丁大連 張建輝 楊琨 蔣海燕 亓衛(wèi)東 時海波 劉芳 李鵬 Richard Salvi

某些哺乳類動物，如：人類或常用實驗動物豚鼠，耳蝸感覺上皮和周邊神經(jīng)系統(tǒng)在出生前已經(jīng)基本發(fā)育完善，因而從一出生就具備了基本正常的聽覺反應[1，2]，但是大鼠或小鼠的耳蝸在出生時尚未發(fā)育完全，一般要在出生后15天才開始出現(xiàn)部分聽覺反應，在出生后18天以上才開始具備接近正常的聽覺反應能力[3，4]；因此，處于嬰幼兒階段的大鼠或小鼠或許更適合于研究聽覺的發(fā)生和耳蝸的后期發(fā)育過程。

耳蝸與中樞的神經(jīng)聯(lián)系包含著傳入和傳出兩個系統(tǒng)，其中傳入神經(jīng)系統(tǒng)是將耳蝸內(nèi)感覺上皮產(chǎn)生的聽覺沖動信號經(jīng)中樞聽覺傳入通路傳送到各級聽覺中樞直至大腦聽覺皮層被機體感知，傳出神經(jīng)系統(tǒng)則是位于腦干上橄欖核的由高位聽覺中樞下行纖維調(diào)控的參與維持聽覺敏感度和參與調(diào)控和保護聽覺器官的耳蝸傳出神經(jīng)元。從耳蝸傳出神經(jīng)元發(fā)出的大部分神經(jīng)纖維下行分布到耳蝸的感覺上皮，少部分傳出神經(jīng)纖維分布到耳蝸核。耳蝸傳出神經(jīng)主要包括調(diào)控外毛細胞的內(nèi)側(cè)橄欖耳蝸(medial olovocochlear, MOC)和調(diào)控內(nèi)毛細胞底部傳入神經(jīng)纖維的外側(cè)橄欖耳蝸(lateral olovocochlear system, LOC)兩支不同的傳出神經(jīng)系統(tǒng)[5～7]。傳出神經(jīng)系統(tǒng)通過神經(jīng)遞質(zhì)的釋放使神經(jīng)沖動信號在神經(jīng)元與效應器之間或神經(jīng)元與神經(jīng)元之間傳遞，傳出神經(jīng)的受體包含多種神經(jīng)活性物質(zhì)，例如：乙酰膽堿、降鈣素基因相關(guān)肽(calcitonin gene-related peptide，CGRP)、r-氨基丁酸(GABA)，多巴胺、腦啡肽及強啡肽等，目前接受膽堿能受體的乙酰膽堿酯酶(acetylcholinesterase，AchE)和參與傷害性信息傳遞的CGRP被認為是耳蝸內(nèi)傳出神經(jīng)遞質(zhì)的主要受體,因此，AchE和CGRP的組織化學反應產(chǎn)物被較多地作為耳蝸傳出神經(jīng)末梢的特異性標記[8～13]。為了了解耳蝸傳出神經(jīng)在耳蝸后期發(fā)育過程中抵達耳蝸的確切時間和AchE及CGRP這兩種耳蝸傳出神經(jīng)末梢標記蛋白在耳蝸螺旋器中表達的異同，本研究觀察了出生后3～15天及出生后4個月的大鼠耳蝸中AchE和CGRP的時空分布，報告如下。

1 材料與方法

1.1實驗動物及分組 受試動物為出生后0、3、5、7、10、12、15和120天的Sprague Dawley大鼠(Charles River Laboratories, Wilmington, MA)各5只，所有動物的使用和飼養(yǎng)程序均按照美國國立衛(wèi)生研究院發(fā)布指南并得到布法羅大學實驗動物管理委員會的批準。

1.2全耳蝸基底膜取材 所有受試大鼠的顳骨在指定的出生后不同時間被取出并立刻浸入10%福爾馬林PBS溶液固定3小時，然后在解剖顯微鏡下常規(guī)分離取出全耳蝸基底膜[10～14]。

1.3免疫組織化學染色方法 在熒光顯微鏡下觀察耳蝸神經(jīng)纖維及末梢的免疫組織化學染色方法與先前所采用的方法[12,14]基本相同。應用Mouse anti-Tublin抗體標記出生后不同時間大鼠耳蝸的聽神經(jīng)纖維及其神經(jīng)末梢，應用Rabbit anti-CGRP抗體標記出生后不同時間大鼠耳蝸傳出神經(jīng)末梢的CGRP，應用Mouse anti-AchE抗體標記出生后不同時間大鼠耳蝸傳出神經(jīng)末梢的AchE，同時應用ToPro-3復染出生后不同時間大鼠耳蝸基底膜細胞的細胞核。用于免疫熒光標記的耳蝸基底膜在固定后被取出，經(jīng)PBS漂洗后浸入用含有1% Triton X-100和5%羊血清或驢血清的PBS溶液稀釋100倍的一抗溶液(Mouse anti-Tublin抗體，或Rabbit anti-CGRP抗體，或Mouse anti-AchE抗體),在4 ℃冰箱中孵育24小時；然后用PBS溶液充分漂洗樣品后，將樣品浸入用含有1% Triton X-100和5%羊血清或驢血清的PBS溶液稀釋200倍的與一抗和血清相對應的不同熒光標記的二抗溶液孵育2小時，再用ToPro-3染色液標記細胞核30分鐘，最后將基底膜平整鋪放在載玻片上的甘油滴中，蓋上蓋玻片，在共聚焦熒光顯微鏡下，應用不同的激發(fā)光分別探測綠色熒光標記的免疫組化產(chǎn)物(λabc/λem=488/520 nm)和紅色熒光標記的免疫組化產(chǎn)物(λabc/λem=550/570 nm)以及藍色熒光標記的細胞核(λabc/λem=642/661 nm)。應用Confocal LSM Image Examiner和Adobe Photoshop 5.5軟件對共聚焦圖像資料進行不同圖像層次和不同熒光信號的采集、合并及處理。

1.4酶組織化學染色方法 應用銅-鉛-硫膽堿染色標記技術(shù)顯示AchE的酶組織化學標記方法與先前所采用的方法[10,11,13]相同。有關(guān)AchE的酶組織化學染色技術(shù)和耳蝸鋪片方法簡單介紹如下：首先在室溫下將分離取下的耳蝸基底膜浸入到0.1 mol/L醋酸鹽緩沖液(pH6.0)浸泡30分鐘，然后移入到新鮮配制的AchE孵育液[包含5 mg溶于6.5 ml 0.1 mol/L醋酸鹽緩沖液(pH6.0)的碘化乙酰硫膽堿，0.5 ml 0.1 mol/L枸櫞酸鈉溶液、1 ml 30 mmol/L硫酸銅溶液、1 ml雙蒸餾水，1 ml 5 mmol/L鐵氰化鉀溶液]溫育30分鐘，用0.1 mol/L醋酸鹽緩沖液(pH6.0)漂洗基底膜樣品三次后移入1%硫化銨溶液顯色1分鐘；然后用0.1 mol/L硝酸鈉溶液漂洗五次，再將樣品浸入0.1%硝酸銀溶液1分鐘；經(jīng)0.1 mol/L硝酸鈉溶液漂洗1分鐘后再用0.1 mol/L醋酸鹽緩沖液(pH6.0)漂洗1分鐘；最后常規(guī)將耳蝸基底膜鋪放在載玻片上的甘油滴中，蓋上蓋玻片，在普通光學顯微鏡下觀察并拍照。

2 結(jié)果

2.1耳蝸傳入和傳出神經(jīng)纖維在耳蝸基底膜上的時空分布 應用Tublin免疫組織化學方法顯示的是耳蝸基底膜上所有的傳入和傳出神經(jīng)絲及其末梢的分布，雖然Tublin標記并不能區(qū)分這些神經(jīng)纖維到底是傳入神經(jīng)還是傳出神經(jīng)，但是卻可以根據(jù)穿越耳蝸Corti隧道(Corti’s tunnel)的具有耳蝸傳出神經(jīng)隧道螺旋束(tunnel spiral bundle)解剖學特點的神經(jīng)纖維，來判斷來自內(nèi)側(cè)橄欖耳蝸傳出神經(jīng)系統(tǒng)的隧道放射束開始穿越Corti隧道的確切時間。結(jié)果顯示，耳蝸傳出神經(jīng)的隧道放射束是在大鼠出生后第七天才穿越耳蝸Corti隧道并與外毛細胞建立起突觸聯(lián)系(圖1)。

2.2耳蝸基底膜上CGRP的時空分布 根據(jù)CGRP免疫組織化學反應標記結(jié)果，發(fā)現(xiàn)直到出生后第三天，耳蝸基底膜上無CGRP表達(圖2a、2b)；然而，在大鼠出生后第五天開始CGRP出現(xiàn)在內(nèi)毛細胞周圍和底部(圖2c)，并且這種特異性表達在耳蝸內(nèi)毛細胞周圍的CGRP將保持終生(圖2d～h)。但是值得特別注意的是，在耳蝸傳出神經(jīng)內(nèi)側(cè)螺旋束的神經(jīng)纖維并未見CGRP表達，在耳蝸傳出神經(jīng)上隧道放射束的神經(jīng)纖維和末梢也未見CGRP表達(圖2c～h)。

2.3耳蝸基底膜上AchE的時空分布 根據(jù)AchE熒光免疫組織化學反應標記結(jié)果，直到大鼠出生后第五天AchE尚未進入Corti器(圖3a～c);然而，在大鼠出生后第七天AchE卻已經(jīng)同時出現(xiàn)在耳蝸傳出神經(jīng)內(nèi)側(cè)螺旋束和隧道螺旋束的神經(jīng)纖維和末梢(圖3d～h)；應用銅-鉛-硫膽堿染色標記AchE的酶組織化學反應產(chǎn)物在普通光學顯微鏡下顯示相同結(jié)果(圖4a～h)。

2.4耳蝸基底膜切片上的CGRP和AchE雙重標記 為了更好證明CGRP和AchE在耳蝸Corti器的表達部位和出現(xiàn)時間都不相同，除了上述耳蝸基底膜單個蛋白標記的表面制備鋪片結(jié)果之外，還應用CGRP和AchE雙重免疫組織化學方法同時顯示大鼠耳蝸基底膜上耳蝸傳出神經(jīng)的CGRP和AchE，并從耳蝸基底膜切片的角度再次證實CGRP和AchE在大鼠耳蝸基底膜上的表達位置和表達時間完全不同(圖5)。值得注意的是，如果在內(nèi)毛細胞底部的CGRP和AchE定位完全相同，表達綠色熒光信號的CGRP和表達紅色熒光信號的AchE在重疊部位顯示成黃色熒光信號；但是如果兩種蛋白的表達位置不相同，則綠色熒光信號和紅色熒光信號不會重疊成黃色。從圖5d～h都可以看出，綠色熒光信號與紅色熒光信號并未重疊，提示CGRP和AchE在內(nèi)毛細胞底部內(nèi)側(cè)螺旋束的表達可能并不是在完全相同的部位。

3 討論

3.1耳蝸傳出神經(jīng)抵達Corti器的時間晚于傳入神經(jīng)系統(tǒng) 根據(jù)本實驗應用Tublin抗體標記神經(jīng)絲的免疫組化產(chǎn)物的觀察結(jié)果，可以確定耳蝸I型和II型傳入神經(jīng)纖維及末梢在大鼠出生的時候已經(jīng)與耳蝸內(nèi)外毛細胞建立起突觸聯(lián)系，這與以往的觀察結(jié)果[14]相一致。但是由腦干上橄欖核耳蝸傳出神經(jīng)元發(fā)出的耳蝸傳出神經(jīng)隧道螺旋束的神經(jīng)纖維在大鼠出生后第七天才抵達Corti器。說明耳蝸傳出神經(jīng)纖維末梢與耳蝸毛細胞之間的突觸聯(lián)系遠遠滯后于耳蝸的傳入神經(jīng)系統(tǒng)。

3.2CGRP在耳蝸基底膜上的時空分布 據(jù)文獻報道，大鼠耳蝸內(nèi)的CGRP在出生后第四天首先出現(xiàn)在大鼠耳蝸底回傳出神經(jīng)內(nèi)側(cè)螺旋束的神經(jīng)末梢[15,16]，這與本實驗在大鼠出生后第三天未發(fā)現(xiàn)CGRP但是卻在出生后第五天發(fā)現(xiàn)內(nèi)螺旋束神經(jīng)末梢中強烈表達CGRP的現(xiàn)象相吻合。雖然有文獻報道CGRP隨后也會出現(xiàn)在外毛細胞底部的傳出神經(jīng)末梢[8,9,17]，但是本實驗發(fā)現(xiàn)相對于內(nèi)側(cè)螺旋束神經(jīng)末梢中強烈表達的CGRP免疫組化產(chǎn)物，出現(xiàn)在外毛細胞底部的微弱熒光信號與樣品的背景色相同，因此，認為大鼠耳蝸Corti器中的CGRP主要定位在內(nèi)毛細胞底部內(nèi)側(cè)螺旋束的神經(jīng)末梢，但是既不表達在傳出神經(jīng)內(nèi)側(cè)螺旋束的神經(jīng)纖維，也不出現(xiàn)在支配外毛細胞的隧道螺旋束的神經(jīng)纖維及末梢。

CGRP作為神經(jīng)肽的降鈣素肽家族成員之一遍布全身各個系統(tǒng)，參與調(diào)控機體各種復雜的生理功能。CGRP雖然在耳蝸內(nèi)側(cè)螺旋束的傳出神經(jīng)末梢有強烈的表達，但充其量只能說明出現(xiàn)在耳蝸傳出神經(jīng)內(nèi)側(cè)螺旋束神經(jīng)末梢的CGRP或許只是在這里參與疼痛感受或者參與鈣穩(wěn)態(tài)維持，卻并不一定意味著CGRP可以作為耳蝸傳出神經(jīng)系統(tǒng)特有的獨特蛋白，因為CGRP的表達畢竟遍及全身各個器官，而且并沒有特異性表達在整個耳蝸傳出神經(jīng)系統(tǒng)。

3.3AchE在耳蝸基底膜上的時空分布 作為傳出神經(jīng)系統(tǒng)的特異性標志酶之一，AchE的功能是將乙酰膽堿分解為膽堿和乙酸以阻止膽堿能神經(jīng)遞質(zhì)對突觸后膜的過度興奮作用。Zheng等曾將AchE用于證明耳蝸傳出神經(jīng)切除手術(shù)的成功與否，當耳蝸傳出神經(jīng)隨著前庭下神經(jīng)被成功切除而消失之后，耳蝸內(nèi)的AchE不復存在[13]。本實驗結(jié)果再次證實大鼠耳蝸內(nèi)的AchE遍布調(diào)控內(nèi)毛細胞底部傳入神經(jīng)纖維的外側(cè)橄欖耳蝸傳出神經(jīng)纖維及其末梢和調(diào)控外毛細胞的內(nèi)側(cè)橄欖耳蝸傳出神經(jīng)纖維及其末梢，這顯然與僅僅表達在內(nèi)側(cè)螺旋束神經(jīng)末梢的CGRP完全不同。從這個現(xiàn)象可以看出，雖然AchE和CGRP都被認為是耳蝸傳出神經(jīng)的標志性蛋白質(zhì)，但是前者表達在所有傳出神經(jīng)的細胞體和神經(jīng)纖維及其末梢，而后者僅僅出現(xiàn)在耳蝸傳出神經(jīng)內(nèi)側(cè)螺旋束的神經(jīng)末梢。如此看來，標記AchE顯然更有利于顯示全耳蝸的傳出神經(jīng)系統(tǒng)。本實驗結(jié)果證實，無論應用銅-鉛-硫膽堿的酶組織化學染色技術(shù)還是應用免疫組織化學方法標記AchE，都使我們有可能準確判斷耳蝸傳出神經(jīng)纖維在出生后何時入住到大鼠耳蝸Corti器。本研究發(fā)現(xiàn)AchE標記的耳蝸傳出神經(jīng)纖維在大鼠出生后第五天尚未抵達Corti器，直到出生后第七天才在基底膜上同時形成內(nèi)毛細胞下方的內(nèi)側(cè)螺旋束和穿越Corti隧道與外毛細胞建立突觸聯(lián)系的隧道螺旋束，可見出生后第六天很可能是耳蝸傳出神經(jīng)開始進入大鼠耳蝸基底膜的關(guān)鍵時刻。至于耳蝸傳出神經(jīng)纖維中AchE的表達會不會有可能稍許滯后于神經(jīng)絲結(jié)構(gòu)的出現(xiàn)，根據(jù)本研究顯示穿越Corti隧道的呈典型放射狀排布的隧道螺旋束傳出神經(jīng)纖維解剖學特征(圖1d～h，圖3d～h，圖4d～h)，可以確定大鼠耳蝸傳出神經(jīng)在出生后第五天之前確實沒有抵達Corti隧道，而AchE的表達位置與耳蝸傳出神經(jīng)纖維及其末梢的位置完全相同。

3.4傳出神經(jīng)纖維趨向性生長的引導信號 本實驗發(fā)現(xiàn)，CGRP在大鼠出生后第五天已經(jīng)出現(xiàn)在內(nèi)毛細胞的下方，而AchE標記的耳蝸傳出神經(jīng)纖維在大鼠出生后第七天才在基底膜上形成內(nèi)側(cè)螺旋束和隧道螺旋束并與內(nèi)毛細胞底部的I型傳入神經(jīng)纖維和外毛細胞的細胞體建立起突觸聯(lián)系，說明CGRP蛋白在耳蝸傳出神經(jīng)纖維進入耳蝸Corti器的前兩天就已經(jīng)提前出現(xiàn)在內(nèi)毛細胞的下方。既然用AchE標記的具備膽堿能受體的耳蝸傳出神經(jīng)纖維在大鼠出生后第七天之前尚未抵達耳蝸基底膜，說明預先出現(xiàn)在內(nèi)毛細胞下方的CGRP并不是伴隨著耳蝸傳出神經(jīng)末梢在Corti器的就位才開始出現(xiàn)，由此引出一系列需要思考的問題，那就是CGRP到底是不是來源于耳蝸傳出神經(jīng)系統(tǒng)？預先出現(xiàn)在內(nèi)毛細胞下方的CGRP會不會只是一種由內(nèi)毛細胞或與內(nèi)毛細胞相聯(lián)系的I型傳入神經(jīng)末梢釋放的誘導內(nèi)側(cè)螺旋束耳蝸傳出神經(jīng)纖維的引導信號？這是值得深入思考和探索的下一步研究課題。在神經(jīng)纖維生長的過程中，位于軸突生長尖端的生長錐具有“嗅探”引導信號的能力，從而使神經(jīng)纖維的生長方向遵循著精確路徑找到靶目標并與之建立起精準的突觸聯(lián)系。例如，內(nèi)耳感覺毛細胞在胚胎期與傳入神經(jīng)建立聯(lián)系的分化發(fā)育過程，既要依賴于毛細胞分泌神經(jīng)營養(yǎng)因子的吸引，同時，也要依賴于神經(jīng)節(jié)對假復層上皮的引導信號[18]，而耳蝸傳出神經(jīng)在尋找靶目標的過程可能同樣離不開分化中Corti器細胞釋放出的諸如鈣離子或乙酰膽堿類物質(zhì)的引導信號。據(jù)文獻報道，出生后當天的大鼠耳蝸內(nèi)毛細胞就已經(jīng)表現(xiàn)出膽堿能傳出輸入的生理學反應[19]。鑒于從腦干上橄欖核耳蝸傳出神經(jīng)元發(fā)出的傳出神經(jīng)纖維此時尚未進入到耳蝸Corti器，那么這些最早出現(xiàn)在內(nèi)毛細胞的乙酰膽堿很可能并不是由耳蝸傳出神經(jīng)釋放，而是由處于早期分化發(fā)育過程中的內(nèi)毛細胞釋放并成為一種引導耳蝸膽堿能傳出神經(jīng)纖維生長方向的引導信號。除了內(nèi)毛細胞之外，分化發(fā)育中的耳蝸支持細胞也可能參與了對神經(jīng)突觸發(fā)生的引導和調(diào)控作用，例如：在耳蝸的早期分化過程中，位于內(nèi)側(cè)螺旋溝的Kolliker 細胞及內(nèi)毛細胞周圍的支持細胞在釋放ATP的過程中通過激活內(nèi)毛細胞內(nèi)的嘌呤能受體而導致了鈣離子的釋放[20]。鑒于CGRP的功能與鈣的穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)有關(guān)，其表達可能會趨向于鈣波釋放活躍的靶細胞；而AchE的功能與乙酰膽堿的降解有關(guān)，其表達也有可能會趨向于乙酰膽堿釋放活躍的靶目標。如此看來，內(nèi)毛細胞或位于內(nèi)側(cè)螺旋溝的Kolliker細胞在早期分化發(fā)育階段釋放出的鈣離子和乙酰膽堿類生物化學信號是否有可能成為誘導耳蝸傳出神經(jīng)纖維趨向性生長的引導信號，還有待進一步的實驗研究予以澄清。