劉佳麗 何明良 劉晨曦 廖 栩 李秀峰 管清杰*

(1.東北鹽堿植被恢復與重建教育部重點實驗室，東北林業(yè)大學生命科學學院，哈爾濱 150040； 2.中國科學院東北地理與農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所，哈爾濱 150081； 3.中國科學院大學，北京 100049)

迄今為止，植物鋅指蛋白在植物生長發(fā)育[18]、逆境脅迫[19～21]以及病原菌防御[22]過程中發(fā)揮重要作用。C2HC型鋅指蛋白雖在植物體內(nèi)發(fā)現(xiàn)，例如，水稻OsRZ1/2基因所編碼C2HC型鋅指蛋白，通過調(diào)節(jié)響應(yīng)脅迫相關(guān)基因提高植株對低溫的耐受性[21]。然而，其他基因所編碼的C2HC型鋅指蛋白功能及作用機制有待進一步研究。水稻即是繼小麥之后的世界第二大糧食作物，也是生物學研究的模式植物，全世界50%人口數(shù)量以上的人都是以大米為主食。東北松嫩平原的蘇打鹽堿地作為我國的后備耕地為滿足快速增長的人口糧食需求和產(chǎn)量提高而開發(fā)利用，而當今鹽堿化加劇已是一個極其嚴峻的挑戰(zhàn)。迄今為止，以稻治堿，水稻基因組的研究成功為選育抗鹽堿水稻奠定了遺傳基礎(chǔ)。因此，挖掘新的耐鹽堿基因?qū)λ酒贩N的遺傳改良以及提高糧食產(chǎn)量具有十分重要的意義。本研究通過在堿性鹽脅迫下，明確OsZFP6蛋白在響應(yīng)堿性鹽逆境信號調(diào)節(jié)作用；確定OsZFP6蛋白發(fā)揮功能的場所；比較過表達OsZFP6基因水稻在堿性鹽脅迫下耐受性變化，闡明OsZFP6蛋白參與調(diào)節(jié)水稻堿性鹽脅迫下生長的遺傳表型；將為明確水稻在堿性鹽逆境下生長時，OsZFP6蛋白參與的一條耐受堿性鹽脅迫的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)分子途徑提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料

水稻龍粳11(OryzasativaLongjing11)種子由中國科學院東北地理與農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所提供。

1.1.2 菌株與載體

大腸桿菌(E.coli)JM109、農(nóng)桿菌EHA105由本實驗室保存；pMD18-T vector購于TaKaRa公司；pBI121::GFP植物熒光表達載體由本實驗構(gòu)建完成，以及前期構(gòu)建的重組植物表達載體pBI121::OsZFP6由本實驗室提供。

1.1.3 實驗試劑

地高辛標記試劑盒、CDP-Star顯色劑購自于Roche公司；限制性內(nèi)切酶、T4連接酶購自于TaKaRa公司；2×Brilliant SYBR Green QPCR Master Mix、RNA提取試劑盒、Ex-Taq DNA聚合酶購自于北京康為世紀公司；Yeast extract粉末、Tryptone粉末購自于SIGMA公司；氨芐青霉素(Amp)購自于上海生物工程有限公司；其他試劑為中國產(chǎn)分析純試劑。

1.2 方法

1.2.1OsZFP6基因的生物信息學分析

利用NCBI在線網(wǎng)站BLAST對克隆的OsZFP6基因進行同源性比對分析；利用MEGA7.0軟件構(gòu)建蛋白系統(tǒng)進化樹；利用SnapGene4.2.3軟件對OsZFP6蛋白進行分子量預測；利用在線網(wǎng)站SMART(http://smart.embl-heidelberg.de)對OsZFP6蛋白保守結(jié)構(gòu)域進行比對。并利用在線網(wǎng)站W(wǎng)ebLogo(http://weblogo.threeplusone.com/create.cgi)對OsZFP6蛋白保守結(jié)構(gòu)域作圖分析。

1.2.2 實時定量PCR分析OsZFP6基因表達特性

提取分別用濃度為60 mmol·L-1NaHCO3、5 mmol·L-1H2O2處理后水稻的葉和根的總RNA。測得RNA濃度后，取1 μg總RNA為模版反轉(zhuǎn)錄cDNA，稀釋100倍后作為定量PCR模版。設(shè)計內(nèi)參基因以及OsZFP6特異性引物序列(Actin1-F:CTTCATAGGAATGGAAGCTGCGGGTA,Actin1-R:CGACCACCTTGATCTTCATGCTGCTA;OsZFP6-F1:CAAGCATCTCACCTCACAG，OsZFP6-R1:TAGGCACCTCTACACTCAT)，進行定量PCR反應(yīng)，在MxPro-Mx3000P系統(tǒng)上進行數(shù)據(jù)采集，每個實驗樣品分別進行3次技術(shù)重復和3次生物學重復，結(jié)果數(shù)據(jù)用Origin軟件進行分析。

1.2.3 水稻OsZFP6蛋白亞細胞定位分析

利用在線網(wǎng)站Target P(http://www.cbs.dtu.dk/services/Target P)對OsZFP6蛋白發(fā)揮功能場所定位預測，通過水稻原生質(zhì)體方法進行亞細胞定位實驗驗證。構(gòu)建pBI121::OsZFP6::GFP重組質(zhì)粒。將pMD18-T-OsZFP6測序正確的質(zhì)粒為模版，設(shè)計特異性引物，進行PCR反應(yīng)，膠回收產(chǎn)物與pMD18-T進行連接反應(yīng)，連接產(chǎn)物的質(zhì)粒和pBI121載體經(jīng)過酶切反應(yīng)后連接，重組質(zhì)粒用KpnⅠ與SalⅠ進行酶切鑒定。

1.2.4 過表達OsZFP6水稻的遺傳轉(zhuǎn)化及NaHCO3抗性分析

1.2.4.1 轉(zhuǎn)基因水稻的制備

參照1.2.3方法，將構(gòu)建好的pBI121::OsZFP6::GFP重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌EHA105，并將工程菌株在含有50 mg·L-1卡那霉素(Kana)培養(yǎng)基進行活化。參考Toki S等人[23]方法，使用農(nóng)桿菌介導對水稻愈傷組織侵染。

1.2.4.2 過表達OsZFP6水稻鑒定

(1)過表達植株T0代PCR檢測。分別提取獲得到的有卡那霉素抗性的7個不同株系的基因組DNA。根據(jù)植物過表達載體信息，設(shè)計特異性引物(OsZFP-F2：CTCGTGACCACCCTGACCTA；OsZFP-R2：TCGTCCATGCCGAGAGTGAT)。分別以7個不同株系DNA為模板，進行PCR檢測。

(2)過表達植株OsZFP6相對表達量分析。取1 ng總RNA進行反轉(zhuǎn)錄，使用特異性引物(OsZFP6-F3:GTCGGAGAAGCAGTGGTAGG;OsZFP6-R3:GGCGAGTAGTTGCAGGTGAT)，以反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA為模板并參照1.2.2進行qRT-PCR分析。

(3)過表達植株卡那霉素抗性篩選。將收獲的種子，依次經(jīng)過70%乙醇30 s、3% NaClO3浸泡15 min，每5 min震蕩一次。再用無菌水清洗至無NaClO3殘留。隨后將消毒后的種子浸泡在含有50 mg·L-1卡那霉素的無菌水中，在室溫浸泡2 d后，放置28℃恒溫培養(yǎng)箱進行催芽萌發(fā)，催芽期間每天更換含有卡那霉素的無菌水。最后，選取長勢健壯的幼苗進行移栽。

1.2.4.3 過表達OsZFP6水稻對NaHCO3抗性分析

萌發(fā)7 d后，選取長勢一致的幼苗。分別置于終濃度為0.0、5.0、7.5、10.0 mmol·L-1NaHCO3的1/8 MS營養(yǎng)液中，進行脅迫處理3 d，并每天進行更換處理液，脅迫結(jié)束后進行表型觀察。對其株高、鮮重進行測量，對植株器官的丙二醛以及H2O2含量進行測量：采用硫代巴比妥酸(TBA)顯色法[24]對植株組織器官中丙二醛含量進行測定，采用硫酸鈦比色法對植株組織器官內(nèi)H2O2含量進行測定[25]。

2 結(jié)果與分析

2.1 水稻OsZFP6基因的生物信息學分析

經(jīng)過網(wǎng)站NCBI對比鑒定分析，結(jié)果表明OsZFP6基因全長1 560 bp，其中5′和3′端非編碼區(qū)長度分別是458和186 bp，其編碼蛋白核酸分子量為33.6 kDa，等電點為6.75。軟件預測結(jié)果表明該基因ORF區(qū)域包含915 bp編碼304個氨基酸(圖1a)，OsZFP6基因在216～232 bp，存在鋅指蛋白結(jié)構(gòu)域(圖1b)，通過對OsZFP6蛋白(登錄號BAG90927)保守結(jié)構(gòu)域進行序列比對，結(jié)果表明保守基序列為C-X2-C-X4-H-X4-C(詳見圖1c)。

2.2 OsZFP6基因在時間與空間的表達特性分析

本研究檢測OsZFP6在脅迫處理后的水稻幼苗中的表達量(圖2a)，植株經(jīng)過H2O2處理后，OsZFP6在葉片中表達量明顯提高，在經(jīng)過脅迫處理12 h后，處理組基因表達量是對照組的2.8倍，在48 h時表達量開始下降。植株經(jīng)過NaHCO3處理后(圖2b)，OsZFP6在葉片中表達量明顯提高，在經(jīng)過脅迫處理24 h后，基因表達量是對照組的2.9倍，在48 h時表達量開始下降。

圖1 OsZFP6氨基酸序列、結(jié)構(gòu)域以及鋅指蛋白保守序列分析 a.OsZFP6蛋白氨基酸序列分析；b.OsZFP6蛋白保守結(jié)構(gòu)域模型；c.OsZFP6蛋白的C2HC鋅指蛋白保守序列Fig.1 Analysis amino acid sequence, conserved domains and conserved sequence of zinc finger protein of OsZFP6 a.The amino acid sequence of OsZFP6; b.The schematic of conserved domains of OsZFP6; c.Conserved sequence of C2HC zinc finger protein of the OsZFP6 protein

圖2 逆境脅迫下的OsZFP6基因表達特性分析 a.H2O2脅迫處理后OsZFP6表達分析；b.NaHCO3脅迫處理后OsZFP6表達分析 誤差線表示3個技術(shù)重復的標準誤差。Fig.2 Analysis expression of OsZFP6 under stress a.Analysis expression of OsZFP6 under H2O2 stress; b.Analysis expression of OsZFP6 under NaHCO3 stress Error bars indicate the SD of three biological replicates.

2.3 水稻OsZFP6蛋白亞細胞定位分析

2.3.1 亞細胞定位預測分析

經(jīng)過對該基因所編碼的蛋白發(fā)揮功能的場所進行預測，其發(fā)揮功能的場所是細胞核的可能性最大，其可能性達到73.9%(見表1)，推測OsZFP6蛋白是屬于主要在細胞核區(qū)域發(fā)揮功能的轉(zhuǎn)錄因子。

表1 OsZFP6蛋白亞細胞定位預測

2.3.2 亞細胞定位檢測

為了進一步研究OsZFP6蛋白的功能，我們采用水稻原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化的方法對其進行亞細胞定位分析，通過檢測綠色熒光蛋白發(fā)光信號(如圖3所示)，驗證表明發(fā)現(xiàn)OsZFP6蛋白發(fā)揮功能的場所在細胞核。

2.4 過表達OsZFP6水稻分子鑒定與篩選

為了研究OsZFP6基因功能，獲得了OsZFP6的過量表達轉(zhuǎn)基因植物，為了驗證植株與基因35S::OsZFP6整合情況，在獲得過表達T0代具有卡那霉素抗性的植株中，提取幼嫩葉片基因組DNA。同時，以pBI121::OsZFP6::GFP質(zhì)粒和野生型水稻(龍粳11)DNA分別做陽性、陰性對照進行PCR擴增。PCR產(chǎn)物經(jīng)過1%瓊脂糖凝膠電泳分析(詳見圖4)，只有陰性對照并沒有擴增出目的條帶。結(jié)果表明OsZFP6已經(jīng)整合到水稻基因組DNA上，所獲得植株為轉(zhuǎn)基因植株。

為了驗證帶有卡那霉素抗性的陽性植株基因表達情況，確保過表達OsZFP6基因正常發(fā)揮功能，我們進一步對陽性植株進行qRT-PCR分析。結(jié)果如圖5所示，通過正常條件下培養(yǎng)的植株的表達量分析。在所獲得的卡那霉素抗性的植株中，在轉(zhuǎn)基因植株中OsZFP6基因相對表達量明顯提高。在50 mg·L-1卡那霉素中對T3代過表達水稻進行抗性篩選萌發(fā)，萌發(fā)結(jié)果如圖6所示，過表達OsZFP6不同株系的生長情況明顯優(yōu)于對照株系，然而過表達株系之間生長情況差異不明顯。結(jié)果表明成功獲得過表達植株，可進行相關(guān)脅迫實驗。

圖3 OsZFP6蛋白在水稻原生質(zhì)體亞細胞定位Fig.3 Subcellular localization of OsZFP6 protein in rice protoplast

圖4 轉(zhuǎn)基因植株T0代株系PCR鑒定 M.DNA Marker；CK+、CK-分別為陽性對照和陰性對照；#1～#7. 7個T0不同株系Fig.4 PCR detection of transgenic T0 lines M.DM2000 Marker; CK+.The plasmid used as a positive control; CK-.WT DNA used as a negative control; #1-#7.The transgenic T0 lines

圖5 轉(zhuǎn)基因植株T0代株系轉(zhuǎn)錄表達鑒定 WT.野生型植株；#1～#7. 7個T0不同株系 誤差線表示3個技術(shù)重復的標準誤差。Fig.5 Accumulation of OsZFP6 transcripts in overexpressed lines and wild type lines WT. Wild type; #1-#7.The transgenic T0 lines Error bars indicate the SD of three biological replicates.

圖6 轉(zhuǎn)基因植株T3代卡那霉素抗性篩選 NT.野生型植株；#1～#5.不同株系Fig.6 Screening kanamycin resistance of transgenic plants in T3 generation NT.Non-transgenic plant; #1-#5.The transgenic lines

圖7 過表達植株與非轉(zhuǎn)基因植株在NaHCO3處理3 d后表型分析 NT.非轉(zhuǎn)基因植株；#1～#5. T4代不同株系Fig.7 Phenotype of OsZFP6 overexpressed and non-transgenic plants after treatment with NaHCO3 for 3 days NT.Non-transgenic plants; #1-#5.The different lines of T4

圖8 NaHCO3敏感性實驗分析植株生理指標測量 A.植株株高測量；B.植株鮮重測量；C.丙二醛含量測量；D.H2O2的測量 誤差線表示3個技術(shù)重復的標準差，大寫字母代表圖片順序，小寫字母代表差異顯著性(P<0.05)。Fig.8 Measurement of physiological indices based on sensitivity analysis of NaHCO3 sensitivity assays A.The height of lines; B.The fresh weight of lines; C.The contents of MDA in lines; D.The H2O2 levels of lines Error bars indicate the SD of three biological replicates,capital letters represent the order of pictures,and lowercase letters represent differences in significance(P<0.05)

2.5 過表達OsZFP6水稻對NaHCO3抗性分析

將收獲5個株系的T3的種子和龍粳11野生型種子，萌發(fā)7 d后選取長勢一致的幼苗。分別置于終濃度為0.0、5.0、7.5、10.0 mmol·L-1NaHCO3的1/8MS營養(yǎng)液中，進行脅迫處理3 d后進行表型觀察。結(jié)果表明(如圖7所示)，植株在正常的條件下，在表型上，NT植株與過表達OsZFP6水稻沒有差別。隨著NaHCO3濃度的增加，NT植株生長受到抑制比過表達OsZFP6水稻明顯，并且過表達水稻之間生長情況差異不明顯。

通過對其株高、鮮重以及植株體內(nèi)丙二醛及H2O2含量測定，結(jié)果如圖8所示，NT水稻植株和過表達植株在正常的條件培養(yǎng)下，通過比較鮮重、株高、植株體內(nèi)的丙二醛以及H2O2含量，兩者之間差異不明顯。在隨著NaHCO3濃度的增加，在鮮重、株高生理指標上，NT水稻植株與過表達OsZFP6水稻植株都呈現(xiàn)下降趨勢，但過表達OsZFP6水稻的鮮重、株高都優(yōu)于NT植株，并且過表達水稻之間情況差異不明顯。同時，NT植株以及過表達OsZFP6水稻體內(nèi)丙二醛以及H2O2都呈現(xiàn)上升趨勢，但過表達OsZFP6水稻植株體內(nèi)丙二醛以及H2O2低于NT植株，并且過表達水稻之間情況差異不明顯。結(jié)果表明：在過表達OsZFP6水稻的幼苗期，過表達OsZFP6能夠增強水稻對NaHCO3的耐受性，為選育水稻新品系提供參考依據(jù)。

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