白春梅，土增榮，王麗媛，段瑞云

在輔助生殖技術(shù)（ART）中，薄型子宮內(nèi)膜對(duì)臨床醫(yī)師及不孕患者來說都是相當(dāng)棘手的問題。通常認(rèn)為，子宮內(nèi)膜厚度與體外受精-胚胎移植（IVF-ET）周期的妊娠率成正比[1]。當(dāng)子宮內(nèi)膜厚度≤7 mm時(shí)，即可稱為薄型子宮內(nèi)膜，此時(shí)妊娠率會(huì)明顯降低[2]，常導(dǎo)致反復(fù)種植失敗（RIF）的發(fā)生。對(duì)于此類患者的治療，國(guó)內(nèi)外許多學(xué)者進(jìn)行了大量探索性的研究。有研究表明粒細(xì)胞集落刺激因子（G-CSF）可明顯增加子宮內(nèi)膜厚度，改善子宮內(nèi)膜容受性，提高臨床妊娠率[3-4]，但仍存在爭(zhēng)議。為了提高胚胎植入率、降低流產(chǎn)率，低分子肝素（LMWH）被作為一種新的策略應(yīng)用于ART中，其具有更高的生物利用度和半衰期，有抗凝血及抗凝血酶作用，在一定程度上被認(rèn)為可改善ART妊娠結(jié)局[5-6]。本研究擬對(duì)175例凍融胚胎移植（FET）周期中的薄型子宮內(nèi)膜患者進(jìn)行相關(guān)分析，從而探索G-CSF及LMWH的臨床療效及應(yīng)用價(jià)值。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 選取2018年6月—2019年10月于山西醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院生殖中心進(jìn)行FET助孕治療的薄型子宮內(nèi)膜患者175例。向患者交代可選治療方案，并根據(jù)其意愿分為3組，A組：63例患者僅接受激素替代治療作為對(duì)照組；B組：52例患者接受激素替代治療+宮腔內(nèi)G-CSF灌注；C組：60例患者接受激素替代治療+宮腔內(nèi)G-CSF灌注+皮下注射LMWH。

1.2 納入及排除標(biāo)準(zhǔn) 納入標(biāo)準(zhǔn)：①本周期擬行FET助孕治療；②既往新鮮胚胎移植周期或FET自然周期中子宮內(nèi)膜厚度持續(xù)≤7 mm，且移植后未妊娠的患者；③年齡≤40歲；④有1個(gè)或1個(gè)以上優(yōu)質(zhì)冷凍胚胎；⑤血細(xì)胞分析及凝血功能未見異常。排除標(biāo)準(zhǔn)：①子宮內(nèi)膜息肉、黏膜下子宮肌瘤、宮腔粘連等宮腔內(nèi)占位性病變；②子宮畸形、輸卵管積水等；③合并其他內(nèi)外科疾病及精神疾病。

1.3 方法

1.3.1 A組 從月經(jīng)周期第3日起給予口服戊酸雌二醇片（補(bǔ)佳樂，1 mg/片，拜耳醫(yī)藥保健有限公司）2 mg/次，2次/d，連續(xù)5 d，之后調(diào)整劑量為3 mg/次，2次/d，每間隔2 d定期行陰道B型超聲（B超）監(jiān)測(cè)子宮內(nèi)膜厚度及血流情況，對(duì)于子宮內(nèi)膜厚度持續(xù)＜7 mm者根據(jù)患者意愿決定是否取消此次周期。當(dāng)監(jiān)測(cè)到子宮內(nèi)膜厚度達(dá)最佳狀態(tài)，血流豐富，阻力較小，且可觀察到三線征時(shí)，給予肌內(nèi)注射黃體酮注射液（20 mg/支，浙江仙琚制藥股份有限公司）40 mg轉(zhuǎn)化內(nèi)膜，補(bǔ)佳樂持續(xù)口服至移植后14 d，若血人絨毛膜促性腺激素（hCG）陰性則停藥，若血hCG陽性，持續(xù)用藥至B超可探及宮內(nèi)妊娠囊、胎芽及胎心搏動(dòng)后減藥。

1.3.2 B組 補(bǔ)佳樂及黃體酮注射液使用方法同A組，G-CSF使用方法如下。在患者簽署知情同意書后，于月經(jīng)周期第8日、第10日及第12日給予宮腔內(nèi)灌注G-CSF（瑞白，150 μg/0.9 mL，齊魯制藥有限公司），并于每次灌注前行陰道B超測(cè)量子宮內(nèi)膜厚度。對(duì)于第14日子宮內(nèi)膜厚度仍未達(dá)到7 mm的患者繼續(xù)于當(dāng)天及第16日灌注，對(duì)于第16日子宮內(nèi)膜厚度仍未達(dá)到7 mm的患者依患者自身意愿選擇是否接受此次移植，不接受的患者取消周期。灌注方法如下：囑患者排空膀胱，取膀胱截石位，常規(guī)消毒外陰、陰道，用1 mL注射器連接一次性人工授精管，抽吸0.9 mL G-CSF經(jīng)宮頸管進(jìn)入宮腔，抵達(dá)宮腔底部后輕微退回并注入藥液，術(shù)畢平臥20 min。

1.3.3 C組 補(bǔ)佳樂、瑞白及黃體酮注射液使用方法同B組，本組患者使用LMWH皮下注射，使用前患者簽署知情同意書，移植后當(dāng)天即給予皮下注射低分子肝素鈣（萬脈舒，0.4 mL：4 100AXaIU，河北常山生化藥業(yè)股份有限公司）4 100 U/次，1次/d，至移植后第14日，若血hCG陰性則停藥，若血hCG陽性，持續(xù)使用至B超可探及宮內(nèi)妊娠囊、胎芽及胎心搏動(dòng)。用藥期間需定期監(jiān)測(cè)患者凝血功能及血小板計(jì)數(shù)情況，停藥后復(fù)查肝腎功能。

1.4 觀察指標(biāo) 于月經(jīng)周期第8日（D8）及內(nèi)膜轉(zhuǎn)化日使用陰道B超（SAMSUNG MEDISON VOLUSON E8彩色多普勒超聲診斷儀）測(cè)量子宮內(nèi)膜厚度及子宮內(nèi)膜血流情況。①子宮內(nèi)膜厚度：經(jīng)陰道B超下選取內(nèi)膜最厚處測(cè)量。②子宮內(nèi)膜血流類型的測(cè)定[7]：Ⅰ型，不能監(jiān)測(cè)到子宮內(nèi)膜血流；Ⅱ型，僅可監(jiān)測(cè)到子宮內(nèi)膜下血流；Ⅲ型，可監(jiān)測(cè)到子宮內(nèi)膜及子宮內(nèi)膜下血流。③血流指數(shù)測(cè)定：經(jīng)陰道彩色多普勒超聲測(cè)量子宮內(nèi)膜搏動(dòng)指數(shù)（PI）及阻力指數(shù)（RI）。PI=（收縮期最高血流速度－舒張期末血流速度）/平均速度，RI=（收縮期最高血流速度－舒張期末血流速度）/收縮期最高血流速度。④治療結(jié)局：周期取消率＝取消周期數(shù)/所有周期數(shù)×100%，胚胎種植率＝著床胚胎數(shù)/正常胚胎移植數(shù)×100%，臨床妊娠率＝妊娠周期數(shù)/所有移植周期數(shù)×100%，早期流產(chǎn)率＝流產(chǎn)周期數(shù)/所有臨床妊娠周期數(shù)×100%，異位妊娠率＝異位妊娠周期數(shù)/所有臨床妊娠周期數(shù)×100%。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 21.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。滿足正態(tài)分布的定量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，3組間比較采用單因素方差分析，不滿足正態(tài)分布的定量資料用中位數(shù)和四分位數(shù)[M（P25，P75）]表示，3組間比較采用Kruskal-Wallis H檢驗(yàn)，組間兩兩比較采用Bonferroni校正法，組內(nèi)治療前后比較采用Wilcoxon符號(hào)秩和檢驗(yàn)；定性資料用例數(shù)（百分比）表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)或Fisher確切概率法。以α＝0.05為檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 3組患者一般情況比較 3組患者的年齡、不孕時(shí)間、體質(zhì)量指數(shù)（BMI）、不孕類型及移植D3卵裂胚胎數(shù)比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表1。

2.2 3組患者治療前后子宮內(nèi)膜厚度及子宮內(nèi)膜增加幅度的比較 3組患者治療后子宮內(nèi)膜厚度均有增厚，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。3組患者D8子宮內(nèi)膜厚度比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。3組患者內(nèi)膜轉(zhuǎn)化日的子宮內(nèi)膜厚度及子宮內(nèi)膜增加幅度比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；B、C組患者內(nèi)膜轉(zhuǎn)化日的子宮內(nèi)膜厚度及子宮內(nèi)膜增加幅度均高于A組患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），而B組與C組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表2。

2.3 3組患者治療前后子宮內(nèi)膜血流類型及血流指數(shù)的比較 3組患者D8 Ⅱ+Ⅲ型血流比例、PI、RI比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；B、C組患者治療后D8和內(nèi)膜轉(zhuǎn)化日比較Ⅱ+Ⅲ型血流比例明顯增加，PI、RI降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。3組患者內(nèi)膜轉(zhuǎn)化日Ⅱ+Ⅲ型血流比例、PI、RI比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與A組相比，B、C組Ⅱ+Ⅲ型血流比例高，PI、RI低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；B組與C組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表3。

2.4 3組患者治療結(jié)局比較 3組患者在周期取消率、臨床妊娠率、早期流產(chǎn)率、胚胎種植率方面差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），異位妊娠率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。與A組相比，B、C組周期取消率降低，臨床妊娠率及胚胎種植率增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），B、C組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。與B組相比，C組早期流產(chǎn)率降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表4。

3 討論

適宜的子宮內(nèi)膜對(duì)于妊娠起著關(guān)鍵作用。近年隨著人工流產(chǎn)等一系列宮腔內(nèi)操作的增加，薄型子宮內(nèi)膜的發(fā)病率也呈升高趨勢(shì)。大部分研究認(rèn)為在ART新鮮周期hCG日或FET周期內(nèi)膜轉(zhuǎn)化日子宮內(nèi)膜厚度≤7 mm，即可診斷為薄型子宮內(nèi)膜[2]。

雖然臨床上對(duì)于薄型子宮內(nèi)膜的治療有多種方法，例如大劑量雌激素[8]、西地那非[9]、生長(zhǎng)激素[10]、低劑量阿司匹林腸溶片[11]等，但仍有部分不孕患者存在持續(xù)低反應(yīng)性薄型子宮內(nèi)膜。2011年Gleicher等[3]首次對(duì)4例薄型子宮內(nèi)膜患者采用G-CSF宮腔灌注，結(jié)果顯示子宮內(nèi)膜厚度增加，4例患者均成功妊娠，其中1例異位妊娠。2013年Gleicher等[4]再次對(duì)21例患者進(jìn)行研究，其中48 h內(nèi)子宮內(nèi)膜未增厚的患者給予二次灌注，結(jié)果表明灌注后子宮內(nèi)膜厚度增加，臨床妊娠率相應(yīng)提高。自此大量相關(guān)研究均表明宮腔內(nèi)灌注G-CSF可明顯增加子宮內(nèi)膜厚度，并增加子宮內(nèi)膜血流灌注，降低血流阻力，從而提高臨床妊娠率及活產(chǎn)率[12-13]。但也有部分研究認(rèn)為G-CSF宮腔灌注并不能改善子宮內(nèi)膜厚度，對(duì)臨床妊娠率也無改善[14]。而LMWH被廣泛用于ART中以降低血栓前狀態(tài)復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者的早期流產(chǎn)率[5-6]，安全、有效。近年LMWH也可用于不明原因的復(fù)發(fā)性流產(chǎn)、RIF等，但療效及使用劑量尚無統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，而薄型子宮內(nèi)膜患者的RIF發(fā)病率偏高。在本研究中，G-CSF宮腔灌注可明顯提高薄型子宮內(nèi)膜患者的內(nèi)膜厚度，增加子宮內(nèi)膜血流灌注，降低因子宮內(nèi)膜薄而致的周期取消率，從而提高胚胎種植率和臨床妊娠率。在G-CSF灌注的基礎(chǔ)上于ET后皮下注射LMWH可在一定程度上調(diào)節(jié)此類患者的凝血功能，從而降低早期流產(chǎn)率，二者結(jié)合使用可顯著改善薄型子宮內(nèi)膜患者的妊娠結(jié)局。

表1 3組一般情況比較

表2 3組間子宮內(nèi)膜厚度的比較 [M（P25，P75）]

表3 3組間治療前后子宮內(nèi)膜血流情況的比較

表4 3組患者治療結(jié)局的比較 [%（n/n）]

G-CSF是集落刺激因子家族中的一員，可刺激中性粒細(xì)胞增殖、分化、活化，在人類生殖進(jìn)程中發(fā)揮重要作用，對(duì)整個(gè)月經(jīng)周期的子宮內(nèi)膜均具有一定的生理作用。G-CSF主要存在于正常卵泡及卵巢表面的顆粒細(xì)胞內(nèi)，隨月經(jīng)周期的進(jìn)展呈逐漸增加的趨勢(shì)，在排卵前達(dá)到高峰，可結(jié)合其特定的受體從而發(fā)揮相應(yīng)的作用，使子宮內(nèi)膜增厚[15]；也可誘導(dǎo)單核細(xì)胞轉(zhuǎn)化為巨噬細(xì)胞，發(fā)揮一定的吞噬作用，治療子宮內(nèi)膜炎癥，從而促進(jìn)子宮內(nèi)膜修復(fù)并使之增厚[16]；同時(shí)能夠促進(jìn)子宮內(nèi)膜下基底動(dòng)脈生長(zhǎng)，使內(nèi)膜營(yíng)養(yǎng)充分從而增厚[17]；也有研究表明，在胚胎著床過程中G-CSF能使子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞蛻膜化，在胚胎植入時(shí)起到一定的促進(jìn)作用[18]。

LMWH是由普通肝素經(jīng)酶化學(xué)反應(yīng)解聚而來，分子質(zhì)量較小，可與抗凝血酶結(jié)合，發(fā)揮抗凝及抗炎作用，抑制補(bǔ)體激活，參與子宮內(nèi)膜循環(huán)的調(diào)節(jié)，促進(jìn)內(nèi)膜修復(fù)、增加其血流灌注及蛻膜化過程，進(jìn)而有助于胚胎著床[19]。此外LMWH可促進(jìn)子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞中的胰島素樣生長(zhǎng)因子Ⅰ（IGF-Ⅰ）及泌乳素（PRL）的表達(dá)，抑制胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白1（IGFBP-1）的產(chǎn)生，對(duì)胚胎著床窗口期內(nèi)的子宮內(nèi)膜發(fā)育和容受性起非常重要的作用[20]。另有研究證實(shí)，LMWH可調(diào)節(jié)在胚胎著床時(shí)高度表達(dá)的表皮生長(zhǎng)因子（EGF），并與其結(jié)合，提高胚胎滋養(yǎng)層細(xì)胞的增殖及抗侵?jǐn)_能力，減少滋養(yǎng)層細(xì)胞的凋亡，促進(jìn)胚胎植入，從而降低早期流產(chǎn)率[21]。

綜上所述，在FET周期中宮腔內(nèi)灌注G-CSF對(duì)于增加子宮內(nèi)膜厚度有積極意義，并有一定的潛力改善胚胎種植率及臨床妊娠率，于移植后皮下注射LMWH對(duì)降低早期流產(chǎn)率有重要價(jià)值。但由于本次研究樣本量偏少，存在不可避免的臨床誤差及偏倚，且目前的報(bào)道尚未對(duì)G-CSF的給藥劑量及給藥時(shí)間做出明確的界定范圍及標(biāo)準(zhǔn)，所以尚需進(jìn)一步的研究證實(shí)。