中的表達量極顯著高于山西黑豬的，但在150日齡，山西黑豬的表達量顯著高于大白豬的。

圖2中“②圖”顯示了TNNC1基因在腰肌中的相對表達檢測結(jié)果。由該圖可知，TNNC1基因在大白豬腰肌中的表達量隨豬日齡的增長呈下降趨勢，在山西黑豬上的表達趨勢為先增后減。在大白豬上，TNNC1基因的表達趨勢與背最長肌的表達趨勢一致，25日齡最高，70日齡次之，150日齡最低；在山西黑豬上，TNNC1基因在70日齡的表達量極顯著高于25日齡和150日齡的(P＜0.01)。25日齡時，TNNC1基因在大白豬上的表達量顯著高于山西黑豬的；而在生長后期(70日齡和150日齡)，該基因在山西黑豬上的表達量極顯著高于大白豬的(P＜0.01)。

圖2中“③圖”顯示了TNNC1基因在股肌中的相對表達檢測結(jié)果。由該圖可知，在大白豬上，TNNC1基因在豬生長的中前期高水平表達，150上日齡時的表達量極顯著下降；然而，在山西黑豬上，TNNC1基因的表達情況則相反，在豬生長前期(25日齡)表達量極顯著低于70日齡和150日齡時的。在三個采樣點比較兩個豬種的TNNC1基因的表達量后發(fā)現(xiàn)，試驗豬25日齡時，該基因在山西黑豬上的表達量顯著低于在大白豬上的(P＜0.01)；70日齡時，該基因在兩豬種股肌中的表達量無顯著差異(P＞0.05)；150日齡時，該基因在山西黑豬上的表達量顯著高于在大白豬上的(P＜0.05)。

3.3 TNNC2基因在兩豬種肌肉組織中的發(fā)育性表達檢測結(jié)果

圖3為TNNC2基因在三個不同日齡大白豬和山西黑豬的表達趨勢檢測結(jié)果。試驗中，以25日齡大白豬腰肌中TNNC2基因的表達值作為對照，采用2—ΔΔCt方法計算該基因在不同日齡的豬的三種肌肉組織中的相對表達量。

圖3中“①圖”顯示了TNNC2基因在豬背最長肌中的相對表達檢測結(jié)果。由該圖可知，TNNC2基因在大白豬背最長肌中的表達量隨豬日齡的增長呈下降趨勢，在山西黑豬上的表達趨勢為生長前期(25日齡和70日齡)的表達量極顯著低于生長后期(150日齡)的。在大白豬上，TNNC2基因在25日齡時的表達量最高，極顯著高于70日齡和150日齡時的，其中150日齡時的表達量最低，且極顯著低于70日齡時的(P＜0.01)。TNNC2基因在25日齡和70日齡時的大白豬的表達量極顯著高于山西黑豬的，但150日齡時在山西黑豬上的表達量高于大白豬的。

圖3中“②圖”顯示了TNNC2基因在豬腰肌中的相對表達檢測結(jié)果。由該圖可知，TNNC2基因在大白豬腰肌中的表達呈現(xiàn)比較穩(wěn)定的趨勢，在山西黑豬上的表達呈先增后減的趨勢。在大白豬上，TNNC2基因的表達量在25日齡時達到最高水平，在70日齡和150日齡時較低；在山西黑豬上，TNNC2基因在70日齡時的表達量極顯著高于25日齡和150日齡時的(P＜0.01)。25日齡時，TNNC2基因在大白豬上的表達量顯著高于在山西黑豬上的，而在豬生長中后期(70日齡和150日齡)，TNNC2基因的表達情況轉(zhuǎn)變?yōu)樵谏轿骱谪i上的表達極顯著高于在大白豬上的(P＜0.01)。

圖3中“③圖”顯示了TNNC2基因在豬股肌中的相對表達量檢測結(jié)果。由該圖可知，在大白豬上，TNNC2基因在豬生長的中前期(25日齡和70日齡)呈現(xiàn)低水平表達，而在150日齡時表達量極顯著升高；在山西黑豬上，該基因在豬生長前期(25日齡)的表達量極顯著低于70日齡和150日齡時的。在三個采樣點比較TNNC2基因在兩個豬種上的表達量后發(fā)現(xiàn)：25日齡時，該基因在大白豬上的表達量顯著高于在山西黑豬上的(P＜0.01)；而70日齡時，該基因在大白豬上的表達量極顯著低于在山西黑豬上的；150日齡時，該基因在大白豬和山西黑豬的股肌中的表達量無顯著差異(P＞ 0.05)。

4 討論與結(jié)論

早期研究表明TNNC1基因僅在心肌和慢收縮性的骨骼肌中表達，而TNNC2基因只存在快速收縮性骨骼肌中[9]。但是，本試驗發(fā)現(xiàn)TNNC1基因在不同豬種各年齡段的不同肌肉組織中均有表達，但在腰肌中的表達量最高，股肌中的最低，說明腰肌含有較高水平的慢肌纖維，而股肌含有較小比例的慢肌纖維。Parmacek和Leiden的研究表明，豬TNNC1基因只在慢肌和心肌中表達，不會在腦、肺、肝、腎或者睪丸中表達[10]。本研究發(fā)現(xiàn)豬TNNC1基因在背最長肌、腰肌與股肌中的表達趨勢存在差異，表明TNNC1可作為檢測不同類型肌纖維的分子標志。

TNNC2基因能夠促進豬的肌細胞分化和骨骼肌生長[6]，被普遍認為是肉質(zhì)性狀的潛在候選基因[11]。TNNC2基因的等位基因T能顯著影響豬肉的嫩度和大理石紋，建議將等位基因T作為選育的分子標記應用于豬的肉質(zhì)選育。由于TNNC2基因通常不在心室肌細胞中表達，但在一些疾病中能夠檢測到該基因的異常表達，因此可將TNNC2基因作為心臟疾病預測的標記[12]。在無脊椎動物中，肌鈣蛋白在肝臟、胰臟、坐骨神經(jīng)、肺和眼等多個組織器官中均有表達[13]。對藍塘豬和杜洛克豬肌鈣蛋白C進行半定量分析發(fā)現(xiàn)該基因只在眼肌、肱二頭肌和股四頭肌中表達[14]。在本研究中，TNNC2基因在豬的背最長肌、腰肌和股肌中均有表達，而且在大白豬的背最長肌和山西黑豬的腰肌中表達量最高，這與田興國等的研究結(jié)果不一致[14]。

本試驗分析了TNNC1基因和TNNC2基因在不同日齡的大白豬和山西黑豬的三種肌肉組織中的表達差異，結(jié)果表明這兩個基因在不同肌肉中的表達量上存在統(tǒng)計學意義上的極顯著差異，因此它們可作為檢測肌纖維類型的分子標記，為探索豬的肌肉發(fā)育和改善肉品質(zhì)的研究提供理論參考。

參考文獻：(14篇，略)