2

1.遵義醫(yī)科大學(xué)第五附屬(珠海)醫(yī)院臨床護(hù)理教研室，廣東 珠海 519100；2.遵義醫(yī)科大學(xué)藥理學(xué)教研室暨貴州省基礎(chǔ)藥理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 遵義 563000；3.遵義醫(yī)科大學(xué)珠海校區(qū)生物工程系,廣東 珠海 519041

目前，心腦血管疾病已經(jīng)成為全球人類死亡的首要原因[1-2]。高血糖、高血壓、高血脂在醫(yī)學(xué)界俗稱“三高”，三者之間可以單獨(dú)存在，也可相互依存[3]。目前這些疾病的治療通常采用單獨(dú)用藥的方法，即分別對(duì)高血壓、高血脂、高血糖進(jìn)行治療，這樣既增加了藥物使用的種類，也相應(yīng)增加了藥物的服藥量和不良反應(yīng)[4]。

臨床上用于治療高血脂的藥物根據(jù)其降低血脂的功能可以分為他汀類、貝特類、煙酸類、膽酸螯合劑、膽固醇吸收抑制劑等五大類，具體藥物有煙酸、氯貝特、普羅布考等[5]。目前普遍用于臨床的口服降糖藥,按其降糖作用的機(jī)制不同,大體分為4類:磺脲類(SU),雙胍類,α葡萄糖苷酶抑制劑和胰島素增效劑。單味中藥具有降血糖作用的有黃芪、黃精、地黃、人參、鬼箭羽、麥冬等[6]。文獻(xiàn)研究證實(shí)了多種中草藥都具有降低血糖、血脂的作用，而且毒副作用也比較少[7]。鬼針草(BidensbipinnataL.)為菊科一年生草本植物，在我國(guó)大部分地區(qū)均有廣泛分布，而且它的生長(zhǎng)周期比較短，對(duì)生態(tài)環(huán)境要求也并不嚴(yán)格，非常容易采集，是一種相對(duì)理想的和具有廣闊開發(fā)應(yīng)用前景的天然藥物[8]。據(jù)記載鬼針草具有清熱解毒、散瘀消腫的功效[9-10]。常用的鬼針草藥材為鬼針草的干燥全草，在我國(guó)民間治療糖尿病方面的應(yīng)用十分廣泛。

本課題在研究前期中經(jīng)查文獻(xiàn)得知鬼針草總黃酮(TFB)為其有效成分[11]，經(jīng)過(guò)相關(guān)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果得知鬼針草總黃酮(TFB)具有顯著降低小鼠血糖的作用[12-13]，但針對(duì)鬼針草治療高脂血癥合并高血糖的研究少見。本次研究就鬼針草醇提物對(duì)小鼠高脂血癥合并高血糖的影響進(jìn)行初步探究。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物與藥品 昆明種小白鼠70只(SPF級(jí)，20～25 g，選取日齡約42～56d)，由廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供[實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(粵)2013-0002]。

血清總膽固醇、甘油三酯、高密度膽固醇、低密度膽固醇試劑盒(南京建成生物，產(chǎn)品批號(hào)：20181022)，二甲雙胍(中美上海施貴寶制藥有限公司)，膽固醇(安徽天啟化工科技有限公司，產(chǎn)品批號(hào)：20180521)等。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 鬼針草總黃酮的提取 材料鬼針草采集于廣東珠海三灶鎮(zhèn)，由遵義醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)陳陽(yáng)教授鑒定。將已烘干的鬼針草全草2 kg放入粉碎機(jī)粉碎至粉末狀，所得藥粉放入玻璃灌中并加入六倍體積50%乙醇溶液，超聲提取3次，每次50 min。將超聲好的藥液過(guò)濾，將濾液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮并真空干燥至稠膏狀備用[14-15]，得鬼針草總黃酮12 g。

1.2.2 高脂乳劑的制備 油相的制備：稱取豬油30 g置于燒杯中，將燒杯置于磁力恒溫?cái)嚢杵鞑⒁恢睌嚢璧耐瑫r(shí)加熱到100℃后將膽固醇10 g緩慢加入，待溶化后再向其中加入1 g丙賽優(yōu)，繼續(xù)向燒杯中加入20 mL吐溫80并攪拌均勻。

水相的制備：取1個(gè)干凈燒杯加入20 mL丙二醇和30 mL蒸餾水，用磁力恒溫?cái)嚢杵骷訜嶂敝?0℃的時(shí)候向其中加入2 g脫氧膽酸鈉，將其攪拌至完全均勻便得水相。將水相與于油相震蕩至均勻混合制得高脂肪乳劑，將制得的高脂肪乳劑裝在密閉的燒杯中放入4 ℃冰箱保存[16]。

1.2.3 高脂血癥合并高血糖小鼠模型的建立 實(shí)驗(yàn)用70只小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后，70只小鼠隨機(jī)分為正常組10只和模型組60只，兩個(gè)組都用普通飼料喂養(yǎng)。模型組每天下午給予高脂乳劑0.01 mol/g灌胃的同時(shí)一次性腹腔注射1%四氧嘧啶150 mg/kg(四氧嘧啶溶于0.1 mol/L,pH4～5的檸檬酸/檸檬酸鈉緩沖液中，現(xiàn)配現(xiàn)用)[17]。正常組則灌胃同體積飲用水和腹腔注射相同量緩沖液。連續(xù)灌胃高脂乳劑30 d時(shí)、兩組動(dòng)物分別少量多次斷尾取血和毛細(xì)管眼眶采血，測(cè)得模型組血糖≥14.5 mol·L﹣1，血清TC、TG、LDL-C明顯增高，HDL-C明顯降低，說(shuō)明造模成功。

1.2.4 實(shí)驗(yàn)分組與給藥 造模成功后從模型組選出50只造模成功的小鼠，隨機(jī)分為模型組，鬼針草總黃酮高濃度組(160 mg/kg)、中濃度組(80 mg/kg)、低濃度組(40 mg/kg)，二甲雙胍+脂必妥(150 mg/kg+135 mg/kg)組，每組10只。每天按相應(yīng)劑量灌胃給藥，正常組和模型組灌胃同量飲用水。連續(xù)給藥4周。在最后一次給藥后，禁食但是不禁水12 h。

1.2.5 樣品收集與指標(biāo)檢測(cè) 處死小鼠并斷頭取血收集裝于有肝素鈉的EP管內(nèi)并用血糖儀測(cè)定各組小鼠血糖水平。

小鼠血樣4℃保存，離心(3000 rpm/10 min)，取上清液，采用TC、TG、HDL-C、LDL-C的相關(guān)試劑盒按說(shuō)明書操作檢測(cè)相應(yīng)指標(biāo)。取肝組織做HE染色。

1.2.6 病理組織學(xué)檢查 將取得的小鼠肝組織用10 %甲醛固定9～10 h后取出切取組織(組織長(zhǎng)約1～1.5 cm,厚約為0.2～0.3 cm)放入塑料筐切面朝下，全自動(dòng)脫水機(jī)脫水12 h。石蠟浸蠟包埋、定形后切片。HE 染色基本步驟，烤片20 min后進(jìn)行如下操作。

脫蠟：①二甲苯10 min(兩次)；②無(wú)水乙醇3 min(兩次)；③95%乙醇3 min，90 %乙醇3 min，80 %乙醇3 min,70 %乙醇3 min；④自來(lái)水洗1 min；

染色：①浸入蘇木素染液浸染6 min左右；②自來(lái)水洗1 min；③1%鹽酸乙醇分化2～3 s，流水沖洗5 min；④伊紅染色25～30 s；⑤自來(lái)水洗1 min；

脫水透明和封固：①70 %乙醇3～5sec；80 %乙醇3～5 s；90 %乙醇3～5 s；95 %乙醇3～5 s(兩次)；②無(wú)水乙醇2～3 s(兩次)；③中性樹膠封片。

切片形態(tài)學(xué)觀察及采圖。

2 結(jié)果

2.1 鬼針草醇提物對(duì)高血糖小鼠血糖的影響 與正常組相比，模型組小鼠血糖明顯升高(P<0.01)，表明高血糖模型造模成功。與給藥前相比、給藥后TFB高、中、低濃度及陽(yáng)性組小鼠血糖水平均顯著下降(P<0.01)。與模型組比較TFB高、中、低濃度及陽(yáng)性組小鼠血糖水平均下降(P<0.01或P<0.05)。提示 TFB高、中、低濃度具有顯著的降低血糖作用。見表1。

2.2 各組小鼠給藥前后血脂的比較 與正常組比較，模型組TC、TG、LDL-C顯著升高(P<0.01)，HDL-C顯著降低(P<0.01)，表明高脂血癥模型造模成功。與模型組比較，TFB(200、150、100 mg/kg)組能顯著降低高脂血癥小鼠 TC、TG(P<0.01)，升高 HDL-C(P<0.01或P<0.05)并降低LDL-C(P<0.01)。提示 TFB 具有顯著的降低血脂作用。見表2。

表1 各組小鼠給藥前后血糖水平的比較

注:與正常組相比,aaP<0.01；與給藥前相比,bbP<0.01；與模型組比較,ccP<0.01，cP<0.05。

表2 各組小鼠給藥前后血脂水平的比較

注：與正常組比較，aaP<0.01；與模型組比較bP<0.05，bbP<0.01。

2.3 TFB對(duì)高脂血癥小鼠肝組織病理學(xué)的影響 由圖4可知，各組小鼠的肝組織經(jīng)過(guò)HE染色后,在同倍數(shù)光學(xué)顯微鏡下觀察可知,正常對(duì)照組小鼠的肝細(xì)胞排列整齊，呈現(xiàn)放射狀，可以看見正常的細(xì)胞核結(jié)構(gòu)(圖4A)。高糖高脂模型組小鼠的肝細(xì)胞胞膜分界不清楚，可以見細(xì)胞質(zhì)中出現(xiàn)脂肪空泡，部分細(xì)胞顯現(xiàn)出脂肪變性腫大，細(xì)胞核偏離了正常的位置(圖4B)。與模型組比較，TFB(200 mg/kg、150 mg/kg、100 mg/kg)給藥組(圖4D、E、F)和陽(yáng)性組(圖4C)可以看見小鼠的肝細(xì)胞脂肪空泡明顯減少，在同樣倍數(shù)鏡檢下顯示，肝細(xì)胞體積有變小，細(xì)胞核位置基本處于正常狀態(tài)。

3 討論

高脂血癥是我國(guó)老年人群中很常見的慢性疾病、是導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化的危險(xiǎn)因素之一，它已經(jīng)成為我國(guó)現(xiàn)目前不可忽視的社會(huì)公共衛(wèi)生問(wèn)題[18-19]。為研究TFB對(duì)高血糖合并高脂血癥的影響，本實(shí)驗(yàn)采用健康SPF級(jí)小鼠作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，并以同系品小鼠作為正常對(duì)照組。通過(guò)高脂乳劑灌胃的同時(shí)一次性腹腔注射四氧嘧啶建立高脂高糖模型。

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示：鬼針草總黃酮按高、中、低3個(gè)劑量分別灌胃給藥后，與模型組相比較，血糖水平顯著性下降(P<0.01或P<0.05)。與給藥前相比給藥后都顯著性下降(P<0.01)。提示鬼針草醇提物高、中、低濃度都具有顯著的降低血糖的作用。

肝臟是合成和貯存血清總膽固醇(TC)的主要器官，甘油三酯(TG)又稱中性脂肪[20]。在臨床上根據(jù)TC和TG的量、對(duì)高脂血癥進(jìn)行分型，以TC升高為主的、定義為膽固醇型高脂血癥，以TG升高為主的、定義為甘油三酯型高脂血癥，如兩者都升高的則為混合型高脂血癥[21-22]。高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)主要由肝臟合成，具有防止動(dòng)脈粥樣硬化的危險(xiǎn)，有研究表明HDL-C水平與冠心病呈負(fù)相關(guān)[23]，TC、TG、LDL-C濃度與心腦血管的疾病發(fā)生呈正相關(guān)[24]。

在本次研究中，鬼針草醇提物按高、中、低三個(gè)劑量分別于灌胃后，與模型組比較TC、TG及LDL-C顯著性降低(P<0.01)。HDL-C顯著性升高(P<0.01或P<0.05)。提示鬼針草醇提物具有顯著降低小鼠血脂的作用。

根據(jù)肝組織病理切片HE染色的結(jié)果顯示：模型組小鼠肝細(xì)胞與正常組小鼠肝細(xì)胞相比較，模型組小鼠肝細(xì)胞出現(xiàn)脂肪空泡，細(xì)胞核的位置也偏離正常的位置。TFB(200、150、100 mg/kg)給藥組和陽(yáng)性組與模型組小鼠肝細(xì)胞的脂肪變化程度相比，脂肪空泡明顯減少，細(xì)胞體積變小、胞核基本處在正常位置處，表明TFB對(duì)小鼠肝組織的脂肪變性具有較明顯的改善作用。