李士強(qiáng)，尚愛加，王 玉2，陶本章，高海浩

(1.解放軍總醫(yī)院第一醫(yī)學(xué)中心神經(jīng)外科，北京100853；2.解放軍總醫(yī)院第一醫(yī)學(xué)中心骨科研究所，北京100853)

臨床上骶神經(jīng)損傷常見于神經(jīng)根腫瘤、脊髓拴系綜合征(tethered cord syndrome，TCS)、骶管囊腫、高能量的骨盆骨折等，常導(dǎo)致膀胱功能不全，長(zhǎng)期發(fā)展會(huì)出現(xiàn)神經(jīng)源性膀胱(neurogenic bladder，NB)、尿失禁及腎功能障礙等泌尿系統(tǒng)并發(fā)癥。兒童NB最常見于神經(jīng)管畸形，若不進(jìn)行治療，50%的患兒都會(huì)發(fā)展為腎功能衰竭，這也是導(dǎo)致患兒病死的主要原因，嚴(yán)重影響其生活質(zhì)量，并給個(gè)人、家庭及社會(huì)帶來沉重負(fù)擔(dān)[1]。因NB在臨床上治療棘手，且由于醫(yī)學(xué)倫理原因，很多研究無法在患者身上直接進(jìn)行。查閱文獻(xiàn)僅檢索到1篇骶神經(jīng)離斷致NB模型的研究，而臨床上骶神經(jīng)離斷傷少見，多數(shù)為慢性擠壓傷[2]。因此，本研究旨在建立一種簡(jiǎn)單實(shí)用且可靠的大鼠骶神經(jīng)鉗夾傷致神經(jīng)源性膀胱的模型，為探索骶神經(jīng)損傷的治療奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及材料

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：25只健康雌性Sprague-Dawley大鼠，體質(zhì)量為250～300 g，由解放軍總醫(yī)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，均經(jīng)過中國(guó)人民解放軍總醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理和使用委員會(huì)批準(zhǔn)，在溫度22～25 ℃、14 h光照/10 h黑暗循環(huán)的SPF級(jí)屏障環(huán)境下分籠飼養(yǎng)，自由進(jìn)食及飲水。實(shí)驗(yàn)儀器及試劑：BX51型顯微鏡(Olympus 公司，日本)，生理多導(dǎo)儀(Millar，美國(guó))，壓力換能器(新航興業(yè)公司，中國(guó))，Image Pro Plus圖像分析軟件(Media Cybernetics 公司，美國(guó))，SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)分析軟件(IBM公司，美國(guó))，4%多聚甲醛(Solarbio公司，中國(guó))。

1.2 方法

1.2.1 骶神經(jīng)鉗夾傷后神經(jīng)源性膀胱模型的建立

將入組動(dòng)物按照隨機(jī)數(shù)字表法分為2組，其中鉗夾傷組15只，對(duì)照組10只。鉗夾傷組大鼠經(jīng)電子天平稱重后，以2%戊巴比妥鈉(3 mL/kg)腹部皮下注射麻醉，剃毛后俯臥固定于鼠板上，四肢外展，常規(guī)消毒。取骶1～骶4后正中切口，依次切開皮膚及皮下組織，沿棘突縱行劈開大鼠雙側(cè)豎棘肌，顯露雙側(cè)骶1～骶4骶后孔，手術(shù)顯微鏡下咬骨鉗打開椎板，暴露雙側(cè)骶1～骶4神經(jīng)根(圖1a)；用血管鉗夾傷雙側(cè)骶2神經(jīng)根(圖1b)，每次鉗夾持續(xù)10 s,間隔5 s，共3次，夾持力約為15 N；夾傷后可見神經(jīng)根缺血、水腫，外膜仍完整(圖1c)。處理后逐層縫合傷口，消毒，模型構(gòu)建完畢。對(duì)照組大鼠進(jìn)行相同操作暴露雙側(cè)骶2神經(jīng)，但不進(jìn)行鉗夾傷。

a：骶1～骶4神經(jīng)走行；b：鉗夾傷處理；c：夾傷后神經(jīng)根缺血、水腫，外膜完整

圖1 大鼠造模顯微鏡下觀察

1.2.2 尿流動(dòng)力學(xué)檢測(cè) 大鼠稱重后以2%戊巴比妥鈉(3 mL/kg)腹部皮下注射麻醉，仰臥位固定。將2根無菌0.7 mm硬膜外導(dǎo)管經(jīng)液體石蠟潤(rùn)滑后，先后導(dǎo)入尿道，作為膀胱測(cè)壓管和灌注管。排空大鼠膀胱尿液，將測(cè)壓管與壓力傳感器相連；注水管連接微量注射泵，泵水速度為0.3 mL/min[3]。排尿后測(cè)定膀胱內(nèi)壓及漏尿點(diǎn)壓，體內(nèi)置零后開啟微量注射泵，向膀胱內(nèi)灌注生理鹽水，此過程中注意觀察尿道外口有無液體溢出。液體溢出時(shí)記錄的膀胱壓即為膀胱漏尿點(diǎn)壓，此時(shí)停止灌注，觀察膀胱壓力曲線，記錄其峰值，即為膀胱內(nèi)壓[4]。計(jì)算膀胱最大容量(膀胱最大容量=灌注時(shí)間×灌注速度)，連續(xù)測(cè)定2次，取其平均值。

1.2.3 膀胱組織形態(tài)學(xué)觀察 大鼠稱重麻醉后，下腹部剃毛，沿前正中逐層切開皮膚、皮下、肌層及腹膜，暴露膀胱并與周圍組織充分游離后對(duì)膀胱進(jìn)行大體觀察并拍照，剖取膀胱后將其用PBS液清洗3遍，4%多聚甲醛溶液常溫固定48 h后，截取中部膀胱壁，生理鹽水沖洗，脫水，透明，浸蠟，石蠟包埋，冷卻固定后，進(jìn)行連續(xù)切片，并進(jìn)行HE染色，常規(guī)脫水、透明，中性樹膠封片后于光學(xué)顯微鏡下觀察拍照，用IPP 6.0軟件測(cè)量其膀胱壁肌層厚度。

1.2.4 骶神經(jīng)組織形態(tài)學(xué)觀察 將大鼠腹腔注射過量戊巴比妥鈉處死后，充分暴露并完整切取夾傷段骶2神經(jīng)，PBS液清洗3遍后，進(jìn)行連續(xù)切片，然后進(jìn)行HE染色，常規(guī)脫水、透明、中性樹膠封片后于光學(xué)顯微鏡下觀察拍照。

1.3 觀察指標(biāo)

觀察造模后大鼠自主排尿情況。觀察造模4周后2組大鼠相關(guān)指標(biāo)：①尿流動(dòng)力學(xué)指標(biāo),包括最大膀胱容量、漏尿點(diǎn)壓、膀胱內(nèi)壓；②膀胱的組織形態(tài)學(xué)觀察及膀胱肌層厚度；③骶神經(jīng)的組織形態(tài)學(xué)觀察。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物數(shù)量分析

本研究2組大鼠造模過程中均無死亡，鉗夾傷組大鼠因尿路感染于第5天死亡1只，存活14只；對(duì)照組大鼠因腹水于第7天死亡1只，存活9只。

2.2 自主排尿情況

鉗夾傷組大鼠在造模后48 h出現(xiàn)下腹部膀胱充盈，自主排尿困難，采用Crede法進(jìn)行人工輔助排尿，部分大鼠出現(xiàn)血尿；對(duì)照組大鼠無下腹部膀胱充盈，可自主排尿，無血尿。

2.3 尿流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)結(jié)果

造模后4周，鉗夾傷組大鼠的最大膀胱容量大于對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；漏尿點(diǎn)壓高于對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；膀胱內(nèi)壓高于對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

表1 大鼠尿流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)和膀胱肌層厚度的比較

*：與對(duì)照組比較，P<0.05

2.4 膀胱組織形態(tài)學(xué)觀察及膀胱肌層厚度

造模4周后，對(duì)2組大鼠進(jìn)行下腹部解剖，鉗夾傷組大鼠膀胱明顯脹大，尿潴留明顯，呈典型的“橄欖球”狀(圖2a)；對(duì)照組大鼠膀胱大小形態(tài)正常(圖2b)。HE染色光鏡下觀察，鉗夾傷組大鼠膀胱壁變薄，逼尿肌排列紊亂、萎縮，移行上皮細(xì)胞部分破壞，炎性浸潤(rùn)(圖3a)；對(duì)照組大鼠逼尿肌層次和數(shù)量較多，移行上皮細(xì)胞整齊排列，無炎性改變(圖3b)。鉗夾傷組大鼠膀胱壁肌層厚度小于對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

a：鉗夾傷組；b：對(duì)照組

a：鉗夾傷組；b：對(duì)照組

2.5 骶神經(jīng)組織形態(tài)學(xué)觀察

造模4周后，骶神經(jīng)HE染色光鏡下觀察，對(duì)照組見大量雪旺細(xì)胞細(xì)胞核被染成藍(lán)紫色，排列均勻(圖4a)；而鉗夾傷組骶神經(jīng)細(xì)胞核較少，被大量纖維結(jié)締組織取代(圖4b)。

a：對(duì)照組；b：鉗夾傷組

3 討論

NB以膀胱逼尿肌或/和尿道括約肌功能障礙導(dǎo)致的儲(chǔ)尿和排尿異常為特征，由控制排尿的中樞或周圍神經(jīng)系統(tǒng)疾病引起[5]。NB臨床多見，發(fā)病原因主要有脊髓顱腦損傷、先天性疾病(神經(jīng)管畸形等)、周圍神經(jīng)疾病、感染和免疫性疾病等，其中最常見的病因是脊髓損傷和先天性疾病。目前，NB模型大部分由脊髓損傷引起，包括脊髓挫傷、脊髓壓迫損傷、缺血再灌注損傷、橫斷損傷等[6]。而Allen重物墜擊脊髓挫傷模型和Hassan Shaker脊髓橫斷模型是制作大鼠脊髓損傷的主要方法[7]。臨床上由骶神經(jīng)損傷引起的神經(jīng)源性膀胱并不少見，而且治療困難，尚沒有安全、有效的動(dòng)物模型，本研究通過對(duì)骶神經(jīng)進(jìn)行鉗夾傷建立NB模型,為探索骶神經(jīng)損傷的治療奠定基礎(chǔ)。

大鼠神經(jīng)系統(tǒng)與人類相似，易存活，且飼養(yǎng)和術(shù)后護(hù)理簡(jiǎn)單，麻醉和手術(shù)都可由1人完成。由于雄性大鼠尿道較長(zhǎng)、導(dǎo)尿困難，所以本研究選擇Sprague-Dawley雌性大鼠為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。SD大鼠的膀胱接受副交感、交感和軀體神經(jīng)的三重支配，以副交感神經(jīng)最為重要。Chuang等[8]通過電刺激大鼠腰6～骶4神經(jīng)根顯示，骶1、骶2神經(jīng)根刺激后引起膀胱平滑肌的動(dòng)作電位波幅最大。梁耿祺等[9]和王金武等[10]發(fā)現(xiàn)骶2神經(jīng)是支配膀胱的主要脊神經(jīng)。因此，本研究通過血管鉗夾傷雙側(cè)骶2神經(jīng)根建立NB模型，這種夾傷使神經(jīng)束遭到嚴(yán)重破壞或斷裂，但神經(jīng)外膜組織保持連續(xù)，很少能自行恢復(fù)，神經(jīng)損傷程度達(dá)到Ⅳ度損傷(Sunderland周圍神經(jīng)損傷分類法)。

造模的關(guān)鍵在于骶2神經(jīng)的準(zhǔn)確定位以及對(duì)鉗夾傷的客觀化和定量化。大鼠的4對(duì)骶神經(jīng)根中，骶1和骶2較粗，橫徑為0.35 mm左右，骶3和骶4較細(xì)，約為0.25 mm[10]。因?yàn)檠?活動(dòng)度大而骶椎相對(duì)固定，可先確定腰6與骶椎，腰6神經(jīng)根于第6腰椎和骶椎之間的椎間孔發(fā)出，然后可依次判斷出下方的骶1～骶4，分別由相應(yīng)骶椎下方的椎間孔發(fā)出。本研究參照De Koning等[11]及Somay等[12]的神經(jīng)夾傷方法，探索出用血管鉗夾傷骶神經(jīng)的改良方法，血管鉗每次卡在第一扣時(shí)用壓力傳感器可測(cè)試出夾持力壓力約15 N，每次鉗夾持續(xù)10 s,間隔5 s，共3次。

大鼠骶神經(jīng)鉗夾傷術(shù)后建立NB模型的標(biāo)志為尿潴留癥狀的出現(xiàn)，因此可以采用尿流動(dòng)力學(xué)、膀胱及骶神經(jīng)組織學(xué)觀察的方法進(jìn)行評(píng)估。本研究的尿流動(dòng)力學(xué)檢測(cè)采用的是經(jīng)尿道插管法(硬膜外導(dǎo)管)，與膀胱造瘺法相比，其導(dǎo)管堵塞部分尿道，導(dǎo)致最大膀胱容量、漏尿點(diǎn)壓稍偏大，但由于2組采取同樣的測(cè)量方式，因此對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的影響可以忽略[13]。

鉗夾傷組大鼠由于反復(fù)的尿路感染死亡1只，可能原因?yàn)榘螂變?nèi)壓升高和過度膨脹引起膀胱缺血及炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，同時(shí)尿潴留無法通過排尿清除細(xì)菌[14]。對(duì)照組大鼠因大量腹水死亡1只，考慮為麻醉致腸道麻痹引起。鉗夾傷組大鼠術(shù)后出現(xiàn)血尿可能是由膀胱壁膨脹致毛細(xì)血管破裂而產(chǎn)生[15]。

骶神經(jīng)損傷后由于膀胱失去神經(jīng)支配，出現(xiàn)逼尿肌無反射，膀胱容量不斷增大，導(dǎo)致平滑肌功能減退、膀胱壁彈性喪失，而且由于殘余尿持續(xù)存在，會(huì)使膀胱上皮細(xì)胞產(chǎn)生凋亡，繼發(fā)炎癥反應(yīng)，從而使膀胱壓力及膀胱組織形態(tài)發(fā)生變化[16-17]。有研究發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)源性膀胱逼尿肌的鏡下觀察可見平滑肌細(xì)胞萎縮、排列紊亂[18]。Colhoun等[19]發(fā)現(xiàn)神經(jīng)源性膀胱患者的漏尿點(diǎn)壓和膀胱內(nèi)壓會(huì)顯著升高，殘余尿量會(huì)明顯增加。結(jié)合本研究結(jié)果中夾傷組大鼠膀胱明顯脹大、逼尿肌萎縮、漏尿點(diǎn)壓升高、殘余尿增加，說明大鼠膀胱逼尿肌收縮力減弱，排空能力減退，出現(xiàn)尿潴留狀態(tài)，符合大鼠神經(jīng)源性膀胱的表現(xiàn)，造模成功。

骶神經(jīng)損傷后會(huì)出現(xiàn)軸突崩解、Wallerian變性、巨噬細(xì)胞遷移到受損部位清除軸突及髓鞘碎片，這種損傷如果較輕一般可自行恢復(fù)，而本研究造模的鉗夾傷組大鼠骶神經(jīng)HE染色結(jié)果說明骶神經(jīng)損傷很難自行恢復(fù)，這樣就保證了模型的穩(wěn)定性[20]。

本研究骶神經(jīng)的鉗夾傷與臨床上骶神經(jīng)損傷相似，但不足之處在于鉗夾傷是一種急性神經(jīng)損傷，而臨床上的骶神經(jīng)損傷大多為慢性神經(jīng)損傷。Olmaker等[21]發(fā)現(xiàn)神經(jīng)急性損傷時(shí)軸突會(huì)變性壞死，而慢性損傷時(shí)神經(jīng)僅出現(xiàn)水腫，無出血、變性，且神經(jīng)纖維可出現(xiàn)代償、調(diào)節(jié)，因此急性神經(jīng)損傷時(shí)病理改變往往更重，本研究中的動(dòng)物產(chǎn)生的癥狀比臨床癥狀更重。

綜上所述，本研究采用大鼠骶神經(jīng)鉗夾傷建立神經(jīng)源性膀胱模型的方法簡(jiǎn)單易行、可靠、重復(fù)性好，造模的條件容易掌握，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物存活率高，且具有臨床相似性，可為以后探索骶神經(jīng)損傷的治療奠定基礎(chǔ)。