李永偉 許曉娜 劉心偉 張小倩 王志盛 趙芝靜 王春霞

我們前期研究發(fā)現(xiàn)產(chǎn)KPC 酶是耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌（Carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae，CRKP）的最主要耐藥機制[1]，目前發(fā)現(xiàn)的KPC 酶有KPC1～19 共19 種，其中KPC-1 和KPC-2 完全相同，故KPC-1 名稱不再使用，其中在我國最為常見的是KPC-2，編碼KPC 的基因多位于Tn1721 的Tn3 型轉(zhuǎn)座子上，有的位于染色體或者質(zhì)粒上，可以在革蘭陰性同屬和不同屬細菌之間進行垂直或水平傳播，從而導(dǎo)致耐藥性的廣泛播散。在傳播過程中，質(zhì)粒作為載體起著重要作用，質(zhì)粒是細菌除染色體外獨立遺傳物質(zhì)，存在于細胞質(zhì)中，常為閉合環(huán)狀的雙鏈DNA，能夠自主復(fù)制，根據(jù)其傳播耐藥性的方式，分為可在細菌間進行接合轉(zhuǎn)移的R 質(zhì)粒，以及只能通過噬菌體轉(zhuǎn)導(dǎo)傳播的R質(zhì)粒，在革蘭陰性菌中，以R 質(zhì)粒多見，常能傳播數(shù)種抗菌藥物的耐藥性。

黃連素有很好的抗菌活性，對臨床分離的CRKP具有一定的抑菌作用，但其具體作用機制尚不清楚，對黃連素是否能夠消除CRKP 攜帶耐藥的R 質(zhì)粒，從而恢復(fù)其對常用抗菌藥物敏感性的相關(guān)研究較少。本研究選擇我院臨床微生物室2014年1月～2017年8月分離的82 株CRKP 中耐藥基因為KPC 且測序完整菌株19 株進行進一步的質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移試驗，探討接合性R 質(zhì)粒的存在，并將黃連素作為質(zhì)粒消除劑進行質(zhì)粒消除實驗，觀察作用效果，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗菌株選擇我院臨床微生物室2014年1月～2017年8月分離的82 株CRKP 中耐藥基因為KPC且經(jīng)測序確認的19 株耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌作為實驗菌株，選取20 株碳青霉烯類敏感肺炎克雷伯菌菌株作為對照，實驗菌株做質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移實驗，受體菌為對疊氮鈉耐藥的J53 大腸埃希氏菌（E.coli J53），由浙江大學附屬兒童醫(yī)院周明明老師惠贈。

1.2 主要設(shè)備及耗材渦旋混合器（德國Thermo）、Precisa XT220A 分析天平（瑞士Precisa）、NS-100B搖床（上海皓莊）、高壓滅菌鍋（YXQ-LS-100SII，上海博迅）、黃連素注射液（山西芮添）、MH 瓊脂（英國Oxoid）、MH 肉湯（英國Oxoid）、酵母提取物（英國Oxoid）、十二烷基硫酸鈉（Sodium Dodecyl Sulfate，SDS，華美生物）、美羅培南標準品（100mg/支，中國食品藥品檢定研究院）。

1.3 黃連素對肺炎克雷伯菌臨床分離株的MIC 測定按照《全國臨床檢驗操作規(guī)程》（第4 版）[2]推薦的微量肉湯稀釋法進行以下實驗：①取7 個滅菌玻璃試管，做好標記，在第1～6 管中各加入1ml 之前配制好的MH 肉湯，第7 管加入2ml MH 肉湯作為陰性對照；②吸取1ml 10mg/ml 的黃連素原液緩慢加入第1 管，用移液器槍頭小心吹打混勻，然后從第1管中吸取1ml 溶液加入第2 管，再次小心吹打混勻，從第2 管中吸取1ml 溶液加入第3 管，以此類推直至第5 管，第5 管內(nèi)的2ml 混合液吹打混勻后棄去1ml，第6 和第7 管中不添加藥物，第1～5 管中的中藥終濃度依次為5、2.5、1.25、0.625、0.3125mg/ml；③挑取適量隔夜培養(yǎng)的CRKP 純菌落，加入NaCl 濃度為0.45%上機專用生理鹽水配制0.5 麥氏濁度的菌懸液，再加入MH 肉湯進行100 倍稀釋，最后吸取1ml 稀釋過的菌懸液加入上述第1～6 管中，加蓋滅菌試管塞，在CO2培養(yǎng)箱中37℃孵育24h，孵育結(jié)束后用接種環(huán)轉(zhuǎn)種至哥倫比亞血平板，過夜培養(yǎng)，在經(jīng)過倍比稀釋后，仍然無細菌生長的中藥濃度作為其MIC。

1.4 質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移試驗①供體菌和受體菌活化和再活化：以KPC 陽性的CRKP 為供體菌，臨床分離全敏感高毒力肺炎克雷伯菌（Kpn）為受體菌；選取40ml 經(jīng)過高壓滅菌的三角小燒杯，提前加入10ml LB 肉湯，在哥倫比亞血平板上挑取上述菌株單個菌落，加入小燒杯，用無菌紗布密封后放入搖床，設(shè)定恒溫37℃，轉(zhuǎn)速設(shè)定為120r/min，活化14h；培養(yǎng)結(jié)束后取100μl 上述培養(yǎng)物和10ml LB 肉湯混勻（稀釋比例1∶100），放入搖床37℃，120r/min 繼續(xù)培養(yǎng)4h 進行再活化。②供受體菌接合及接合子篩選：質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移試驗的具體程序參照劉心偉等[3]方法，取上述活化后供受體菌按照4∶1（0.1ml CRKP，0.4ml 高毒力Kpn）的比例加入含有10ml LB 肉湯的滅菌三角小燒瓶中，無菌紗布密封，放置37℃隔水恒溫培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)12h；使用之前配制好的中國藍選擇培養(yǎng)基（含2μg/ml 的MEM）作為接合子篩選平板，此平板CRKP 和接合子均可生長，但所選CRKP 為粗糙型菌落，接合子為飽滿光滑型菌落，從形態(tài)上可將兩者區(qū)分，如果僅有粗糙型菌落生長，則視為實驗失敗。吸取20μl 的接合混合物稀釋10 倍后接種至含藥的中國藍篩選平板上，37℃恒溫培養(yǎng)24h，觀察有無菌落生長，并對接合子常規(guī)鑒定，用E-test 法測得其對IPM 的MIC。

1.5 黃連素對耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌R 質(zhì)粒的體外消除試驗參照劉心偉等[3]的質(zhì)粒消除實驗進行，選取1%的十二烷基硫酸鈉（SDS）作為陽性對照。

1.5.1 菌懸液配制 取15ml 無菌試管，加入5ml LB肉湯，挑取質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移試驗陽性的6 株CRKP 單個菌落，于恒溫搖床中35℃，120r/min，隔夜增菌培養(yǎng)，再活化4h 后，用上機專用生理鹽水配制3.0 麥氏濁度菌懸液（細菌濃度約為9×108個/ml）。

1.5.2 消除試驗 第1～5 管用LB 肉湯與黃連素倍比稀釋不同濃度，第6 管加入1%SDS，第7 管加LB肉湯，第6、7 管作為陽性對照，第8 管只加LB 肉湯作為陰性對照，第1～7 管加入菌懸液共同培養(yǎng)24、48、72h，然后用移液器從第1～8 管中吸取10μl，分三區(qū)劃線接種于哥倫比亞血瓊脂平板，培養(yǎng)24h 后，挑取單個菌落約300 個進行平板影印培養(yǎng)，連續(xù)影印至普通中國藍平板和含MEM 2μg/ml 的篩選中國藍平板，消除子在不含藥物的中國藍培養(yǎng)基能夠生長，而在含藥物的中國藍培養(yǎng)基不能生長，計數(shù)300 個菌落中消除子的數(shù)量，并以消除子數(shù)量/300 ×100%計算消除率。

1.6 統(tǒng)計學方法應(yīng)用SPSS 17.0 統(tǒng)計學軟件進行分析，計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，組間比較采用t檢驗，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 KPC 陽性CRKP 菌株質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移試驗結(jié)果19 株KPC 基因型陽性的CRKP 菌株，其中6 株質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移試驗陽性，占31.58%（6/19）。

2.2 藥敏試驗結(jié)果黃連素對肺炎克雷伯菌的MIC 為0.625～2.5mg/ml，其對不同耐藥程度肺炎克雷伯菌的藥物敏感性差異無統(tǒng)計學意義（t=1.89，P=0.07），見表1。

表1 黃連素對Kpn 的藥物敏感性試驗結(jié)果（±s）

Kpn 菌株 Kpn 表型 菌株數(shù)（n） MIC（mg/ml）敏感菌株 IPM（S） 20 1.00±0.59耐藥菌株 IPM（R），KPC（+） 19 1.38±0.72

2.3 黃連素對KPC 陽性CRKP 的R 質(zhì)粒消除試驗結(jié)果黃連素對6 株試驗菌株在24、48 和72h 的R質(zhì)粒消除率分別為0、3.1%和4.7%；1%SDS 在24h、48h 和72h 的R 質(zhì)粒消除率分別為1.1%、4.0%和8.1%；空白對照所有時間段質(zhì)粒消除率均為0，從而排除質(zhì)粒在復(fù)制中自行丟失的可能性。見表2、3。

表2 黃連素對KPC 陽性CRKP 菌株的R 質(zhì)粒消除率（%）

表3 1%SDS 對KPC 陽性CRKP 菌株的R 質(zhì)粒消除率（%）

3 討論

典型肺炎克雷伯菌為革蘭染色陰性，菌體粗短，兩端較平。鏡下呈現(xiàn)單個、成對或者短鏈狀。細胞外有莢膜多糖，在宿主體內(nèi)因為營養(yǎng)豐富莢膜尤為明顯，無芽孢及鞭毛，多數(shù)有菌毛。肺炎克雷伯菌抵御外界能力強，對抗菌藥物容易產(chǎn)生耐藥性，具有O 和K 兩種抗原，分別屬3 型和12 型。55℃時，30min 即能使細菌滅活，在培養(yǎng)基上可存活數(shù)月。其營養(yǎng)類型為兼性厭氧，營養(yǎng)要求低，在普通培養(yǎng)基上即能形成較大的灰白色粘液菌落。該細菌能耐受膽鹽環(huán)境，在含膽鹽的選擇性培養(yǎng)基上生長，培養(yǎng)24h 形成大菌落，48h 易融合成片，形成膠水樣菌苔。少數(shù)肺炎克雷伯菌可生長為粗糙型菌落。在血瓊脂平板上無溶血和特殊氣味產(chǎn)生。在腸道桿菌選擇性培養(yǎng)基上因為可發(fā)酵乳糖，從而呈現(xiàn)有色菌落。肺炎克雷伯菌細菌氧化酶陰性，觸酶陽性，大多數(shù)菌株可利用枸櫞酸鹽，多數(shù)菌種的尿素酶陽性或者遲緩陽性；V-P 試驗陽性；發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣，均能發(fā)酵側(cè)金盞花醇；ONPG 均為陽性。不產(chǎn)生硫化氫，也不產(chǎn)生苯丙氨酸脫氨酶及DNA 酶。可利用肌醇、鼠李糖及蔗糖作為唯一碳源，也可利用乳糖和山梨醇。不水解葡萄糖醛酸苷，不產(chǎn)生色氨酸脫氨酶及組氨酸脫氨酶。

肺炎克雷伯菌可定植在人體胃腸道以及鼻咽部，常引發(fā)多部位感染。耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌耐藥率較高，相關(guān)文獻報道CRKP 引發(fā)敗血癥的病死率可高達48%[4]。由于廣譜抗菌藥物的不合理應(yīng)用，耐藥菌株比例不斷增加，臨床治療效果差[5]。

近年來，中藥抗感染成為研究熱點，傳統(tǒng)中藥抗菌效果好，副作用小，且價格低廉，不易產(chǎn)生耐藥性，深受研究者青睞，在閱讀大量相關(guān)文獻后，本研究選取黃連素作為試驗藥物。黃連素根據(jù)提取物不同可分為硫酸小檗堿和鹽酸小檗堿，為黃連的主要成分，分子量為336，屬于異喹啉類生物堿，其價格低廉、容易取得、抗菌譜廣[6]。中國藥典記載黃連能夠抗菌消炎，有文獻報道它能夠作用于大腸埃希菌的多個位點，并且不產(chǎn)生誘導(dǎo)抗藥[7]。研究表明黃連素能夠消除質(zhì)粒、抑制細菌RNA、抑制蛋白質(zhì)以及脂質(zhì)的生物合成和糖酵解，阻止細菌細胞壁粘肽的合成，甚至直接破壞細菌超微結(jié)構(gòu)[8]。另外還能夠調(diào)節(jié)機體的免疫系統(tǒng)以及改善機體微循環(huán)，從而清除病原菌[9]。國內(nèi)也有學者對其進行體外抑菌試驗，證明黃連素對多種常見細菌均具有一定的抑制作用，并且對肺炎鏈球菌及金黃色葡萄球菌的抗菌作用甚至優(yōu)于青霉素，若黃連素與其他抗菌藥物聯(lián)合應(yīng)用效果更好[10]。本研究顯示，黃連素對肺炎克雷伯菌具有良好的抗菌效果，MIC 值為0.625～2.5mg/ml，黃連素對碳青霉烯類耐藥肺炎克雷伯菌和碳青霉烯類敏感肺炎克雷伯菌的抗菌作用無差異，目前黃連素在臨床多應(yīng)用于腸道菌群的感染，本研究結(jié)果提示可以擴大黃連素應(yīng)用范圍，輔助抗菌藥物抗菌，可取得良好的抗菌效果，因為抗菌機制本身具有復(fù)雜性，不止一個作用位點，因此不易產(chǎn)生耐藥性。

傳統(tǒng)中藥逆轉(zhuǎn)細菌耐藥性的途徑[11～13]：①消除耐藥R 質(zhì)粒；②抑制主動外排系統(tǒng)；③抑制ESBLs的產(chǎn)生；④抑制耐藥基因的表達，其中消除耐藥R質(zhì)粒為主要途徑。本研究中，采用不同濃度黃連素作為質(zhì)粒消除劑，1%SDS 作為陽性對照，另外設(shè)置空白對照以排除質(zhì)粒在傳代中自行丟失的情況，作用時間段設(shè)定為24、48、72h，通過影印方法計算消除率。雖然黃連素的消除率低于1%SDS，但由于SDS 為化學制劑，是一種能刺激皮膚的表面活性劑，只能用于試驗，不能應(yīng)用于臨床，黃連素則是清熱燥濕、瀉火解毒的常用中藥，其對CRKP 中R 質(zhì)粒有消除作用，能逆轉(zhuǎn)CRKP 耐藥性，提高其對抗菌藥物的敏感性，降低耐藥率，為中藥抗感染治療提供了實驗數(shù)據(jù)。但對不同耐藥菌株攜帶的耐藥基因尚未全面研究和評估，這也為后續(xù)進一步研究提供了思路。