許英民

摘 ?要： 本試驗(yàn)采取鐵力市地區(qū)某鵝場鴨疫里默氏桿菌疑似病料進(jìn)行細(xì)菌分離，并對(duì)分離細(xì)菌進(jìn)行生化鑒定、PCR鑒定、動(dòng)物試驗(yàn)和藥敏試驗(yàn)。結(jié)果表明：分離的2株細(xì)菌均為鴨疫里默氏桿菌，分離菌株對(duì)頭孢氨芐、頭孢噻肟、氟苯尼考高敏，對(duì)氨芐西林、慶大霉素、鏈霉素中敏，對(duì)環(huán)丙沙星、磺胺嘧啶、利福平不敏感。說明頭孢氨芐、頭孢噻肟可作為此養(yǎng)鵝場防治病的首選藥物，其他藥物需減少或停止使用。

關(guān)鍵詞： 鵝的鴨疫里默氏桿菌;分離鑒定;藥敏試驗(yàn)

中圖分類號(hào)：S858.33 ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：B ? ? 文章編號(hào)：1673-1085（2020）4-0045-03

鵝的鴨疫里默氏桿菌（Riemerella ?anatipestifer，RA）是由鴨傳染性漿膜炎引起，是鴨鵝等多種禽類的一種急性或慢性傳染病。主要危害3～8周齡的小鴨或小鵝，在臨床上表現(xiàn)為困倦、眼鼻有分泌物，綠色下痢，共濟(jì)失調(diào)和抽搐。慢性病例可出現(xiàn)頭頸歪斜。病理變化為纖維素性心包炎、肝周炎、氣囊炎、干酪性輸卵管炎和腦膜炎，是危害養(yǎng)鵝業(yè)最主要傳染病之一，如果治療不及時(shí)可引起大批死亡，給養(yǎng)鵝業(yè)帶來巨大的損失。

在養(yǎng)鵝業(yè)的過程中，為了防治細(xì)菌性傳染病的發(fā)生，盲目使用一些抗菌藥物，導(dǎo)致環(huán)境中RA的耐藥性菌株越來越多，表現(xiàn)為多重耐藥和交叉耐藥，并且不同地區(qū)不同飼養(yǎng)場RA的耐藥性不同，這就給本病防治帶來很多的困難。RA血清型多，達(dá)20多個(gè)，主要有1、2、3、4、5、6、7、8、10、11、13、14和其他未知血清，血清型之間無交叉免疫作用，可因血清型不符合導(dǎo)致疫苗免疫失敗，因此有必要進(jìn)行RA的分離鑒定，為鴨疫里默氏桿菌病預(yù)防提供一定的指導(dǎo)。

1 ?材料

1.1 ?病料來源 ?鐵力市地區(qū)發(fā)病的養(yǎng)鵝場，無菌采集疑似患有鵝鴨疫里默氏桿菌的病死鵝的心臟、肝臟和腦組織。

1.2 ?培養(yǎng)基、試劑 ?普通營養(yǎng)瓊脂、麥康凱培養(yǎng)基、TSA、TSB均購自北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司;生化試劑和藥敏紙片購自杭州天和微生物試劑有限責(zé)任公司;高保真Taq DNA聚合酶購自北京賽百盛基因技術(shù)有限公司，細(xì)菌DNAout（G+）購自綿陽高新區(qū)天澤基因工程有限公司。

1.3 ?試驗(yàn)動(dòng)物 ?鐵力市某養(yǎng)鵝場，10日齡未免疫RA的健康雛鵝15只，常規(guī)飼養(yǎng)3d，未發(fā)現(xiàn)任何異常，可供動(dòng)物試驗(yàn)用。

2 ?方法

2.1 ?細(xì)菌分離 ?將采集的病料分別劃線接種于麥康凱培養(yǎng)基、普通營養(yǎng)培養(yǎng)基、TSA，并將TSA置于CO2培養(yǎng)箱，普通營養(yǎng)培養(yǎng)基和麥康凱培養(yǎng)基置于普通培養(yǎng)箱，37.0℃恒溫箱培養(yǎng)24h，選擇符合RA特性的菌落，然后涂片、革蘭氏染色，鏡檢，觀察結(jié)果。并挑取單個(gè)菌落反復(fù)劃線觀察，進(jìn)行分離菌的純度培養(yǎng)。

2.2 ?生化鑒定 ?根據(jù)“伯潔細(xì)菌鑒定手冊(cè)”對(duì)分離細(xì)菌進(jìn)行常規(guī)的生理生化鑒定[1]。

2.3 ?PCR鑒定 ?①引物的設(shè)計(jì)與合成：根據(jù)Genbank中已發(fā)表的RA 16s rRNA基因序列，應(yīng)用Primer5.0軟件自行設(shè)計(jì)合成了一對(duì)能擴(kuò)增1115bp基因片段的引物，序列如下：p1：5′GTA TTC ACC GCG CCA TGG CT3' ;P2：5′TTA GTG AGG TAA CGG CTA AC3';②RA基因組DNA的提?。禾羧A單菌落，接種到5mL TSB中，37.0℃振蕩培養(yǎng)過夜，參考細(xì)菌DNAout（g+）試劑盒說明書提取全基因組;③PCA體系與反應(yīng)條件：以提取的RA全基因組為模板，用合成的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5min;94℃ 1min， 51℃ 1min ，72℃ 1min ，30個(gè)循環(huán);72℃ 10min。PCR結(jié)束后，取5μL PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，觀察結(jié)果。

2.4 ?動(dòng)物試驗(yàn) ?將2株分離菌株分別接種于TSA上，置于CO2培養(yǎng)箱37.0℃培養(yǎng)48h，將平板上所有菌落刮下，混于滅菌生理鹽水中制成細(xì)菌懸液，并調(diào)整細(xì)菌濃度為107CFU/mL。選取15只飼養(yǎng)至13日齡的健康肉鵝雛，隨機(jī)分為3組，每組5只，試驗(yàn)組每只腿部皮下接種菌液0.5mL，對(duì)照組用生理鹽水注射。接種后每日觀察，記錄鵝的精神、食欲、飲水、糞便、運(yùn)動(dòng)及死亡情況，并對(duì)死亡鵝進(jìn)行病理剖檢，取死亡鵝的心血、肝臟組織進(jìn)行細(xì)菌分離培養(yǎng)。

2.5 ?藥敏試驗(yàn) ?參照“獸醫(yī)微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)”[2]中圓紙片擴(kuò)散法，將2株分離株的菌落分別用滅菌生理鹽水洗脫，分別均勻涂布在TSA上，然后將頭孢氨芐、頭孢噻肟、氟苯尼考、慶大霉素等15種常用抗菌藥物的藥敏試紙分別貼到平板表面，二氧化碳培養(yǎng)箱37.0℃培養(yǎng)24h，觀察抑菌圈的大小并記錄結(jié)果。

3 ?結(jié)果與分析

3.1 ?細(xì)菌分離[3] ?經(jīng)鑒別培養(yǎng)和涂片、染色、鏡檢，從采集的病料中分離得到2株疑似RA。細(xì)菌在TSA上生長良好，形成光滑、中央隆起、奶油狀的圓形菌落，在普通營養(yǎng)瓊脂和麥康凱培養(yǎng)基上不生長。在顯微鏡下觀察呈革蘭氏陰性、瑞氏染色兩極濃染的短桿菌。

3.2 ?PCR鑒定 ?以提取的細(xì)菌DNA基因組為模板，應(yīng)用合成的P1和P2為引物進(jìn)行PCR反應(yīng)擴(kuò)增目的基因，所獲得的PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳呈單一條帶，大小與預(yù)期1115bp相符。

3.3 ?動(dòng)物試驗(yàn)結(jié)果 ?2個(gè)試驗(yàn)組的10只小鵝在接種細(xì)菌2d后，表現(xiàn)為精神沉郁、食欲減退、眼鼻有分泌物、排黃綠色稀便，死亡之前有頭頸震顫、抽搐、共濟(jì)失調(diào)、角弓反張等明顯神經(jīng)癥狀，分別于接種后2～3d出現(xiàn)死亡，對(duì)照組的5只小鵝精神、食欲無異常。病死鵝剖檢可見典型的纖維素性心包炎、肝周炎、氣囊炎，取腦、心血和肝組織進(jìn)行細(xì)菌分離，其培養(yǎng)特性、生化特性與RA一致。

3.4 ?藥敏試驗(yàn)結(jié)果 ?藥敏結(jié)果表明，分離菌對(duì)頭孢氨芐、頭孢噻肟、氟苯尼考高敏，對(duì)氨芐西林、丁胺卡那、慶大霉素中敏，對(duì)環(huán)丙沙星、復(fù)方新諾明、利福平不敏感。

4 ?小結(jié)與討論

4.1 ?在診斷鵝感染鴨疫里默氏桿菌時(shí)，要注意與大腸桿菌病相區(qū)別，兩者在臨床癥狀與剖檢變化上極為相似，但在細(xì)菌培養(yǎng)特性和生化特性上大不相同。本試驗(yàn)從臨床疑似病例中分離得到一株細(xì)菌，通過培養(yǎng)特性、形態(tài)觀察、生化試驗(yàn)進(jìn)行鑒定，由于RA生化特性存在一定的差異，生化鑒定結(jié)果只能初步鑒定為RA，但RA菌株的獲得可為下一步研究該病有效的防治方法奠定基礎(chǔ)。

4.2 ?臨床上抗菌藥物濫用，導(dǎo)致RA的耐藥性在不斷地增加，給該病的防治帶來很大困難[4，5]。藥敏試驗(yàn)結(jié)果表明，分離菌株對(duì)頭孢氨芐、頭孢噻肟、氟苯尼考高敏，可為此養(yǎng)鵝場防治該病的首選藥物，其他藥物須減少或停止使用。

4.3 ?疫苗免疫是預(yù)防鵝的鴨疫里默氏桿菌的有效措施之一，由于RA血清型較多，不同血清型間缺乏交叉免疫力，并且該病可出現(xiàn)多種血清型混合感染及新的血清型不斷出現(xiàn)。因此，疫苗免疫效果差。在應(yīng)用疫苗免疫時(shí)，應(yīng)經(jīng)常對(duì)本地區(qū)和本養(yǎng)鵝場的流行菌株進(jìn)行鑒定，選擇同血清型的疫苗或自家苗進(jìn)行免疫接種，確保免疫效果。

參考文獻(xiàn)：

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