劉國強 海小 羅建興

摘 要：轉(zhuǎn)基因植物的安全性一直備受關(guān)注，轉(zhuǎn)基因成分檢測是保障食品安全、維護(hù)消費者知情權(quán)的重要手段。本研究構(gòu)建并鑒定了pCry3A、pCry1A（c）、pCP4-EPSPS和pCTP2-CP4-EPSPS 4種陽性質(zhì)粒，并在轉(zhuǎn)基因棉花、轉(zhuǎn)基因大豆、轉(zhuǎn)基因小麥、轉(zhuǎn)基因玉米、非轉(zhuǎn)基因玉米中分別檢測玉米內(nèi)源基因（adh1）、抗蟲基因（Cry3A、Cry1A（c））和抗除草劑基因（CP4-EPSPS、CTP2-CP4-EPSPS），最后將轉(zhuǎn)基因棉花和轉(zhuǎn)基因大豆DNA模板原液進(jìn)行梯度稀釋確定Cry1A（c）和CP4-EPSPS的檢出限，通過檢出限檢測建立標(biāo)準(zhǔn)曲線確定此方法的轉(zhuǎn)基因成分定量檢測能力。結(jié)果表明：4種陽性質(zhì)粒鑒定結(jié)果良好，可以作為轉(zhuǎn)基因檢測的陽性對照;轉(zhuǎn)基因棉花為轉(zhuǎn)入Cry1A（c）基因的抗蟲棉;轉(zhuǎn)基因大豆為轉(zhuǎn)入CP4-EPSPS基因的抗除草劑大豆;轉(zhuǎn)基因小麥為轉(zhuǎn)入Cry1A（c）基因的抗蟲小麥;轉(zhuǎn)基因玉米為轉(zhuǎn)入Cry1A（c）、CP4-EPSPS、CTP2-CP4-EPSPS基因的混合轉(zhuǎn)基因玉米;Cry1A（c）和CP4-EPSPS的引物和探針的檢出限均可達(dá)0.1ng;建立的2種標(biāo)準(zhǔn)曲線的R2≥0.95，說明引物和探針可以滿足定量檢測要求。本研究對TaqMan實時熒光PCR法檢測植物中的轉(zhuǎn)基因成分提供一些借鑒，同時為保障食品安全、維護(hù)消費者知情權(quán)提供方法支持。

關(guān)鍵詞：轉(zhuǎn)基因玉米;陽性質(zhì)粒;檢出限;定量

中圖分類號：S-3 ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

DOI：10.19754/j.nyyjs.20200530002

轉(zhuǎn)基因植物是指把從微生物、植物和動物獲得的重要功能基因，利用生物化學(xué)方法將功能基因和調(diào)控基因表達(dá)的DNA序列組合成1個表達(dá)盒，之后通過各種轉(zhuǎn)基因技術(shù)將完整的表達(dá)盒轉(zhuǎn)移到植物基因組中進(jìn)行表達(dá)，使植物獲得抗蟲、抗除草劑、抗病、優(yōu)質(zhì)等新的農(nóng)藝性狀[1]。2016年全球種植轉(zhuǎn)基因作物面積達(dá)1.851億hm2，大豆、玉米是種植面積最大的2種轉(zhuǎn)基因作物，轉(zhuǎn)基因大豆和轉(zhuǎn)基因玉米也是我國主要進(jìn)口的轉(zhuǎn)基因糧食[2]。隨著轉(zhuǎn)基因技術(shù)的突飛猛進(jìn)，我國已經(jīng)培養(yǎng)出多種具有優(yōu)良性狀的轉(zhuǎn)基因植物，如抗蟲（轉(zhuǎn)Cry1Ab基因）[3]、抗?。ㄞD(zhuǎn)NibT基因）[4]、抗旱（轉(zhuǎn)SAMS基因）[5]、抗除草劑（轉(zhuǎn)2mG2-epsps基因）[6]等。

由于基因工程和生物技術(shù)的進(jìn)步，消費市場被越來越多的轉(zhuǎn)基因農(nóng)產(chǎn)品充斥著[7]，社會各界也越來越關(guān)注轉(zhuǎn)基因植物及其產(chǎn)品的安全性問題[8-11]。考慮到轉(zhuǎn)基因食品的安全、對消費者的保護(hù)以及對轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的管理，越來越多的國家對轉(zhuǎn)基因食品進(jìn)行立法[12]。為了與立法相一致，許多國家的監(jiān)管機構(gòu)要求提供檢測方法作為登記包含的一部分。目前，最廣泛使用同時又符合立法的檢測方法是PCR（Polymerase Chain Reaction， PCR），因為其簡單、特異、靈敏[13]。其中的實時熒光PCR通過對每個循環(huán)的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行實時監(jiān)測，實現(xiàn)對目標(biāo)DNA模板的定性和定量檢測。由于SYBR Green熒光染料PCR的缺點是包括引物二聚體在內(nèi)的任何雙鏈DNA都會在嵌入染料產(chǎn)生熒光，會出現(xiàn)假陽性[14]。而TaqMan探針提高了實時熒光PCR的擴(kuò)增效率和特異性，能夠快速并準(zhǔn)確地得到檢測結(jié)果[15]。相比之下，TaqMan實時PCR方法是轉(zhuǎn)基因檢測的最佳方案，最關(guān)鍵的是這種方法與法律相一致[16]。綜上所述，研發(fā)出科學(xué)并合理的特異性檢測轉(zhuǎn)基因植物TaqMan實時熒光PCR方法是非常必要的。

蘇云金芽孢桿菌d-內(nèi)毒素Cry3A基因[17]和Cry1A（c）基因[18]是2種比較常見的抗蟲基因，被廣泛運用于轉(zhuǎn)基因馬鈴薯和棉花中。5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶CP4-EPSPS基因[19]和含有葉綠體轉(zhuǎn)運肽的6-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶基因的構(gòu)建體CP2-CP4-EPSPS基因[20-22]是2種常見的抗除草劑基因，多數(shù)運用在大豆上。因此本研究選擇這4種基因作為轉(zhuǎn)基因成分的判定。乙醇脫氫酶adh1基因[23]作為玉米的內(nèi)源基因，用來判斷體系是否正常。因此，本研究參照標(biāo)準(zhǔn)SN/T 1204-2016[24]建立了1種特異性檢測轉(zhuǎn)Cry3A、Cry1A（c）、CP4-EPSPS和CP2-CP4-EPSPS基因植物的TaqMan實時熒光PCR方法。

1 材料與方法

1.1 樣品準(zhǔn)備

轉(zhuǎn)基因棉花、轉(zhuǎn)基因大豆、轉(zhuǎn)基因小麥、轉(zhuǎn)基因玉米、非轉(zhuǎn)基因玉米均由從事轉(zhuǎn)基因基礎(chǔ)研究的實驗室提供。將樣品進(jìn)行研磨，置于1.5mL離心管中，并保存于-4℃。

1.2 試劑

TransStart Probe qPCR SuperMix（北京全式金生物技術(shù)有限公司）;實時熒光定量PCR引物和探針合成（北京睿博興科公司）。

1.3 儀器

Eppendorf 5418R Centrifuge高速臺式離心機（德國Eppendorf AG公司）;Nanodrop 2000c核酸蛋白測定儀（美國Thermo Fisher公司）;7300plus實時熒光PCR擴(kuò)增儀（美國ABI公司）。

1.4 方法

1.4.1 引物和探針

引物與探針序列如下表1。

1.4.2 DNA提取和質(zhì)量控制

取1.1準(zhǔn)備好的植物樣品，利用溴化十六烷三甲基銨（Cetyltrimethylammonium bromide，CTAB）法[27]提取其DNA，方法如下。稱取研磨好的樣品約50mg，置于1.5mL離心管中，加入DNA裂解液800μL，旋渦混勻，65℃金屬浴30min，期間不時振蕩混勻;13000rpm離心5min，轉(zhuǎn)移上清液于潔凈離心管中，加入等體積三氯甲烷/異戊醇（24/1）混合液，充分混勻，13000rpm離心5min，取上清液于新的離心管中加入等體積的異丙醇，充分混勻，13000rpm離心5min，棄去上清液，75%乙醇洗滌1次，晾干，加入適量的滅菌ddH2O溶解，利用Nanodrop 2000c核酸蛋白分析儀測量其濃度，將母液稀釋至100ng/μL左右，保存于-20℃。

1.4.3 反應(yīng)體系與反應(yīng)條件

反應(yīng)體系（總體積20μL）：TransStart Probe qPCR SuperMix 10 μL，上下游引物各1μL，探針1μL，模板DNA1μL，補水至20μL。

反應(yīng)條件：94℃30s，1個循環(huán);94℃5s，60℃34s，40個循環(huán)，在每次循環(huán)退火時收集熒光信號。

1.4.4 陽性質(zhì)粒的構(gòu)建

通過人工合成的方法合成抗蟲基因（Cry3A、Cry1A（c））和抗除草劑基因（CP4-EPSPS、CTP2-CP4-EPSPS）的序列，連接到載體上，轉(zhuǎn)化進(jìn)感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)過PCR檢測、酶切、測序?qū)﹃栃再|(zhì)粒上插入的外源序列進(jìn)行驗證。

1.4.5 陽性質(zhì)粒的鑒定

將1.4.4提取的大腸桿菌DNA稀釋液進(jìn)行實時熒光定量PCR檢測，進(jìn)行陽性質(zhì)粒的鑒定實驗（每組2個平行）。

1.4.6 植物的鑒定

將提取好的轉(zhuǎn)基因棉花、轉(zhuǎn)基因大豆、轉(zhuǎn)基因小麥、轉(zhuǎn)基因玉米、非轉(zhuǎn)基因玉米DNA（每組2個平行）進(jìn)行玉米內(nèi)源基因（adh1）、抗蟲基因（Cry3A、Cry1A（c））和抗除草劑（CP4-EPSPS、CTP2-CP4-EPSPS）的檢測。

1.4.7 檢出限分析

從100ng/μL的轉(zhuǎn)基因棉花和轉(zhuǎn)基因大豆DNA稀釋液加滅菌ddH2O開始稀釋，每1/10稀釋1次，共稀釋7次。分別為100ng/μL、10ng/μL、1ng/μL、0.1ng/μL、0.01ng/μL、0.001ng/μL、0.0001ng/μL、0.00001ng/μL（每組3個平行），進(jìn)行檢出限檢測實驗。

1.4.8 定量分析

根據(jù)1.4.7的檢出限分析確定棉花和大豆的定量曲線，同時分析引物和探針的定量能力。

1.4.9 數(shù)據(jù)處理

利用7300 plus實時熒光PCR擴(kuò)增儀自帶分析軟件對結(jié)果進(jìn)行擴(kuò)增曲線和循環(huán)（Cycle threshold，Ct）的分析。每次實驗結(jié)果都以平行實驗的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 陽性質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定

將提取好的大腸桿菌質(zhì)粒稀釋液分別利用各自相對的抗蟲（Cry3A、Cry1A（c））和抗除草劑（CP4-EPSPS、CTP2-CP4-EPSPS）的引物和探針進(jìn)行實時熒光定量PCR實驗，陽性質(zhì)粒的檢測結(jié)果如表2所示，擴(kuò)增結(jié)果如圖1所示。由表2和圖1可以看出，陽性質(zhì)粒能夠匹配抗性基因的引物和探針，且擴(kuò)增曲線良好。擴(kuò)增結(jié)果的Ct值為15.40±0.02（pCry3A），18.52±016（pCry1A（c）），13.93±0.02（pCP4-EPSPS），16.69±0.07（pCTP2-CP4-EPSPS）。綜上所述，陽性質(zhì)粒的鑒定結(jié)果良好，可以作為轉(zhuǎn)基因檢測的陽性對照。

2.2 植物的鑒定

將轉(zhuǎn)基因棉花、轉(zhuǎn)基因大豆、轉(zhuǎn)基因小麥、轉(zhuǎn)基因玉米和非轉(zhuǎn)基因玉米的DNA，分別利用玉米內(nèi)源（adh1）、抗蟲（Cry3A、Cry1A（c））和抗除草劑（CP4-EPSPS、CTP2-CP4-EPSPS）的引物和探針進(jìn)行實時熒光定量PCR實驗，擴(kuò)增結(jié)果如表3和圖2所示，Ct值≤35判定為檢出。由表3和圖2可知，adh1基因在轉(zhuǎn)基因玉米和非轉(zhuǎn)基因玉米中均有檢出（圖2A），Ct值分別是33.89±0.04和30.01±0.15;Cry3A基因在所選植物樣品中均沒有檢出;Cry1A（c）基因在轉(zhuǎn)基因棉花、轉(zhuǎn)基因小麥和轉(zhuǎn)基因玉米中均有檢出（圖2B），Ct值分別是25.27±0.03、33.08±0.09和33.95±0.08;CP4-EPSPS基因在轉(zhuǎn)基因大豆和轉(zhuǎn)基因玉米中均有檢出，Ct值分別是32.29±0.11和33.87±0.69（圖2C）;CTP2-CP4-EPSPS只在轉(zhuǎn)基因玉米中有檢出，Ct值為33.10±0.25（圖2C）。綜上所述，轉(zhuǎn)基因棉花為轉(zhuǎn)入Cry1A（c）基因的抗蟲棉;轉(zhuǎn)基因大豆為轉(zhuǎn)入CP4-EPSPS基因的抗除草劑大豆;轉(zhuǎn)基因小麥為轉(zhuǎn)入Cry1A（c）基因的抗蟲小麥;轉(zhuǎn)基因玉米為轉(zhuǎn)入Cry1A（c）、CP4-EPSPS、CTP2-CP4-EPSPS基因的混合轉(zhuǎn)基因玉米。

2.3 檢出限分析

通過Cry1A（c）和CP4-EPSPS的引物和探針對100ng/μL、10ng/μL、1ng/μL、0.1ng/μL、0.01ng/μL、0.001ng/μL、0.0001ng/μL、0.00001ng/μL等8個不同濃度梯度的轉(zhuǎn)基因棉花樣品DNA和轉(zhuǎn)基因大豆樣品DNA進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增實驗，結(jié)果如圖3所示，具體數(shù)值如表4所示。由圖3和表4可知，稀釋至0.1ng/μL的轉(zhuǎn)基因棉花樣品DNA（圖3A）和轉(zhuǎn)基因大豆樣品DNA（圖3B）也出現(xiàn)典型擴(kuò)增曲線，且Ct值分別為34.59±0.34和34.51±0.08，以擴(kuò)增結(jié)果Ct值≤35時判定為確認(rèn)檢出，所以上述結(jié)果表明Cry1A（c）和CP4-EPSPS的引物和探針已達(dá)到檢出限度。綜上所述，Cry1A（c）和CP4-EPSPS的引物和探針的檢出限均可達(dá)0.1ng。

2.4 定量分析

利用棉花DNA和大豆DNA做標(biāo)準(zhǔn)曲線定量檢測轉(zhuǎn)基因棉花中Cry1A（c）和大豆中CP4-EPSPS的含量。根據(jù)2.3的實驗結(jié)果制作棉花（Cry1A（c））和大豆（CP4-EPSPS）定量檢測標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖4所示。所得棉花（Cry1A（c））的標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=-2.428x+47.007，R2=0.984;大豆（CP4-EPSPS）的標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=-1.246x+40.669，R2=0.96556。因為R2≥0.95，所以這2種引物和探針可以達(dá)到定量要求，即可根據(jù)此標(biāo)準(zhǔn)曲線定量檢測植物中轉(zhuǎn)基因成分的含量?？赏ㄟ^將檢測植物的相應(yīng)成分的Ct值帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線中的公式可以得到植物種轉(zhuǎn)基因成分的定量檢測結(jié)果。以上所述都說明以上2種抗性基因的引物和探針具有較好的定量檢測能力。

3 討論

目前最被人們接受的轉(zhuǎn)基因成分的檢測方法是基于DNA分子的，因為DNA分子經(jīng)過極端條件處理穩(wěn)定性也很高[28，29]。迄今為止已經(jīng)報道單一測定反應(yīng)中能夠檢測多達(dá)5個轉(zhuǎn)基因成分的多重傳統(tǒng)PCR系統(tǒng)[30-32]。這些測定中獲得的擴(kuò)增片段，可以在瓊脂糖凝膠中進(jìn)行鑒定。盡管該方法非常適用于定性分析，但其檢出限較差，可通過使用更靈敏的檢測技術(shù)（實時熒光PCR技術(shù)）來改善。實時熒光PCR技術(shù)中的TaqMan實時熒光定量PCR因為擁有不同熒光染料來標(biāo)記多個獨立的探針，其特異性大大加強而且適用于定量檢測使其脫穎而出[33]，同時檢測過程中處于封閉體系中進(jìn)行擴(kuò)增，降低了電泳過程中PCR產(chǎn)物被污染的可能，有效地減少了檢測時間，特別是檢測大批量樣品時其優(yōu)勢尤為明顯[34]。

本研究的創(chuàng)新點在于構(gòu)建陽性質(zhì)粒和在檢出限的基礎(chǔ)上通過建立標(biāo)準(zhǔn)曲線來評價方法的定量檢測能力。通過NCBI數(shù)據(jù)庫得到4種抗性基因的序列，構(gòu)建陽性質(zhì)粒。通過鑒定，4種陽性質(zhì)粒（pCry3A、pCry1A（c）、pCP4-EPSPS和pCTP2-CP4-EPSPS）結(jié)果良好，可以作為轉(zhuǎn)基因成分檢測的陽性對照。對轉(zhuǎn)基因棉花、轉(zhuǎn)基因大豆、轉(zhuǎn)基因小麥、轉(zhuǎn)基因玉米和非轉(zhuǎn)基因玉米進(jìn)行鑒定，得到轉(zhuǎn)基因棉花為轉(zhuǎn)入Cry1A（c）基因的抗蟲棉;轉(zhuǎn)基因大豆為轉(zhuǎn)入CP4-EPSPS基因的抗除草劑大豆;轉(zhuǎn)基因小麥為轉(zhuǎn)入Cry1A（c）基因的抗蟲小麥;轉(zhuǎn)基因玉米為轉(zhuǎn)入Cry1A（c）、CP4-EPSPS、CTP2-CP4-EPSPS基因的混合轉(zhuǎn)基因玉米。對轉(zhuǎn)基因棉花和轉(zhuǎn)基因大豆DNA模板原液進(jìn)行梯度稀釋確定Cry1A（c）和CP4-EPSPS的檢出限為0.1ng。根據(jù)檢出限結(jié)果建立的2種抗性基因的定量曲線R2≥0.95，根據(jù)此標(biāo)準(zhǔn)曲線可以定量檢測植物中轉(zhuǎn)基因成分的含量。

4 結(jié)論

綜上所述，上述方法可以有效鑒定轉(zhuǎn)基因植物和對轉(zhuǎn)基因植物進(jìn)行定量分析。隨著生物技術(shù)作物的快速發(fā)展，人們越來越關(guān)注生物技術(shù)作物衍生食品和飼料產(chǎn)品的潛在風(fēng)險。為了保護(hù)消費者的知情權(quán)和實施轉(zhuǎn)基因標(biāo)簽政策的先決條件時可以使用可靠且高效的檢測技術(shù)準(zhǔn)確測量食品或飼料產(chǎn)品中的轉(zhuǎn)基因成分[35];國際貿(mào)易也需要可靠的轉(zhuǎn)基因生物分析，以便對產(chǎn)品中轉(zhuǎn)基因成分的可比較進(jìn)行測量[36]。這些因素都促使轉(zhuǎn)基因檢測技術(shù)朝著高效、快速的方向發(fā)展[37]，所以多重實時熒光定量的多通道檢測[20，22，38]、環(huán)介導(dǎo)等溫技術(shù)的快速檢測[39]以及數(shù)字液滴PCR的高通量檢測[40，41]將會成為未來轉(zhuǎn)基因檢測的研究方向。

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（責(zé)任編輯 常陽陽）