袁志鷹，黃惠勇，謝夢洲，周小江，李 亮，黃 培

(1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，長沙410208; 2.湖南省中藥飲片標(biāo)準(zhǔn)化及功能工程技術(shù)研究中心，長沙410208;3.湖南省藥食同源功能性食品工程技術(shù)研究中心，長沙410208)

中藥百合屬于多年生草本植物[1-2]，為我國常用的藥、食兩用大宗中藥材，常以鱗莖和珠芽作為藥、食兩用部位，始載于漢朝《神農(nóng)本草經(jīng)》，具有潤肺止咳和養(yǎng)心安神的功效[3]。湖南省龍山縣獨特的環(huán)境條件造就了龍山百合品質(zhì)優(yōu)良且產(chǎn)量高。長期以來，龍山百合的研究主要集中在植物資源、藥材質(zhì)量控制和藥效成分等方面[4-8]，鮮有人對百合藥膳食品的開發(fā)進行研究。

發(fā)酵乳是利用牛奶在乳酸菌作用下發(fā)酵制成的產(chǎn)品[9]，可以通過添加果蔬、藥食同源中藥等賦予其特殊的風(fēng)味、口感和營養(yǎng)價值[10-11]。百合發(fā)酵乳是利用鮮百合和牛奶在乳酸菌作用下發(fā)酵制成的產(chǎn)品，因百合具有特殊的清香，百合酸奶風(fēng)味獨特[12]。另外，中藥百合養(yǎng)心安神的功效賦予了百合發(fā)酵乳獨特的保健價值。風(fēng)味是發(fā)酵乳品質(zhì)的重要特征，揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的研究有助于定義保健發(fā)酵乳的品質(zhì)，并可以評估發(fā)酵乳在發(fā)酵過程中的變化，加強發(fā)酵乳質(zhì)量控制。由于發(fā)酵乳基質(zhì)的復(fù)雜性，采用常見的分析方法研究發(fā)酵乳食品中的風(fēng)味物質(zhì)在提取、分離和定量方面具有一定的難度[13-14]。近年來，氣相離子遷移譜(GC-IMS)在分析食品中的風(fēng)味物質(zhì)研究中取得了突破，該技術(shù)具有無損綠色，快速簡便的優(yōu)勢[15-17]。

本工作建立了頂空-GC-IMS(HS-GC-IMS)測定龍山百合原料及其保健發(fā)酵乳中風(fēng)味物質(zhì)的含量，并通過指紋圖譜結(jié)合正交偏最小二乘法判別分析(OPLS-DA)方法分析不同樣本間的特征標(biāo)志物和差異性，以期對龍山特色百合資源產(chǎn)品的深度開發(fā)提供技術(shù)參考。

1 試驗部分

1.1 儀器與試劑

Flavour Spec?型氣相離子遷移譜儀;DL-4005型全自動發(fā)酵機;Philips SCF870120型全自動食品蒸制攪拌儀;Millipore型純水儀;AR124CN 型電子天平。

百合樣品采自湖南省龍山縣，經(jīng)湖南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院周小江教授鑒定為卷丹百合的新鮮肉質(zhì)鱗莖;牛奶為某品牌純牛奶;雙歧桿菌酸奶發(fā)酵劑購自于某公司。

1.2 儀器工作條件

1)頂空條件 頂空進樣體積為500μL;孵育時間為10 min;孵育溫度為45 ℃;進樣針溫度為50 ℃。

2)GC-IMS 條 件 FS-SE-54-CB-1 色 譜 柱(15 m×0.53 mm，1μm);柱溫為40 ℃，IMS溫度為45 ℃;漂移氣(E1)和載氣(E2)均為氮氣，純度為99.999%。色譜洗脫程序:0～15 min時，E1的流量為150 m L·min－1;0～2 min 時，E2的流量為2 m L·min－1;2～10 min時，E2的流量由2 m L·min－1增大至100 m L·min－1;10～15 min 時，E2的流量由100 m L·min－1增大至150 m L·min－1。

1.3 試驗方法

1.3.1 百合原料制備工藝

將采集的百合新鮮鱗莖洗凈，將其剝成單瓣，將百合鱗莖放入全自動食品蒸制攪拌儀中，加入適量的水，設(shè)置為蒸制6 min，打漿30 s，得到細(xì)膩的勻漿狀蒸制百合(樣品代碼ZBH)，去其生腥味。

1.3.2 百合發(fā)酵酸奶制備工藝

取純牛奶100 m L，殺菌(90 ℃，5 min)，冷卻至室溫，加入0.1 g的雙歧桿菌酸奶發(fā)酵劑接種，設(shè)置發(fā)酵時間12 h，即得原味酸奶(樣品代碼SN-1/2)。另取純牛奶100 m L，按上述操作，發(fā)酵完成后，加入1.0 g勻漿狀蒸制百合，均質(zhì)，即得百合酸奶(樣品代碼SN-3/4)。同時另取純牛奶100 m L 五份，如上操作，但設(shè)置發(fā)酵時間分別為8，10，12，14，16 h，即得不同發(fā)酵時間的百合發(fā)酵酸奶(樣品代碼BHSN)，每個樣品平行制備2份，共16批次樣品，具體樣品信息見表1。

表1 樣品信息Tab.1 Information of the samples

1.3.3 樣品的前處理

分別取1.0 g蒸制百合、百合發(fā)酵酸奶、百合酸奶及原味酸奶樣品置于20 m L頂空樣品瓶中，45℃平衡孵育10 min，將注射器加熱至80℃，將100μL樣品頂空自動注入GC-IMS中，15 min后得到樣品的揮發(fā)性組分信息。

1.3.4 數(shù)據(jù)處理

利用工作站Laboratory Analytical Viewer，Reporter，Gallery Plot，Simca PCA 以及GC-IMS Library Search查看分析譜圖，自動檢索各組分NIST數(shù)據(jù)庫和IMS數(shù)據(jù)，對物質(zhì)進行定性分析，并生成指紋圖譜對比，對樣品進行風(fēng)味物質(zhì)的OPLS-DA。

2 結(jié)果與討論

2.1 GC-IMS檢測結(jié)果

蒸制百合、百合發(fā)酵酸奶、百合酸奶、原味酸奶的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的檢測結(jié)果見圖1。通過檢索NIST 數(shù)據(jù)庫和IMS 數(shù)據(jù)，蒸制百合、百合發(fā)酵酸奶、百合酸奶、原味酸奶的風(fēng)味物質(zhì)包括二聚體共鑒定出24種化合物以及其遷移時間，詳見表2。

2.2 蒸制百合、百合酸奶和百合發(fā)酵酸奶風(fēng)味物質(zhì)的指紋圖譜分析

由圖1可以看出，蒸制百合中風(fēng)味物質(zhì)最少，百合發(fā)酵酸奶中風(fēng)味物質(zhì)最多，而百合酸奶與百合發(fā)酵酸奶揮發(fā)性物質(zhì)非常相似。為對比不同樣品間揮發(fā)性有機物的差異(百合發(fā)酵酸奶取發(fā)酵時間為12 h的發(fā)酵樣品)，采用LAV 軟件的Gallery Plot功能，選取離子遷移圖中所有的待分析區(qū)域，生成指紋圖譜。結(jié)果表明:正己醇等物質(zhì)在蒸制百合樣品中的含量較多，在其他樣品中含量非常少，可以將其視為蒸制百合的特征揮發(fā)性有機物;乙酸乙酯二聚體、3-甲基-1-丁醇和2-甲基丁酸甲酯等揮發(fā)性有機物在百合酸奶、百合發(fā)酵酸奶以及蒸制百合中含量較高，且在原味酸奶中含量最低，故可推測百合酸奶及百合發(fā)酵酸奶中該類物質(zhì)主要來源于蒸制百合樣品;丁二酮、正丙醇等揮發(fā)性物質(zhì)在蒸制百合和原味酸奶中含量均較高，但在百合酸奶及百合發(fā)酵酸奶中含量均降低;2-戊酮、2-庚酮、正丁醇及其二聚體、2-戊酮及其二聚體等物質(zhì)在原味酸奶中含量最高，且在蒸制百合中含量很低，可見百合酸奶及百合發(fā)酵酸奶中此部分揮發(fā)性有機物主要來源于原味酸奶;正己醛二聚體、丙酸乙酯及其二聚體、3-甲基-1-丁醇、1-戊醇和2-己酮等物質(zhì)在蒸制百合及原味酸奶中含量很少，而百合酸奶和百合發(fā)酵酸奶中則含量較高，這類物質(zhì)可以作為百合酸奶、百合發(fā)酵酸奶區(qū)別于原味酸奶和蒸制百合的標(biāo)志物。從整體上分析，百合酸奶與百合發(fā)酵酸奶的揮發(fā)性有機物非常相似。將鑒定得到的24種化合物的信號峰的峰強度進行進一步分析可得到這2種樣品中揮發(fā)性物質(zhì)含量差異，結(jié)果見圖2。

圖1 樣品的氣相離子遷移譜圖Fig.1 GC-IMS spectra of the samples

表2 24種風(fēng)味物質(zhì)的鑒定信息Tab.2 Indentification information of 24 flavoring substances

圖2 樣品信號峰強度差異圖Fig.2 Differences of peak intensities of the samples

2.3 不同發(fā)酵時間的百合發(fā)酵酸奶風(fēng)味物質(zhì)分析

為對比不同發(fā)酵時間的百合發(fā)酵酸奶風(fēng)味物質(zhì)的差異，采用LAV 軟件的Gallery Plot功能，選取離子遷移圖中所有的待分析區(qū)域，生成指紋圖譜。將不同發(fā)酵時間樣品鑒定得到的24種化合物的信號峰的峰強度進行差異分析可得圖3。

結(jié)果表明:不同的風(fēng)味物質(zhì)含量具有明顯差異;乙酸乙酯二聚體、2，3-戊二酮二聚體、正丙醇等3種成分的含量在不同發(fā)酵時間的百合發(fā)酵酸奶中都較高，而正丁醇二聚體含量在發(fā)酵8 h時最高，且隨著發(fā)酵時間的延長而減少;正丙醇、3-甲基-1-丁醇、2-甲基丁酸甲酯等揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)在不同發(fā)酵時間的樣本中的含量變化比較穩(wěn)定。

圖3 不同發(fā)酵時間樣本信號峰強度差異圖Fig.3 Differences of peak intensities of samples with different time of fermentation

2.4 樣品的正交偏最小二乘法判別分析

對樣品風(fēng)味物質(zhì)進行OPLS-DA，結(jié)果見圖4。

百合酸奶與百合發(fā)酵酸奶的樣品間呈聚集狀，而蒸制百合、原味酸奶樣品間呈離散狀態(tài)，樣品內(nèi)部點均呈聚集狀。OPLS-DA 圖可以準(zhǔn)確區(qū)分蒸制百合、原味酸奶、百合酸奶、百合發(fā)酵酸奶。4組樣品間，百合酸奶和百合發(fā)酵酸奶相似度最大，而原味酸奶與百合酸奶、百合發(fā)酵酸奶的相似度遠(yuǎn)大于蒸百合，即百合酸奶、百合發(fā)酵酸奶中揮發(fā)性成分主要來源于原味酸奶。由圖5的不同發(fā)酵時間的百合發(fā)酵酸奶的OPLS-DA 圖分析可知，根據(jù)揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的類似性，5個不同發(fā)酵時間的樣本，可分為8 h、10 h和12 h、14 h和16 h等3組。2個主要的風(fēng)味揮發(fā)性有機物成分(乙酸乙酯二聚體、2，3-戊二酮二聚體)在12 h的發(fā)酵時間中含量均較高，2，3-戊二酮具有奶油、焦糖香氣，并帶有堅果底香，而低含量的乙酸乙酯具有清靈、微帶果香的酒香。因此，通過指紋譜圖及OPLS-DA 判斷12 h的發(fā)酵時間相對于其他發(fā)酵時間更優(yōu)。

圖4 百合、百合酸奶、百合發(fā)酵酸奶風(fēng)味物質(zhì)OPLS-DA 分析Fig.4 OPLS-DA analysis of flavoring substances in lily，lily yoghurt and lily fermented yoghurt

圖5 不同發(fā)酵時間的百合發(fā)酵酸奶風(fēng)味物質(zhì)OPLS-DA 分析Fig.5 OPLS-DA analysis of flavoring substances in lily fermented yoghurt with different fermentation time

風(fēng)味是發(fā)酵乳食品生產(chǎn)者和消費者關(guān)注的熱點，風(fēng)味揮發(fā)物質(zhì)是發(fā)酵乳品質(zhì)的重要特征。本工作采用HS-GC-IMS技術(shù)共鑒定出24種揮發(fā)性物質(zhì)。通過HS-GC-IMS指紋圖譜差異性分析，得到了15種特征性標(biāo)志物，如丙酸乙酯二聚體、2-己酮等，通過這些特征標(biāo)志物可以作為判斷百合酸奶和原味酸奶的差異標(biāo)志物，并且發(fā)現(xiàn)正丁醇二聚體可以作為判斷百合發(fā)酵乳不同發(fā)酵時間的指示劑。結(jié)合指紋圖譜和OPLS-DA 分析，HS-GC-IMS技術(shù)可以很好的區(qū)分百合、百合發(fā)酵酸奶與原味酸奶，并可以對發(fā)酵時間與品質(zhì)的關(guān)聯(lián)性提供技術(shù)指導(dǎo)。因此，基于HS-GC-IMS的百合發(fā)酵乳的風(fēng)味研究有助于定義百合保健發(fā)酵乳的品質(zhì)，并可以評估發(fā)酵乳發(fā)酵過程中的風(fēng)味物質(zhì)動態(tài)變化，對加強百合發(fā)酵乳質(zhì)量控制，深度開發(fā)湖南特色百合資源具有重要現(xiàn)實意義。