侯 贊1，王雪桃，何 朗1，薛志紅1，曾貴林1，戴剛毅1，孟又勝1，李光俊，柏 森

(1.成都市第五人民醫(yī)院腫瘤科,四川 成都 611130；2.四川大學(xué)華西醫(yī)院放療中心,四川 成都 610041)

前列腺癌(prostate cancer，PCa)是世界范圍內(nèi)廣泛存在的惡性腫瘤之一，主要危害男性泌尿生殖系統(tǒng)，具有較高的致死率[1-2]。近幾年來我國前列腺癌的發(fā)病率也逐漸上升[3]。目前對前列腺癌采用的治療手段有手術(shù)切除、化療、放療等，但預(yù)后會出現(xiàn)復(fù)發(fā)率高、癌細胞易發(fā)生轉(zhuǎn)移等問題[4]。加之前列腺癌細胞對化療藥物已經(jīng)表現(xiàn)出極嚴(yán)重的耐藥效應(yīng)，化療效果有所降低[5]。紫杉醇(paclitaxel，PTX)屬于紫杉烷類，是化療常用藥物。正常情況下紫杉醇相對于其他藥物表現(xiàn)出2～3個月的中位生存優(yōu)勢，能明顯改善患者生活質(zhì)量，但患者在后期出現(xiàn)耐藥性后仍然會死于前列腺癌[6-7]。因此，闡明前列腺癌細胞耐藥機制，提高其對紫杉醇的化學(xué)敏感性，是治療前列腺癌亟需解決的難點問題。

microRNA(miRNA)是一類長度只有18～24 bp的非編碼RNA，在真核細胞中廣泛存在，能結(jié)合到下游mRNA的非編碼區(qū)并調(diào)控其表達，進而參與多項生命過程[8]。研究發(fā)現(xiàn)，多種腫瘤的發(fā)生及發(fā)展過程都有miRNA的參與，這與其表達模式有密切關(guān)聯(lián)[9]。miR-506-3p位于X染色體上，是miR-506-514族成員之一，有眾多靶基因[10]，已發(fā)現(xiàn)其在直腸癌[11]、黑色素瘤[12]、視網(wǎng)膜母細胞瘤[13]等惡性腫瘤中發(fā)揮調(diào)控作用。有研究報道m(xù)iR-506-3p在前列腺癌細胞中低表達[14]，但尚無miR-506-3p參與前列腺癌細胞化學(xué)敏感性調(diào)控的相關(guān)報道。異黏蛋白(metadherin，MTDH)也稱星型膠質(zhì)細胞上調(diào)基因-1(AEG-1)，是一類原癌基因，在多種惡性腫瘤中高表達[15-17]。在前列腺癌中過表達MTDH可促進前列腺癌細胞存活、侵襲和遷移，并抑制其凋亡[18-19]。本研究將探索過表達miR-506-3p對前列腺癌細胞生長和凋亡的影響，前列腺癌細胞中miR-506-3p與MTDH之間的靶向關(guān)系，進一步揭示miR-506-3p與MTDH相互作用對前列腺癌細胞化學(xué)敏感性的影響，以期改善前列腺癌的預(yù)后效果。

1 材料與方法

1.1 藥物、試劑與儀器

前列腺癌細胞系(PC-3、DU145、LNCaP)、正常前列腺細胞系(RWPE-1)購自中科院上海生命科學(xué)院細胞庫，Trizol reagent總RNA提取試劑盒(Sigma)，反轉(zhuǎn)錄試劑盒、RT-qPCR定量試劑盒(Takara)，miR-506-3p mimic、NC mimic(銳博)，胎牛血清(Hyclone)，DMEM培養(yǎng)基(Gibco)，MTDH、Bcl-2、Bax、GADPH抗體(CST)，紫杉醇(Sigma)，引物設(shè)計(上海生工)，Hoechst染色試劑盒(碧云天)，LV-MTDH(吉凱)，ECL化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒(ThermoFisher)，Lipofectamine 3000轉(zhuǎn)染試劑盒(Invitrogen)，雙熒光素酶報告基因試劑盒(Promega)，定量PCR儀(Corbett)光顯微鏡(蔡司)，多功能酶標(biāo)儀(Tecan)。

1.2 方法

1.2.1 組織獲取 從我院行前列腺癌切除術(shù)的患者中獲取癌組織。所有志愿者均簽署了有關(guān)臨床數(shù)據(jù)的書面知情同意書。本研究得到我院研究倫理委員會和臨床醫(yī)學(xué)學(xué)院的批準(zhǔn)，并根據(jù)《赫爾辛基宣言》的道德準(zhǔn)則進行。

1.2.2 細胞培養(yǎng) 將PC-3、DU145、LNCaP、RWPE-1細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中，放置于37 ℃、含5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)。

1.2.3 RT-qPCR檢測miR-506-3p和MTDH的表達水平 取對數(shù)期的細胞，用Trizol reagent總RNA提取試劑盒提取出細胞內(nèi)的總RNA，將miRNA和mRNA分別反轉(zhuǎn)錄為cDNA，再進行定量分析。RT-qPCR條件：95 ℃持續(xù)10 min，然后再95 ℃持續(xù)15 s，60 ℃持續(xù)25 s，72 ℃持續(xù)35 s，進行40個循環(huán)。用U6標(biāo)準(zhǔn)化，使用2-ΔΔC法測量表達水平。miR-506-3p的正向引物：5′-TAAGGCACCCTTCTGAGTAGA-3′,反向引物：5′-GCGAGCACAGAATTAATACGAC-3′；MTDH的正向引物：5′-TTACCACCGAGCAACTTACAAC-3′,反向引物：5′-ATTCCAGCCTCCTCCATTGAC-3′；U6的正向引物：5′-TGACACGCAAATTCGTGAAGCGTTC-3′,反向引物：5′-CCAGTCTCAGGGTCCGAGGTGTC-3′。

1.2.4 構(gòu)建人前列腺癌耐藥細胞株P(guān)C-3/PTX 取對數(shù)期的PC-3細胞，以化療常用藥物紫杉醇為誘導(dǎo)藥物，采用間歇逐步增加計量法[5]誘導(dǎo)PC-3細胞產(chǎn)生耐藥性，最終PC-3/PTX細胞維持在1 μg/mL紫杉醇以保持耐藥性。

1.2.5 分組及處理 取PC-3/PTX細胞用胰蛋白酶消化后，將適量細胞接種于24孔板，隨機分為5組：對照組、NC mimic組、miR-506-3p mimic組、LV-MTDH組、mimic+MTDH組。培養(yǎng)24 h后使用Lipofectamine 3000轉(zhuǎn)染試劑盒分組進行轉(zhuǎn)染。

1.2.6 CCK8檢測PC-3/PTX細胞活力 CCK8分析檢測PC-3/PTX細胞存活率，并計算細胞IC50值。將1.2.5分組處理細胞在培養(yǎng)箱中預(yù)培養(yǎng)24 h，向培養(yǎng)板中加入不同濃度的紫杉醇(0、2、4、6、8、10 μg/mL)，并設(shè)置不加細胞液的對照孔，每種處理設(shè)3個復(fù)孔。孵育24 h后，向每孔加入10% CCK8無血清培養(yǎng)液200 μL，孵育4 h后于酶標(biāo)儀上測定450 nm處的吸光值(A)。細胞存活率(%)=[A(加藥)-A(對照)]/[A(0加藥)-A(對照)]×100%。以藥物濃度為橫坐標(biāo)，細胞存活率為縱坐標(biāo)，繪制濃度-效應(yīng)曲線，確定板書抑制濃度(IC50)。

1.2.7 克隆形成分析檢測細胞的生長情況 將消化后的細胞以500個/孔接種于6孔板，培養(yǎng)14 d后去培養(yǎng)液并用PBS洗滌，3.7%甲醛固定10 min，用結(jié)晶紫染色后于顯微鏡下觀察并統(tǒng)計克隆形成情況。

1.2.8 Hoechst檢測細胞的調(diào)亡情況 取轉(zhuǎn)染成功后的PC-3/PTX細胞平鋪于6孔板，每孔分別加入1 mL Hoechst染色液，繼續(xù)培養(yǎng)20～30 min，棄染色液并進行熒光檢測，將其置于倒置熒光顯微鏡下觀察各組細胞核呈藍色的細胞，觀察并記錄凋亡細胞數(shù)目，并計算細胞凋亡率。

1.2.9 Western blot檢測調(diào)亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Bax和MTDH的表達 收集轉(zhuǎn)染成功的細胞，用PIPA裂解液提取總蛋白，并用BCA試劑盒檢測濃度，將蛋白于10% SDS-PAGE進行電泳分離，用半轉(zhuǎn)模儀轉(zhuǎn)移蛋白質(zhì)至PVDF膜，在5%脫脂牛奶封閉液中封閉90 min，加入一抗4 ℃過夜孵育，漂洗后加入二抗室溫孵育1 h，再次漂洗后用ECL液顯色曝光，用GAPDH作為內(nèi)標(biāo)蛋白，使用Image J軟件處理圖像并計算蛋白相對表達水平。

1.2.10 雙熒光素酶報告基因?qū)嶒烌炞CmiR-506-3p和MTDH之間的靶向關(guān)系 先用TargetScan軟件預(yù)測miR-506-3p與MTDH的潛在結(jié)合位點。從PC-3/PTX細胞中擴增出包含結(jié)合位點的片段以及包含突變結(jié)合位點的片段，將其分別連接到報告基因載體上，命名為MTDH野生型(WT)和突變型(MUT)重組質(zhì)粒。之后又將其分別與NC mimic或miR-506-3p mimic共轉(zhuǎn)入PC-3/PTX細胞，再按試劑盒使用說明測定各組熒光素酶活性變化。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

使用SPSS 19.0軟件進行數(shù)據(jù)分析，利用GraphPad Prism繪制圖表，多組間比較用單因素方差分析，2組比較采用t檢驗，P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義,P<0.01表示差異具有極顯著性統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-506-3p與MTDH在前列腺癌細胞中的表達模式

RT-qPCR定量結(jié)果顯示，miR-506-3p在前列腺癌組織及細胞系(PC-3、DU145、LNCaP)中的表達水平顯著低于在正常前列腺組織及細胞系(RWPE-1)中的表達水平；而MTDH卻表現(xiàn)出與miR-506-3p表達模式相反的趨勢，在前列腺癌組織及細胞中表達水平高于在正常前列腺組織及細胞系(RWPE-1)中的表達水平，且以前列腺癌細胞系PC-3差異最大(圖1)。表明在前列腺癌組織及細胞中，miR-506-3p低表達，而MTDH高表達。

2.2 miR-506-3p過表達抑制前列腺癌耐藥細胞PC-3/PTX生長

miR-506-3p在人前列腺癌耐藥細胞株P(guān)C-3/PTX的表達量顯著低于在前列腺癌細胞PC-3的表達量(圖2a)，說明miR-506-3p的表達降低可能是前列腺癌細胞對紫杉醇產(chǎn)生耐藥的原因。經(jīng)miR-506-3p mimic和NC mimic分別轉(zhuǎn)染PC-3/PTX細胞后，miR-506-3p mimic組的PC-3/PTX細胞內(nèi)miR-506-3p的表達水平顯著高于對照組和NC mimic組，說明處理成功(圖2b)。隨著紫杉醇濃度的增加，3組處理的PC-3/PTX細胞存活率均逐漸下降；當(dāng)紫杉醇濃度達10 μg/mL時，miR-506-3p mimic組的PC-3/PTX細胞存活率、IC50值以及克隆細胞數(shù)目明顯低于對照組和NC mimic組(圖2c～e)，說明miR-506-3p過表達會抑制PC-3/PTX細胞生長，增加其化學(xué)敏感性。

*：與RWPE-1比較，P<0.05；#：與RWPE-1比較，P<0.01;△：與癌旁組織比較，P<0.01 a:前列腺癌組織及正常組織中miR-506-3p及MTDH的表達水平； b:前列腺癌細胞系中miR-506-3p的表達水平；c：前列腺癌細胞系中MTDH的表達水平

圖1 RT-qPCR檢測miR-506-3p與MTDH在前列腺癌細胞中的表達

2.3 miR-506-3p過表達促進前列腺癌耐藥細胞PC-3/PTX凋亡

與對照組和NC mimic組相比，miR-506-3p mimic處理后的PC-3/PTX細胞凋亡率顯著升高，增長幅度為2倍以上(圖3a)，并且抗凋亡蛋白Bcl-2表達顯著降低，促凋亡蛋白Bax的表達水平明顯升高(圖3b)，表明miR-506-3p過表達會促進PC-3/PTX細胞凋亡，從而增加其化學(xué)敏感性。

2.4 miR-506-3p靶向抑制MTDH的表達

用TargetScan軟件預(yù)測，發(fā)現(xiàn)在MTDH 3′UTR的978-985 bp區(qū)域存在has-miR-506-3p的潛在結(jié)合位點(圖4a)。用雙熒光素酶報告基因?qū)嶒烌炞C，MTDH野生型較突變型能使熒光素酶活性顯著下降(圖4b)，說明miR-506-3p與MTDH之間確實存在靶向關(guān)系。Western blot檢測發(fā)現(xiàn)miR-506-3p mimic組PC-3/PTX細胞中MTDH蛋白表達水平顯著低于對照組和NC mimic組(圖4c)，表明過表達miR-506-3p會抑制MTDH的表達，即miR-506-3p靶向抑制MTDH的表達。

*：與對照組比較，P<0.05;#：與對照組比較，P<0.01;△：與PC-3比較，P<0.01 a：RT-qPCR檢測在前列腺癌耐藥細胞株P(guān)C-3/PTX中miR-506-3p的表達水平；b：RT-qPCR檢測在轉(zhuǎn)染處理的前列腺癌耐藥細胞株中miR-506-3p的表達水平;c：CCK8檢測細胞活力； d：CCK8檢測細胞IC50；e：克隆形成實驗檢測細胞的生長(結(jié)晶紫染色×200)

圖2 miR-506-3p過表達抑制前列腺癌耐藥細胞PC-3/PTX生長

*：與對照組比較，P<0.05；#：與對照組比較，P<0.01 a：Hoechst檢測細胞的調(diào)亡情況(×400)；b：Western blot檢測調(diào)亡相關(guān)蛋白Bcl-2和Bax的表達

圖3 miR-506-3p過表達促進前列腺癌耐藥細胞PC-3/PTX凋亡

2.5 miR-506-3p通過靶向抑制MTDH的表達增強PC-3/PTX細胞的化學(xué)敏感性

引入慢病毒載體LV構(gòu)建過表達MTDH，將LV-MTDH轉(zhuǎn)染至PC-3/PTX細胞后發(fā)現(xiàn)，MTDH的表達水平較對照組和LV-MTDH組明顯升高(圖5a)，說明載體構(gòu)建和細胞轉(zhuǎn)染是成功的。將miR-506-3p mimic、LV-MTDH單獨或聯(lián)合轉(zhuǎn)染PC-3/PTX細胞，檢測其MTDH的表達水平、克隆數(shù)目及凋亡情況的變化。相比于對照組，miR-506-3p mimic組中MTDH的表達量顯著下降，PC-3/PTX細胞克隆數(shù)目減少，凋亡率升高，而LV-MTDH組中MTDH的表達量明顯升高，PC-3/PTX細胞克隆數(shù)目增加，凋亡率顯著下降。相對于LV-MTDH組，mimic+MTDH組PC-3/PTX細胞中MTDH的表達量顯著下降，細胞克隆數(shù)目減少，凋亡率升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖5b～d。上述結(jié)果表明，MTDH過表達會促進PC-3/PTX細胞生長、抑制其凋亡，并且miR-506-3p過表達可逆轉(zhuǎn)MTDH過表達對PC-3/PTX細胞產(chǎn)生的影響，因此，miR-506-3p能夠通過靶向抑制MTDH的表達增強PC-3/PTX細胞的化學(xué)敏感性。

*：與NC mimic組比較，P<0.05；#：與對照組比較，P<0.01 a：TargetScan軟件預(yù)測靶向關(guān)系；b：雙熒光素酶報告基因?qū)嶒烌炞C靶向關(guān)系；c：Western blot檢測調(diào)亡相關(guān)蛋白MTDH的表達

圖4 miR-506-3p靶向抑制MTDH的表達

*：與對照組比較，P<0.05；#：與對照組比較，P<0.01；△：與LV-MTDH組比較，P<0.05；▲：與LV-MTDH組比較，P<0.01a、b：Western blot檢測調(diào)亡相關(guān)蛋白MTDH的表達；c：克隆形成實驗檢測細胞的生長(結(jié)晶紫染色×200)；d：Hoechst檢測細胞的調(diào)亡情況(×400)

圖5 miR-506-3p通過靶向抑制MTDH的表達增強PC-3/PTX細胞的化學(xué)敏感性

3 討論

對于前列腺癌的治療目前主要采用常規(guī)臨床手段，雖然可以暫時緩解癌癥癥狀，但治療后1～3年內(nèi)易出現(xiàn)復(fù)發(fā)，對化療藥物產(chǎn)生耐藥，最終導(dǎo)致前列腺癌進入晚期，大幅降低患者的存活率[20]。紫杉醇是一類臨床治療癌癥的常規(guī)化療藥物，前列腺癌患者用藥一段時間后會出現(xiàn)耐藥，嚴(yán)重破壞治療效果[6]。因此，闡明其耐藥機制對患者預(yù)后具有重要意義。關(guān)于miR-506-3p和MTDH的關(guān)系及其對癌細胞化學(xué)敏感性的影響，目前還未見相關(guān)的報道。本研究探索了miR-506-3p和MTDH在前列腺癌細胞和正常前列腺細胞中的表達情況，通過檢測miR-506-3p過表達對人前列腺癌耐藥細胞株P(guān)C-3/PTX生長、凋亡的影響，體外驗證miR-506-3p與MTDH的靶向關(guān)系，并驗證其相互作用對PC-3/PTX細胞的影響。

本研究中，miR-506-3p在前列腺癌細胞中低表達，表明在前列腺癌中miR-506-3p是一個抑癌因子，與之前的報道一致[14]。miR-506-3p在其他疾病中也有著相似的作用，能抑制人肝癌細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移[21]；過表達miRNA-506和miRNA-124可減輕人心肌細胞功能障礙[22]；miR-506-3p能抑制骨肉瘤細胞自噬、侵襲和轉(zhuǎn)移[10,23]，還可抑制鼻咽癌腫瘤生長和轉(zhuǎn)移[24]；沉默miRNA-506可促進非小細胞肺癌的發(fā)展[25]。而MTDH在前列腺癌細胞中高表達，與前人研究一致[15,19]，表明其在前列腺癌中也是一個促癌因子，若降低MTDH的表達可抑制食管癌細胞增殖，抑制膠質(zhì)瘤細胞、胃癌細胞增殖、侵襲和遷移[17，26-27]。據(jù)相關(guān)數(shù)據(jù)顯示，我國大約70%的前列腺癌患者為局部晚期或已發(fā)生廣泛轉(zhuǎn)移[28]，那么或許可將miR-506-3p或MTDH在前列腺癌細胞的表達情況作為前列腺癌惡性程度的早期確診指標(biāo)。miR-506-3p在耐藥細胞PC-3/PTX中的表達水平明顯低于正常前列腺細胞，表明前列腺癌細胞產(chǎn)生耐藥性可能是內(nèi)部miR-506-3p的表達量降低導(dǎo)致的。并且miR-506-3p過表達可明顯抑制PC-3/PTX細胞的生長，促進其凋亡，即miR-506-3p過表達可以增加前列腺癌細胞對紫杉醇的化學(xué)敏感性。有報道稱，miR-34a過表達可增強前列腺癌細胞對紫杉醇的耐藥性，在這方面miR-506-3p與miR-34a可能存在協(xié)同作用[29]，但還需進一步研究。

另外，本研究觀察到miR-506-3p與MTDH的表達模式在前列腺癌細胞中呈負相關(guān)，隨后通過雙熒光素酶報告基因?qū)嶒炓约皺z測過表達miR-506-3p的PC-3/PTX細胞中MTDH蛋白表達水平變化來證明miR-506-3p與MTDH之間確實存在著靶向抑制的關(guān)系。之前有報道稱，MTDH上游有一些miRNA靶向調(diào)控[19,27]，但未見miR-506-3p的相關(guān)研究，因此本研究結(jié)果可以說是前列腺癌中的一項重大發(fā)現(xiàn)。進一步研究兩者的這種靶向關(guān)系發(fā)現(xiàn)，miR-506-3p通過靶向抑制MTDH的表達抑制PC-3/PTX細胞生長，促使其發(fā)生凋亡，可以增強前列腺癌細胞的化學(xué)敏感性。

綜上所述，本研究證明了miR-506p和MTDH參與調(diào)控前列腺癌細胞的化學(xué)敏感性，并且初步揭示了其調(diào)控機制可能是miR-506-3p靶向抑制MTDH的表達來抑制前列腺癌耐藥細胞生長，促使其發(fā)生凋亡。本研究結(jié)果將為解決前列腺癌細胞耐藥性這一重大難題提供一個新的思路，即通過調(diào)節(jié)癌細胞內(nèi)miR-506-3p與MTDH的表達水平，或者干擾二者之間的靶向關(guān)系影響細胞耐藥性。但本實驗僅為體外細胞實驗，關(guān)于其在動物體內(nèi)的實驗還需進一步研究。