陳翠翠,白麗娟,梁煥坤,鐘樹(shù)海,彭鳳蘭，李佳麗,李來(lái)慶*

(1.廣州優(yōu)迪生物科技股份有限公司,廣東 廣州 510000；2.廣東省微生物研究所/省部共建華南應(yīng)用微生物國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/廣東省菌種保藏與應(yīng)用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/廣東省微生物應(yīng)用新技術(shù)公共實(shí)驗(yàn)室,廣東 廣州 510663; 3.廣東粵微食用菌技術(shù)有限公司,廣東 廣州 510070；4.山東省泰安榮軍醫(yī)院，山東 泰安 271000)

0 引言

2型糖尿病占糖尿病患者的90%～95%，其高發(fā)病率和死亡率、難治愈的特點(diǎn)嚴(yán)重威脅人類(lèi)健康和生活質(zhì)量[1-2]。該病會(huì)導(dǎo)致血液中血糖含量居高不下，造成糖代謝紊亂，引發(fā)各種并發(fā)癥，導(dǎo)致機(jī)體各種組織發(fā)生損傷和功能障礙，如心血管疾病、周?chē)窠?jīng)病變、糖尿病足綜合征、視網(wǎng)膜病變和肝損傷等。其中，肝損傷較為嚴(yán)重，會(huì)形成脂肪肝甚至是肝硬化。SREBP-1c是固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白(Sterol Regulatory Element-Binding Proteins，SREBP)的異構(gòu)體，在肝臟中高表達(dá)。SCD-1，硬脂酰輔酶A去飽和酶1(steroyl-co A desaturase-1，SCD-1)的亞型，是一類(lèi)催化飽和脂肪酸形成單不飽和脂肪酸的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)跨膜蛋白，是 SREBP-1c下游的基因，在肝臟和脂肪組織富集表達(dá)[3]。有研究[4-6]表明，SREBP-1c和SCD-1可調(diào)控三酰甘油、膽固醇等脂質(zhì)的合成與吸收，異常表達(dá)將引起脂代謝的紊亂，引發(fā)肝脂肪變，在糖尿病肝臟病變發(fā)生發(fā)展過(guò)程中具有重要作用。姬松茸(AgaricusblazeiMurill)，蘑菇科蘑菇屬真菌，其多糖在延緩腫瘤病程、增強(qiáng)集體免疫功能、抗氧化、提高造血功能和保肝護(hù)肝方面具有顯著療效[7-9]。姬松茸多糖可減輕糖尿病大鼠腎組織氧自由基損傷，改善血糖及炎癥反應(yīng)，增強(qiáng)免疫功能，促進(jìn)脂肪分化，但具體的作用機(jī)制仍不明確[10-11]?；诖?，筆者在建立2型糖尿病大鼠模型的基礎(chǔ)上，觀察姬松茸多糖在調(diào)節(jié)糖尿病大鼠糖脂代謝及肝臟SREBP-1c和SCD-1 mRNA和蛋白表達(dá)的作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)大鼠為SPF級(jí)健康SD雄性大鼠，體重(190±20)g，8周齡左右，未交配，60只。購(gòu)自南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[許可證號(hào):SCXK(粵)2016-0041]。飼養(yǎng)環(huán)境：溫度(22±1)℃，濕度(55±5)%，光照條件為12 h光/暗周期，SPF級(jí)維持鼠料由廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供[粵飼證(2019)05073]，飲水及墊料經(jīng)121 ℃高壓滅菌。大鼠喂養(yǎng)在消毒后的鼠籠中，并給予自由飲水和進(jìn)食，經(jīng)1周的實(shí)驗(yàn)環(huán)境適應(yīng)之后開(kāi)始大鼠糖尿病建模實(shí)驗(yàn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

鏈脲佐菌素購(gòu)自Sigma公司；血糖(FPG)、甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所，葡萄糖檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海酶聯(lián)生物科技有限公司，ECL發(fā)光液、BCA蛋白定量試劑盒購(gòu)自江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司；全自動(dòng)生化分析儀(7020)購(gòu)自日本日立，倒置熒光顯微鏡購(gòu)自日本奧林巴斯，姬松茸多糖購(gòu)自陜西昂盛生物醫(yī)藥科技有限公司，高脂高糖飼料飼料配方參照文獻(xiàn)[12]的基礎(chǔ)上做部分調(diào)整，修改后為：65%大鼠維持飼料、10%豬油、20%蔗糖、2.5%膽固醇、2.5%蛋黃粉。

1.3 抗體

兔抗大鼠SCD-1，購(gòu)自英國(guó)ABCam公司；兔抗大鼠SREBP-1c，購(gòu)自美國(guó)Affinity公司；小鼠β-actin內(nèi)參抗體、馬抗小鼠IgG/HRP、山羊抗兔IgG/HRP購(gòu)自美國(guó)CST公司。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

姬松茸多糖配方在參考文獻(xiàn)[13]上修改為姬松茸多糖純度為50%，購(gòu)自陜西昂盛生物醫(yī)藥科技有限公司，按實(shí)驗(yàn)需要配成相應(yīng)濃度溶液。

1.4.1 大鼠糖尿病模型的制備和分組

大鼠糖尿病造模方法[12,14-15]：將大鼠(隨機(jī)數(shù)字表)分為2組(分別為A組和2型糖尿病模型組)，A組：空白對(duì)照組，10只，SPF級(jí)維持鼠料+自由飲水；2型糖尿病模型組：56只，高脂高糖飼料+自由飲水。喂養(yǎng)8周后，禁食不禁水12 h，模型組腹腔注射鏈脲佐菌素STZ(35 mg/kg)，A組注射同劑量檸檬酸-檸檬酸納緩沖液，第二天重復(fù)1次。第二次注射24 h后尾靜脈取血，檢測(cè)血糖，連續(xù)檢測(cè)3 d，若大鼠3 d的空腹血糖含量均≥11.1 mmol/L則認(rèn)為造模成功(最終造模成功的大鼠有35只)。將造模成功的大鼠(隨機(jī)數(shù)字表)分為模型組(B組)、姬松茸多糖高(C組，150 mg/kg)、中(D組，100 mg/kg)、低劑量處理組(E組，50 mg/kg)和二甲雙胍組(F組，150 mg/kg)，每組7只。姬松茸多糖處理處理方法參照文獻(xiàn)[13]，C-D組的大鼠灌胃4 mL相應(yīng)濃度姬松茸多糖濃縮液，A和B組灌胃等體積生理鹽水，每天1次，連續(xù)灌胃4周。A-F組飼料不變，自由飲水。最后一次灌胃72 h后，乙醚麻醉，腹主動(dòng)脈取血，留取三分之一用于血糖檢測(cè)，剩余血液室溫靜置20 min后，2 500 rpm離心30 min，收集血清-80 ℃保存?zhèn)溆?。取血結(jié)束后，處死，取肝臟，部分置于-80 ℃保存?zhèn)溆?，剩余部分肝臟組織至于4%多聚甲醛溶液中固定用于HE染色實(shí)驗(yàn)。

1.4.2 生化指標(biāo)檢測(cè)

采用全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定A-F組42只大鼠的空腹血糖、血清總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)的含量，具體操作步驟按試劑盒說(shuō)明進(jìn)行測(cè)定。

1.4.3 肝組織HE(Hematein Eosin)染色

染色方法[3]：取經(jīng)4%多聚甲醛溶液固定48 h后的肝臟組織，流水沖洗，酒精梯度脫水、二甲苯組織透明、浸蠟3次、石蠟包埋。修塊、切片、烤片，二甲苯脫蠟、酒精梯度脫笨、HE染色、乙醇洗脫、二甲苯透明、中性樹(shù)膠封片，鏡下觀察組織病理學(xué)改變。

1.4.4 qRT-PCR法檢測(cè)肝組織SREBP-1c和SCD-1 mRNA表達(dá)水平

使用TRIZOL試劑(Invitrogen)從大鼠肝組織中提取總RNA。通過(guò)Invitrogen設(shè)計(jì)特異性引物并合成(引物序列見(jiàn)表1)用于qRT-PCR。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)程序如下：95 ℃，5 min；95 ℃，10 s，60 ℃，34 s，40個(gè)循環(huán)；每個(gè)標(biāo)本3個(gè)復(fù)孔，以GAPDH為內(nèi)參，重復(fù)3次。

1.4.5 Western blot法檢測(cè)肝組織SREBP-1c和SCD-1蛋白表達(dá)水平

實(shí)驗(yàn)步驟[3]：肝組織液氮研磨，裂解，提取總蛋白，BCA定量蛋白濃度，每孔上量30 μg。SDS-PAGE電泳，80 V，20 min；120 V，60 min。轉(zhuǎn)膜，100 V，60 min。5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，一抗孵育過(guò)夜，洗膜3次；二抗室溫孵育2 h，洗膜3次，加ECL顯示，暗室X光膠片曝光。

表1 相關(guān)基因引物序列Tab.1 Related gene primer sequences

1.5 數(shù)據(jù)處理

采用Graphad Prism 5.0統(tǒng)計(jì)軟件(Graphad Software, Inc.)對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)、分析，用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(MEAN±SD) 表示，組間比較采用單因素方差分析(ANOVA) ，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 姬松茸多糖對(duì)大鼠空腹血糖和血脂水平的影響

由表2可見(jiàn)：與A組相比，B組FBG、TG、TC、LDL-C顯著升高，HDL-C顯著下降；C組、D組和F組FBG較B組顯著降低，HDL-C顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與B組相比，E組FBG有降低趨勢(shì)，但其差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表2 姬松茸多糖對(duì)糖尿病大鼠空腹血糖和血脂水平的影響Tab.2 Effects of Agaricus blazei Murill on FPG and blood lipid levels in rats

注:A空白對(duì)照組;B 2型糖尿病模型組;C姬松茸多糖高劑量組;D姬松茸多糖中劑量組;E姬松茸多糖低劑量組;F二甲雙胍組;*為P<0.05。

2.2 肝組織HE染色結(jié)果

由圖1可知：A組肝細(xì)胞大小均勻、肝小葉結(jié)構(gòu)規(guī)則；與A組相比，B組肝小葉結(jié)構(gòu)不清，肝細(xì)胞排布紊亂，與周?chē)?xì)胞連接松散，部分發(fā)生脂肪變性，出現(xiàn)細(xì)胞壞死；與B組相比，C組和F組，肝細(xì)胞大小均勻、少量的脂肪變性，肝小葉結(jié)構(gòu)規(guī)則；D組肝細(xì)胞大小較均勻，少量的細(xì)胞壞死，排列紊亂；E組肝小葉結(jié)構(gòu)不清，肝細(xì)胞排布紊亂，與周?chē)?xì)胞連接松散脂肪變性較少、少量細(xì)胞壞死。

注:A空白對(duì)照組;B 2型糖尿病模型組;C姬松茸多糖高劑量組;D姬松茸多糖中劑量組;E姬松茸多糖低劑量組;F二甲雙胍組圖1 大鼠肝臟HE染色結(jié)果(×400)Fig.1 The results of HE staining in rat liver

2.3 姬松茸多糖對(duì)肝組織SREBP-1c和SCD-1 mRNA的影響

由圖2可知：與A組比較，B組SREBP-1c和 SCD-1 mRNA表達(dá)明顯升高(P<0.05)；與B組相比較，C組和F組SREBP-1c和SCD-1 mRNA表達(dá)水平明顯降低(P<0.05)，D組SREBP-1c和SCD-1 mRNA的表達(dá)水平降低(P<0.05)，E組SREBP-1c和SCD-1 mRNA的表達(dá)有降低的趨勢(shì)，但沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

注:A空白對(duì)照組;B 2型糖尿病模型組;C姬松茸多糖高劑量組;D姬松茸多糖中劑量組;E姬松茸多糖低劑量組;F二甲雙胍組。圖2 qRT-PCR檢測(cè)SREBP-1c和SCD-1 mRNA表達(dá)Fig.2 The protein expression analysis of SCD-1 and SREBP-1c by Western blot

2.4 姬松茸多糖對(duì)肝組織SREBP-1c和SCD-1蛋白表達(dá)的影響

由圖3可知：與A組比較，B組SREBP-1c和 SCD-1蛋白表達(dá)明顯升高(P<0.05)；與B組相比較，C組和F組SREBP-1c和SCD-1蛋白表達(dá)水平明顯降低(P<0.05)，D組SREBP-1c和SCD-1蛋白的表達(dá)水平降低(P<0.05)，E組SREBP-1c和SCD-1蛋白的表達(dá)有降低的趨勢(shì)，但沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

注:A空白對(duì)照組;B 2型糖尿病模型組;C姬松茸多糖高劑量組;D姬松茸多糖中劑量組;E姬松茸多糖低劑量組;F二甲雙胍組。圖3 Western blot 檢測(cè)SREBP-1c和SCD-1蛋白表達(dá)Fig.3 The protein expression analysis of SCD-1 and SREBP-1c by Western blot

3 討論

目前，臨床上多采用二甲雙胍等西藥治療糖尿病，雖其降糖效果明顯，臨床應(yīng)用較為廣泛，但其治療過(guò)程中容易引起患者乳酸性酸中毒[16]。為此，越來(lái)越多的研究者們開(kāi)始尋找高效安全的天然降糖藥。楊旭東[10]、王麗娟等[13]研究顯示，姬松茸多糖對(duì)控制糖尿病病情進(jìn)展、降低血糖和脂肪分化相關(guān)蛋白具有明顯效果?；诋?dāng)前姬松茸多糖改善糖尿病預(yù)后的相關(guān)作用機(jī)制尚未研究透徹，筆者擬通過(guò)腹腔注射STZ 復(fù)制糖尿病大鼠模型，對(duì)其中部分大鼠進(jìn)行不同劑量的干預(yù)，并同時(shí)與二甲雙胍的干預(yù)效果進(jìn)行比較。結(jié)果顯示：采用姬松茸多糖干預(yù)后，低劑量組、中劑量組、高劑量組血清FBG水平均低于糖尿病模型組，且隨著姬松茸多糖劑量增加，大鼠血清中血糖改善越明顯，高劑量組血糖控制效果與二甲雙胍組相當(dāng)。提示姬松茸多糖能降低大鼠血糖水平，與國(guó)內(nèi)已有的相關(guān)報(bào)道相吻合[11,17]。

PAQUETTE A等[18]研究表明，SREBP-1c的過(guò)度表達(dá)是促進(jìn)脂質(zhì)合成的基因表達(dá)增強(qiáng)的原因，而SCD-1是一種構(gòu)成脂質(zhì)穩(wěn)態(tài)中關(guān)鍵控制點(diǎn)的酶，它催化了甘油三酯合成所需的單不飽和脂肪酸生物合成中的限速步驟。本研究HE染色結(jié)果表明，2型糖尿病模型組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)不清，肝細(xì)胞排布紊亂，部分發(fā)生脂肪變性，出現(xiàn)細(xì)胞壞死。而經(jīng)姬松茸多糖高、中劑量組和二甲雙胍干預(yù)后，肝小葉結(jié)構(gòu)清晰、肝細(xì)胞排列規(guī)則、肝臟細(xì)胞脂肪變性得到明顯改善，提示高、中劑量的姬松茸多糖能夠改善肝臟細(xì)胞脂肪變性，對(duì)肝臟具有一定的保護(hù)作用。進(jìn)一步比較各組大鼠血脂水平和肝臟SREBP-1c和SCD-1 mRNA和蛋白的表達(dá)發(fā)現(xiàn)，給藥后二甲雙胍組、姬松茸多糖高、中和低劑量組中肝臟SREBP-1c和SCD-1 mRNA和蛋白的表達(dá)降低，各藥物干預(yù)組的HDL-C水平高于糖尿病模型組，而TC、TG、LDL-C水平低于2型糖尿病模型組。MAUVOISIN D等[19]研究證實(shí)，在2型糖尿病的發(fā)生過(guò)程中，SREBP-1c高度表達(dá)，SREBP-1c轉(zhuǎn)錄因子與SCD-1啟動(dòng)子結(jié)合后，可以上調(diào)SCD-1基因的轉(zhuǎn)錄，最終導(dǎo)致脂質(zhì)合成增加，這導(dǎo)致肝臟中的積累，引起肝損傷。這提示姬松茸多糖的作用機(jī)制可能是通過(guò)降低肝臟中SREBP-1c的表達(dá)，SREBP-1c轉(zhuǎn)錄因子與SCD-1啟動(dòng)子結(jié)合后，下調(diào)SCD-1基因的轉(zhuǎn)錄進(jìn)而抑制機(jī)體脂肪酸和甘油三酯的合成，防止肝臟脂肪堆積、損傷肝臟。

綜上可見(jiàn)，姬松茸多糖高、中劑量對(duì)STZ誘導(dǎo)的2型糖尿病大鼠干預(yù)后，血糖水平、肝臟 SREBP-1c和SCD-1 表達(dá)降低，肝臟細(xì)胞脂肪變性和肝細(xì)胞壞死減少，對(duì)肝臟有一定的保護(hù)作用，在治療2型糖尿病中具有較高的應(yīng)用前景。