鹿 禛，邱智東，王 蕾，陳江麗，金 葉

（長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，長(zhǎng)春 130117）

衰老是自然界最基本的規(guī)律之一[1]，皮膚衰老是指皮膚在外源或內(nèi)源性的因素影響下皮膚出現(xiàn)的外部形態(tài)、結(jié)構(gòu)以及功能衰退的過程。內(nèi)源性因素指的是皮膚細(xì)胞的自然衰老；而皮膚因外界環(huán)境因素或生活方式的原因而出現(xiàn)的皮膚松弛、干燥及皺紋、色斑等現(xiàn)象則被稱為皮膚老化的外源性因素，其中最主要的因素就是紫外線照射，所以外源性老化也被稱為皮膚的光老化[2]。人參為五加科人參屬多年生草本植物人參的干燥根[3]，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明，人參具有調(diào)節(jié)中樞神經(jīng)系統(tǒng)、抗衰老等作用[4-7]。

根據(jù)以上，本研究通過建立人皮膚成纖維細(xì)胞（CCC-HSF-1）衰老模型，利用蛋白質(zhì)印跡法 （Western Blot）檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白探究人參總皂苷對(duì)人皮膚成纖維細(xì)胞（CCC-HSF-1）凋亡的影響，觀察人參總皂苷能否通過影響細(xì)胞凋亡來發(fā)揮其抗衰老功效，并通過建立大鼠光老化模型，觀察人參總皂苷對(duì)紫外線引起的大鼠皮膚光老化的修復(fù)效果[8]。

1 實(shí)驗(yàn)材料

人參總皂苷（上海源葉生物有限公司）；阿霉素（DOX）（吉林大學(xué)實(shí)驗(yàn)室配置）；DMEM 高糖培養(yǎng)基（美國(guó)gibco）、PBS、胰酶（實(shí)驗(yàn)室配制）、青霉素鏈霉素雙抗（Hyclone）、胎牛血清（gibco）；Cell counting kit-8 試劑盒（博士德生物）、臺(tái)盼蘭（Solarbio）、BCA 蛋白定量試劑盒（碧云天生物）、Hoschst 33342 染色液（Solarbio）、FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit（BD PharmingenTM） ；Gapdh、BaX、Bcl-2、Cleaved-caspase3、抗體Goat anti-Mouse ISG HRP、Goat anti-RabbitISG HRP。酶標(biāo)儀（MOLECULAR DEVICES）；電泳儀（WEALTEC）；自動(dòng)細(xì)計(jì)數(shù)儀（Invitogen CountessTM）；培養(yǎng)箱（Thermo Scientofic 371）、生物安全（Thermo 1300 Series A2）柜；水浴鍋（Thermo Fisher Scientific Precision GP 05）；離心機(jī)（Thermo Scientific HERACUS MEGAFUGE ）；顯微鏡（Invitrogen By Thermo Fisher Scientific,EVOS XIL Core）；流式細(xì)胞儀（Beckman Gytoflex）；智能成像系統(tǒng)（i Bright FL1500）；全自動(dòng)細(xì)胞成像系統(tǒng)（EVOS FL Auto）；紫外輻照箱（自制）；紫外線燈管（UVA：340-40W，波長(zhǎng)范圍320～400 nm；UVB 313-40W，波長(zhǎng)范圍300～320 nm）荷蘭Philips 公司；UV-A 型紫外輻照計(jì)（北京師范大學(xué)光電儀器廠）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 將人皮膚成纖維細(xì)胞（CCC-HSF-1）接種于DMEM 高糖培養(yǎng)基（含15%胎牛血清、1%鏈霉素-青霉素）中，置于37 ℃，5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，3～4 d 以1:3 的方式傳代1 次，取第3 或第4代細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

2.2 CCK-8 法檢測(cè)不同濃度DOX 處理CCC-HSF-1 細(xì)胞的存活率 取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人皮膚成纖維細(xì)胞用胰酶消化，以每孔200 μL 細(xì)胞懸液即每孔5×103個(gè)細(xì)胞接種于96 孔板中，之后將培養(yǎng)板移入培養(yǎng)箱中，在37 ℃，5%的CO2條件下培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)良好且細(xì)胞密度達(dá)到30%～40%時(shí)吸除細(xì)胞培養(yǎng)液，分別加入不同濃度的DOX（0，0.25，0.5，1，2，4，10 μmol/L）處理12 h，按照CCK-8 試劑盒說明書處理后，用酶標(biāo)儀檢測(cè)細(xì)胞的吸光值（OD），波長(zhǎng)調(diào)整為450 nm。細(xì)胞存活率的計(jì)算公式為：細(xì)胞存活率＝（樣品組OD 值-空白組OD 值）/（對(duì)照組OD 值-空白組OD 值）×100%。

2.3 CCK-8 法檢測(cè)不同濃度DOX 和人參糖肽處理CCC-HSF-1 細(xì)胞的存活率 將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人皮膚成纖維細(xì)胞接種于96 孔板中，37 ℃孵育，待細(xì)胞生長(zhǎng)至融合狀態(tài)時(shí)，棄去原培養(yǎng)基，加不同濃度DOX（0，0.25，0.5，1，2，4，10 μmol/L）處理12 h 后，再加入濃度為1.00 mg/mL 人參總皂苷處理48 h，最后按2 中的方法計(jì)算各組細(xì)胞存活率。

2.4 Hoschst 33342 染色檢測(cè)CCC-HSF-1 細(xì)胞凋亡 取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的人皮膚成纖維CCC-HSF-1 細(xì)胞，分為空白組（不加DOX 和人參總皂苷），模型組（只加DOX 0.5 μmol/L）和給藥組（0.30 mg/mL 和1.00 mg/mL的人參總皂苷）將其以8×104/mL 接種于6 孔板中，在37 ℃，5% CO2的條件下培養(yǎng)過夜后，棄去培養(yǎng)基，在模型組和給藥組分別加入DOX 處理12 h 后，再在給藥組中加入不同濃度的人參總皂苷（0.30 mg/mL 和1.00 mg/mL）繼續(xù)培養(yǎng)48 h，之后加入1 mL Hoechst 33342 工作液，37 ℃避光孵育30 min，棄染色液，用PBS 洗滌3 次，在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞凋亡情況。

2.5 Annexin V/PI 雙染色檢測(cè)CCC-HSF-1 細(xì)胞凋亡 取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的人皮膚成纖維CCC-HSF-1 細(xì)胞接種于6 孔板中，按上2.3 的方法處理48 h 后，棄上清，用不含EDTA 胰酶消化，1 400 r/min，離心5 min，收集細(xì)胞單懸液，再用PBS 洗3 遍后，加入200 μL Binding buffer、5 μL 的Annexin V FITC 染液和5 μL PI染色液，混勻，避光，室溫孵育15 min，用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。

2.6 蛋白質(zhì)印跡法 （Western Blot）檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白 同上方式對(duì)細(xì)胞進(jìn)行分組處理，48 h 后收集細(xì)胞樣品，PBS 洗3 遍后，加入RAPI 裂解液裂解4 h 以上，120 000 r/min，離心30 min，收集上清，用BCA 蛋白濃度測(cè)定試劑盒測(cè)定蛋白濃度后，制備120 μL 的蛋白樣品。蛋白樣品用SDS 聚丙烯凝膠分離后轉(zhuǎn)至PVDF膜上，5%的脫脂奶粉封閉1.5 h，加入一抗（Gapdh、BaX、Bcl-2、Cleaved-caspase3），4 ℃孵育過夜，第二天PBST洗滌3次，加入經(jīng)辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗，37 ℃孵育1.5 h 后，洗膜，顯色。

2.7 大鼠紫外線急性損傷模型的建立

2.7.1 分組 32 只SD 大鼠，隨機(jī)分為4 組：正常對(duì)照組、模型對(duì)照組、陽性（維生素E）對(duì)照組以及人參總皂苷組。

2.7.2 動(dòng)物剃毛 分組后單籠飼養(yǎng)在專用鼠籠中，環(huán)境設(shè)施符合實(shí)驗(yàn)動(dòng)物清潔級(jí)別，溫度為20～25 ℃，濕度為40%～70%，光照符合晝夜交替。適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周后開始輻照。輻照前，參照文獻(xiàn)[9-10]對(duì)大鼠背部皮膚進(jìn)行剃毛處理，面積大約為3 cm×3 cm。

2.7.3 照射 照射前對(duì)UVA 及UVB 輻射強(qiáng)度進(jìn)行測(cè)量，37.34 J/cm2為最小紅斑量（minimum erythema quantity）。將剃毛后的大鼠放入自制的紫外線燈箱中，固定照射距離為10 cm，進(jìn)行紫外線（UVA 加UVB）照射。直至造模結(jié)束，即大鼠背部皮膚出現(xiàn)干燥，起皮，甚至局部有潰爛現(xiàn)象。

2.7.4 給藥 除正常對(duì)照組及模型對(duì)照組外，陽性對(duì)照組和人參總皂苷組分別于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物背部涂抹等濃度的維生素E 及人參總皂苷溶液，連續(xù)給藥1 周后觀察各組大鼠皮膚狀態(tài)。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 不同濃度DOX 處理CCC-HSF-1 細(xì)胞的存活率 CCK-8 結(jié)果顯示（圖1），經(jīng)DOX 處理后，與空白組相比，隨著DOX 的濃度的增加，細(xì)胞存活率明顯下降（P＜0.01），并呈現(xiàn)量效關(guān)系。

圖1 不同濃度DOX 處理CCC-HSF-1 細(xì)胞的存活率

3.2 不同濃度DOX 和人參總皂苷共同處理CCCHSF-1 細(xì)胞的存活率 由圖2 中可以看出，加入人參總皂苷后，與圖1 相比，細(xì)胞存活率明顯提高（P＜0.01)，說明人參總皂苷對(duì)DOX 損傷的CCC-HSF-1 細(xì)胞有一定的修復(fù)作用。

圖2 不同濃度DOX 和人參總皂苷共同處理CCC-HSF-1細(xì)胞的存活率

3.3 人參總皂苷對(duì)人皮膚成纖維細(xì)胞凋亡有明顯的抗凋亡活性 利用DOX建立CCC-HSF-1細(xì)胞凋亡模型。經(jīng)Hoechst 33342 染色后，在熒光顯微鏡下觀察到，空白組細(xì)胞形態(tài)規(guī)則，胞核完整，染色均勻，經(jīng)DOX處理12 h 后的模型組，細(xì)胞形態(tài)及細(xì)胞核發(fā)生改變，而加入人參總皂苷后的給藥組，鏡下可見凋亡細(xì)胞的數(shù)量明顯的減少（圖3）。

圖3 Hoechst 33342 染色的細(xì)胞凋亡結(jié)果

利用流式細(xì)胞儀對(duì)CCC-HSF-1 細(xì)胞凋亡模型進(jìn)行Annexin V/PI 雙染，結(jié)果如圖4（A-D）所示，與空白對(duì)照組相比，模型組具有明顯的細(xì)胞凋亡現(xiàn)象（18.36%）；而加入人參總皂苷修復(fù)后CCC-HSF-1 細(xì)胞的凋亡率（15.53%，9.09%）與模型組（0.5 μmol/L DOX）相比有明顯的下降（P＜0.05）。證明人參總皂苷對(duì)皮膚成纖維細(xì)胞具有明顯的抗凋亡活性。

圖4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)人參總皂苷和DOX 處理后各組CCC-HSF-1 細(xì)胞的凋亡率

3.4 人參總皂苷對(duì)凋亡相關(guān)蛋白的作用研究 利用人參糖肽處理DOX 誘導(dǎo)凋亡的CCC-HSF-1 細(xì)胞，并通過Western Blot 檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白。結(jié)果顯示，與模型組相比，各給藥組BaX、Cleaved-caspase3 蛋白水平明顯降低，Bcl-2 蛋白水平上升，證明人參總皂苷能抑制DOX 損傷所帶來的凋亡，對(duì)CCC-HSF-1 細(xì)胞有一定的修復(fù)作用。

圖5 人參總皂苷對(duì)CCC-HSF-1 細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的調(diào)控作用

3.5 人參總皂苷對(duì)紫外線照射致大鼠皮膚光老化的修復(fù)作用研究 為了檢測(cè)人參總皂苷對(duì)紫外線所致皮膚損傷的保護(hù)作用，我們建立了紫外線損傷大鼠模型。結(jié)果如圖6 所示，空白對(duì)照組大鼠剃毛，不接受紫外線照射，皮膚光滑細(xì)膩，紋理清晰，沒有明顯的紅斑和皺紋，皮膚狀態(tài)健康；模型對(duì)照組剃毛后只接受紫外線照射而不給予藥物治療，皮膚顏色變紅，皮膚發(fā)緊，起皮，有波紋狀皺紋出現(xiàn)，局部有潰爛現(xiàn)象；陽性對(duì)照組（維生素E）大鼠剃毛照射后給予陽性藥物（維生素E）治療1周后皮膚有少量起皮現(xiàn)象，有少許褶皺，略微發(fā)紅；人參總皂苷組大鼠剃毛照射后給予人參總皂苷治療1 周后皮膚有較少的起皮現(xiàn)象，接近正常對(duì)照組。通過對(duì)4 組大鼠皮膚狀態(tài)的觀察說明人參總皂苷能夠有效修復(fù)紫外線照射導(dǎo)致的皮膚損傷。

圖6 人參總皂苷對(duì)紫外線照射致大鼠皮膚急性損傷的修復(fù)作用

4 結(jié)論

衰老是生物體隨著年齡的增長(zhǎng)，機(jī)體內(nèi)組織、器官等功能退化的過程。而衰老的結(jié)果是體內(nèi)和體外共同作用的結(jié)果。皮膚同機(jī)體其他器官一樣，在內(nèi)源性和外源性因素的共同作用下，將不可避免的產(chǎn)生老化。許多中藥含有多種氨基酸、多糖、有機(jī)酸、生物堿、皂苷成分，他們具有清除自由基，增強(qiáng)抗氧化的能力，能提高皮膚膠原纖維及膠原蛋白含量，調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能，改善皮膚微循環(huán)等[11]。本研究利用DOX 建立人皮膚成纖維細(xì)胞凋亡模型，通過一系列生化實(shí)驗(yàn)，研究了人參總皂苷對(duì)人皮膚成纖維細(xì)胞凋亡的影響：人參總皂苷通過上調(diào)Bcl-2 蛋白水平，降低BaX、Cleaved-caspase3 蛋白水平來抑制由DOX 引起的細(xì)胞凋亡；通過建立大鼠紫外光老化模型，對(duì)實(shí)驗(yàn)各組大鼠皮膚狀態(tài)的觀察，可以看到人參總皂苷對(duì)紫外線造成的大鼠皮膚損傷具有較好的修復(fù)作用。