陸菲 雷文靜 范貝 梁鵬飛 李薇 陳俊 查定軍

細(xì)胞外基質(zhì)對(duì)于正常組織的結(jié)構(gòu)維持、細(xì)胞行為調(diào)節(jié)以及基因表達(dá)有重要的作用[1]。腱糖蛋白是細(xì)胞外基質(zhì)中的一種多功能、表達(dá)模式各異的糖蛋白家族[2]，由N-末端頭區(qū)、半胱氨酸域、表皮生長(zhǎng)因子(EGF)重復(fù)序列、Ⅲ型纖維連接蛋白(FN-Ⅲ)樣重復(fù)結(jié)構(gòu)、C-末端纖維蛋白原結(jié)構(gòu)組成[3]。該家族的成員包括腱糖蛋白-C(tenascin-C)、腱糖蛋白-R(tenascin-R)、腱糖蛋白-X(tenascin-X)，以及最后被發(fā)現(xiàn)的腱糖蛋白-W (tenascin-W)，也稱作腱糖蛋白-N(tenascin-N)。應(yīng)用序列同源性搜索基因組數(shù)據(jù)庫(kù)，證實(shí)tenascin-W是最后一個(gè)腱糖蛋白家族成員[2]。Weber首次在斑馬魚中發(fā)現(xiàn)該蛋白[4]，故而命名為“tenascin-W”。該蛋白在小鼠中的同系物由Neidhardt首次發(fā)現(xiàn)，因而被命名為“tenascin-N”[5]，后通過同線性分析證實(shí)tenascin-N就是tenascin-W。

TNN基因編碼腱糖蛋白-W(tenascin-W，TN-W),在人類該基因稱為TNN，在鼠類稱為Tnn。tenascin-C 和tenascin-W均可形成六臂體結(jié)構(gòu)[1]，推測(cè)其具有相似的功能。tenascin-C蛋白中某些結(jié)構(gòu)的功能已經(jīng)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，因而tenascin-W蛋白潛在的功能可通過對(duì)目前已發(fā)表的tenascin-C的研究結(jié)果進(jìn)行預(yù)測(cè)，二者的FN-Ⅲ樣結(jié)構(gòu)均包含整合素結(jié)合位點(diǎn)，可以結(jié)合并激活toll樣受體4(TLR4)[6]。tenascin-W、tenascin-C均可以與Wnt3a結(jié)合，但是與之結(jié)合的部位并不清楚[7]。tenascin-W與tenascin-C的EGF重復(fù)序列幾乎相同，后者被證實(shí)可以激活EGF受體[8]。研究發(fā)現(xiàn)tenascin-W在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中多由神經(jīng)元表達(dá)[5]。已有對(duì)耳聾家系的研究證實(shí)TNC基因的突變可引起家系常染色體顯性遺傳性聾，該基因編碼tenascin-C[9]，研究表明tenascin-C在毒性損傷所致的鳥類前庭器官感覺受體的修復(fù)中發(fā)揮作用[10]，故而推斷該基因突變可能引起耳蝸內(nèi)修復(fù)功能的異常，導(dǎo)致聽力逐漸下降。目前尚無文獻(xiàn)報(bào)道Tnn基因在小鼠耳蝸中的表達(dá)模式及相關(guān)功能研究，故本研究通過觀察Tnn基因編碼的tenascin-W在不同發(fā)育階段小鼠耳蝸的表達(dá)情況，初步探討其在聽覺系統(tǒng)中的功能。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 實(shí)驗(yàn)用C57BL/6小鼠來源于空軍軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF級(jí)動(dòng)物房。取出生后(postnatal day，P)1、3、7、14、28天(P1、P3、P7、P14、P28)的C57BL/6小鼠各6只，每個(gè)階段取3只小鼠(6只耳蝸)用于冰凍切片免疫熒光標(biāo)記觀察，3只小鼠(6只耳蝸)用于實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-qPCR)檢測(cè)；另取3只P7小鼠(6只耳蝸)用于Western blot檢測(cè)。

1.2主要試劑 蛋白提取試劑盒購(gòu)自美國(guó)Invent公司，耳蝸總RNA提取、反轉(zhuǎn)錄、RT-qPCR試劑盒購(gòu)自日本TAKARA公司，TNN抗體、免疫熒光二抗抗體購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司，Ⅲ型β-tubulin抗體、β-actin抗體購(gòu)自美國(guó)Gene Tex公司，DAPI、SDS-PAGE凝膠電泳試劑盒購(gòu)自北京Solarbio公司。驢血清購(gòu)自西安晶彩生物科技公司，Tnn及β-actin 的RT-qPCR引物由擎科澤西生物科技公司合成。辣根過氧化酶抗兔抗體購(gòu)自晶彩科技有限公司，免疫熒光及Western blot抗體稀釋液購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)公司。

1.3免疫熒光染色檢測(cè)小鼠耳蝸tenascin-W表達(dá) 對(duì)不同發(fā)育時(shí)期小鼠耳蝸取材，P7及P7天齡以下的小鼠直接斷頭后迅速取出耳蝸后用多聚甲醛灌注固定，大于P7天齡的小鼠水合氯醛麻醉后迅速取出耳蝸，依次進(jìn)行4%多聚甲醛固定、10%EDTA脫鈣、30%蔗糖脫水、OCT包埋劑包埋后，于冰凍切片機(jī)行耳蝸連續(xù)冰凍組織切片，片厚10 μm，置于-20 ℃保存。采用免疫熒光的方法檢測(cè)小鼠耳蝸中的tenascin-W的表達(dá)情況，SGNs用特異性抗體Ⅲ型β-tubulin標(biāo)記。Triton打孔，驢血清37 ℃封閉30 min，一抗4 ℃孵育3 d，二抗4 ℃孵育1 d，DAPI染核10 min。目標(biāo)蛋白的平均熒光強(qiáng)度采用Image-Pro Plus軟件進(jìn)行測(cè)量。同時(shí)設(shè)置PBS空白對(duì)照組。

1.4RT-qPCR檢測(cè) 收集P1、P3、P7、P14、P28期的小鼠耳蝸樣本，進(jìn)行總RNA的提取，測(cè)量濃度后調(diào)至統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，按照相同的體系反轉(zhuǎn)錄為cDNA，轉(zhuǎn)錄后的cDNA放于-20 ℃進(jìn)行保存。搜索哈佛大學(xué)Primer Bank查找Tnn基因的引物，進(jìn)行BLAST驗(yàn)證。最終選取目的基因Tnn引物上游為5'-AGGTGAGGGCAGACTTACAGA-3'，下游5'-CGACAGCTTGTACCGCTCTTT-3'，內(nèi)參β-actin引物上游為5'-GGCTGTATTCCCCTCCATCG-3'，下游為5'-CCAGTTGGTAACAATGCCATGT-3'。操作方法參照TAKARA總RNA提取、反轉(zhuǎn)錄及實(shí)時(shí)定量試劑盒標(biāo)準(zhǔn)。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件為37 ℃退火15 min，85 ℃延伸5 s。RT-qPCR反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變形30 s，PCR反應(yīng)采取三步法，95 ℃變性5 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，循環(huán)39次。RT-qPCR儀器型號(hào)為CFX96，計(jì)算方法為每個(gè)樣品的閾值循環(huán)次數(shù)Cq值，應(yīng)用熔解曲線分析引物擴(kuò)增的特異性，目的基因的相對(duì)表達(dá)量采用和內(nèi)參基因β-actin比較，計(jì)算方法為2-ΔΔCq，用歸一法比較各階段Tnn mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

1.5Western blot檢測(cè) 收集P7小鼠耳蝸的樣本并提取總蛋白，因?yàn)榛赗T-qPCR結(jié)果，P7小鼠耳蝸tenascin-W mRNA相對(duì)表達(dá)量最高，故只取P7小鼠進(jìn)行該實(shí)驗(yàn)，方法參照Invent試劑盒蛋白提取方法，提取后的總蛋白行BCA法定量，調(diào)整至相同濃度后加入上樣緩沖液，煮沸5 min。用8%SDS聚丙烯酰胺凝膠將蛋白樣品(30 μg)分離后轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5%牛奶封閉2 h，加入一抗4 ℃過夜，TBST洗膜3次后室溫孵育二抗2 h，TBST洗膜3次后行化學(xué)法發(fā)光顯影。

2 結(jié)果

2.1tenascin-W在不同發(fā)育階段小鼠耳蝸中的表達(dá) 免疫熒光標(biāo)記結(jié)果提示，tenascin-W在P1、P3、P7、P14、P28小鼠的耳蝸均有表達(dá)，在P7及小于P7天齡小鼠彌漫表達(dá)于蝸管結(jié)構(gòu)，包括血管紋(stria vascularis，SV)、Corti器(organ of Corti，OC)及螺旋神經(jīng)節(jié)(spiral ganglion，SG)(圖1)；P14、P28小鼠在OC處熒光強(qiáng)度降低為0，而在SG熒光強(qiáng)度仍較強(qiáng)；不同發(fā)育階段小鼠耳蝸SV處均檢測(cè)到tenascin-W(圖1)。在P1、P3小鼠耳蝸，tenascin-W蛋白在SG和OC的平均熒光強(qiáng)度無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(均為P>0.05)；在P7、P14、P28小鼠耳蝸SG與OC的平均熒光強(qiáng)度差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.001)；在P1至P28各階段小鼠耳蝸SV處均檢測(cè)到tenascin-W平均熒光強(qiáng)度有降低趨勢(shì)，且與SG、OC比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(圖1，表1)。高倍鏡下觀察P28小鼠耳蝸SG，用DAPI染核，顯示目標(biāo)蛋白與核熒光染色部位不重合，tenascin-W位于核周圍胞漿中(圖2)。為了進(jìn)一步區(qū)分該蛋白表達(dá)在SGNs或是神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，用Ⅲ型β-tubulin抗體特異性標(biāo)記SGNs，結(jié)果顯示在SG，Tnn與Ⅲ型β-tubulin共定位，表達(dá)在SGNs核周的胞體胞漿內(nèi)(圖3)。

表1 不同發(fā)育階段小鼠耳蝸不同部位tenascin-W的平均熒光強(qiáng)度

2.2Tnn mRNA在不同發(fā)育階段小鼠耳蝸的表達(dá) RT-qPCR結(jié)果顯示在P1、P3、P7、P14、P28小鼠耳蝸內(nèi)均有Tnn mRNA的表達(dá)，相對(duì)表達(dá)量(2-ΔΔCq)分別為1.00±0.00、1.52±0.89、35.89±6.47、3.79±2.37、3.55±1.69，其中在P7小鼠耳蝸內(nèi)mRNA相對(duì)表達(dá)量最高，其余各階段相對(duì)表達(dá)量低，P7與各階段相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.001)。

2.3tenascin-W在P7小鼠耳蝸內(nèi)表達(dá)的Western blot檢測(cè)結(jié)果 根據(jù)RT-qPCR結(jié)果，Tnn mRNA在P7相對(duì)表達(dá)量最高，提取P7小鼠耳蝸總蛋白;Western blot結(jié)果顯示在P7小鼠耳蝸提取的蛋白中檢測(cè)到tenascin-W蛋白的條帶，證實(shí)腱糖蛋白tenascin-W在小鼠耳蝸中有表達(dá)?？瞻讓?duì)照在相同位置未檢測(cè)到條帶(圖4)。

3 討論

腱糖蛋白家族是一種細(xì)胞外基質(zhì)糖蛋白，目前已有細(xì)胞外基質(zhì)蛋白的病理性功能改變引起遺傳性聾的報(bào)道，例如:Usherin蛋白異常引起IIA型Usher綜合征[11]，IV型膠原蛋白表達(dá)的改變導(dǎo)致Alport綜合征[12]，XI型膠原蛋白異常致非綜合征型聾[13]。tenascin-W是細(xì)胞外基質(zhì)腱糖蛋白家族的一員，推測(cè)該蛋白可能與聽覺相關(guān)，其表達(dá)異?？赡苡绊懧犛X功能。Ceacam16基因編碼的蛋白為細(xì)胞黏附分子16(cell adhesion molecule 16)，由外毛細(xì)胞表達(dá)，編碼的蛋白位于纖毛的頂端及蓋膜，該基因的突變引起常染色體顯性遺傳性聾[14]。有文獻(xiàn)報(bào)道tenascin-W表達(dá)量的改變可以引起小鼠成肌細(xì)胞黏附功能異常[1]。因此，推測(cè)tenascin-W表達(dá)異?？赡芘c細(xì)胞黏附功能異常相關(guān)。

Tnn基因的表達(dá)模式及其在聽覺系統(tǒng)中的作用尚未知，本研究結(jié)果顯示tenascin-W主要表達(dá)在螺旋神經(jīng)節(jié)。由于通常在P21至P30小鼠才能形成完整的聽覺通路及聽覺功能[15]，因此本研究選取P28小鼠SGNs與DAPI共染，顯示tenascin-W不與DAPI共定位，與Ⅲ型β-tubulin在SGNs共定位在胞體的胞漿內(nèi)；RT-qPCR結(jié)果顯示P7小鼠耳蝸中Tnn mRNA相對(duì)量最高，且Western blot法也檢測(cè)到tenascin-W在P7小鼠耳蝸內(nèi)的表達(dá)。

SGNs是特異的雙極神經(jīng)元及聽覺系統(tǒng)的初級(jí)神經(jīng)元，可激發(fā)產(chǎn)生動(dòng)作電位，將毛細(xì)胞的聽覺信號(hào)傳至中樞神經(jīng)系統(tǒng)[15]；SGNs起源于前庭耳蝸神經(jīng)節(jié)，之后在耳蝸前感覺區(qū)域發(fā)育成熟[16]；最終，SGNs伸出樹突與毛細(xì)胞基底部形成突觸連接，其軸突之間成束形成第Ⅷ對(duì)腦神經(jīng)的聽覺部分[17]。本研究證實(shí)tenascin-W在小鼠耳蝸中有表達(dá)，且在P7小鼠表達(dá)量最高，推測(cè)該蛋白可能對(duì)SGNs的發(fā)育及功能具有調(diào)節(jié)作用。既往研究通過原位雜交證實(shí)tenascin-W在小鼠海馬體神經(jīng)元中表達(dá)，影響海馬體神經(jīng)元的神經(jīng)突生長(zhǎng)及神經(jīng)元遷移[1],提示tenascin-W在神經(jīng)元發(fā)育中的潛在作用。因此推測(cè)Tnn表達(dá)異常或可影響神經(jīng)元神經(jīng)突的向外生長(zhǎng)及細(xì)胞遷移，導(dǎo)致聽覺信號(hào)的傳入受阻，引起聽功能受損。

圖2 耳蝸冰凍切片熒光染色顯示P28小鼠耳蝸的螺旋神經(jīng)節(jié)中tenascin-W與DAPI不共染(×60) 藍(lán)色熒光為DAPI,紅色熒光為目的蛋白tenascin-W,control為不加tenascin-W抗體的PBS空白對(duì)照。bar=20 μm

圖3 耳蝸冰凍切片熒光染色顯示P28小鼠耳蝸的螺旋神經(jīng)節(jié)中tenascin-W與Ⅲ型β-tubulin共定位(×60) 藍(lán)色熒光為DAPI,紅色熒光為目的蛋白tenascin-W,綠色熒光為Ⅲ型β-tubulin,control為不加tenascin-W抗體的PBS空白對(duì)照。bar=20 μm

圖4 Western blot檢測(cè)tenascin-W在P7小鼠內(nèi)耳的表達(dá) tenascin-W一抗孵育的PVDF膜在180 kDa附近出現(xiàn)蛋白條帶,未加入tenascin-W抗體的TBST空白對(duì)照在相同位置未出現(xiàn)條帶

本研究證實(shí)了tenascin-W在各發(fā)育階段小鼠耳蝸中均有表達(dá)，且主要定位于SGNs中，推測(cè)該蛋白在小鼠SGNs的發(fā)育及功能中可能發(fā)揮作用，其表達(dá)異常可能引起聽覺功能受損；但其在聽覺系統(tǒng)中的功能及作用機(jī)制研究尚無文獻(xiàn)報(bào)道，通過Tnn基因敲除小鼠模型的構(gòu)建，對(duì)其功能、機(jī)制及相關(guān)通路可進(jìn)行更深入的探究,探討該基因?qū)β牴δ艿挠绊懠跋嚓P(guān)機(jī)制，進(jìn)一步明確其在聽覺系統(tǒng)中的作用。