杭學宇，吳珺瑋，宋 鑫，王 芹，馮曉青，王 露，徐 瑞，王丹丹，陸 娟

(1.淮安市疾病預防控制中心，淮安223001; 2.南通市疾病預防控制中心，南通226007)

農(nóng)藥對于提高農(nóng)產(chǎn)品產(chǎn)量、預防病蟲害具有重要的作用，常用的農(nóng)藥包括有機氯類、有機磷類、擬除蟲菊酯類和氨基甲酸酯類等4大類。其中，氨基甲酸酯類農(nóng)藥具有殺滅鱗翅目和鞘翅目害蟲的作用，同時具有作用快、適用范圍廣、穩(wěn)定性低且易水解等特性[1]，在蔬菜種植中得到了廣泛應用。生產(chǎn)過程中，由于缺乏對蔬菜種植過程中農(nóng)藥使用的監(jiān)管，菜農(nóng)為提高蔬菜產(chǎn)量盲目大量使用氨基甲酸酯類農(nóng)藥，導致農(nóng)藥殘留量超標。氨基甲酸酯類化合物安全性的研究表明，氨基甲酸酯作為膽堿酯酶抑制劑，具有細胞毒性和遺傳毒性[2]，已有氨基甲酸酯化合物引起慢性中毒的報道[3]。建立高效的測定氨基甲酸酯類農(nóng)藥殘留量的分析方法，對確保蔬菜農(nóng)藥殘留量符合國家相關標準的要求，以及提高蔬菜產(chǎn)品質(zhì)量、保障環(huán)境安全和人類生命健康具有十分重要的意義。

測定蔬菜中農(nóng)藥殘留量的傳統(tǒng)前處理方法主要有基質(zhì)固相分散法(MSPD)[4]、液-液萃取法(LLE)[5]、凝膠滲透色譜法(GPC)[6-7]等，這些方法均有制備步驟繁瑣，消耗時間長，易造成目標分析物損失等缺點。QuECh ERS提取具有操作簡單、提取效率高和試驗成本低等優(yōu)點[8]，已廣泛應用于農(nóng)藥殘留、真菌毒素和三環(huán)唑等化合物的測定過程中[9-10]，但仍存在凈化效果差和回收率較低等問題[11]。

本工作采用Qu ECh ERS對蔬菜中的氨基甲酸酯類農(nóng)藥進行提取，結(jié)合單因素試驗和響應面設計對所用固定相的組成進行優(yōu)化。在最優(yōu)條件下結(jié)合超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(UPLC-MS/MS)對市場常見的扁豆、茼蒿和韭菜等蔬菜中6種氨基甲酸酯類農(nóng)藥殘留量進行測定，可為氨基甲酸酯類農(nóng)藥的測定提供參考依據(jù)。

1 試驗部分

1.1 儀器與試劑

Agilent 1290 型超高效液相色譜-串聯(lián)四極桿質(zhì)譜儀;FSH-Ⅱ型高速電動勻漿器;TGL-16 型臺式高速冷凍離心機;Vortex Geniez型渦旋振蕩器;AR 2130型電子天平;TECHNE 型氮吹儀;HZQ/THZ型振蕩器;MUL 9000(B)-H-20型純水機。

6 種氨基甲酸酯化合物的單標準儲備溶液:1 000 mg·L－1，介質(zhì)為甲醇。

N-丙基乙二胺(PSA)、石墨化碳黑(GCB)和十八烷基鍵合硅膠(C18)吸附劑;乙腈為色譜純;甲酸為優(yōu)級純;無水硫酸鈉和氯化鈉均為分析純;試驗用水為高純水。

1.2 儀器工作條件

1)色譜條件 Agilent Poroshell 120 EC-C18色譜柱(75 mm×2.1 mm，2.7μm);進樣量為5μL;柱溫為35 ℃;流量為0.3 m L·min－1;流動相A 為含0.1%(體積分數(shù)，下同)乙酸的20 mmol·L－1乙酸銨溶液，B為乙腈，梯度洗脫程序見表1。

表1 梯度洗脫程序Tab.1 Gradient elution program

2)質(zhì)譜條件 電噴霧離子源，正離子掃描模式;多反應監(jiān)測(MRM)模式;離子噴射電壓為4 000 V;輔助干燥氣壓力為241.33 kPa，霧化氣壓力為275.80 k Pa，氣簾氣壓力為206.85 k Pa;入口電壓為10 V;離子源溫度為600 ℃;駐留時間為100 ms。

其他質(zhì)譜參數(shù)見表2，其中“?”為定量離子。

表2 質(zhì)譜參數(shù)Tab.2 MS parameters

1.3 試驗方法

取淮安各縣、區(qū)的扁豆、茼蒿和韭菜等蔬菜樣品適量，搗碎充分混勻后放入高速電動勻漿器中粉碎，于－20 ℃條件下保存待用。

稱取10.00 g樣品，加入含1.3%(體積分數(shù)，下同)甲酸溶液的乙腈10 m L，渦旋混勻后，超聲提取20 min。加入8.2 g無水硫酸鈉和3.0 g氯化鈉，渦旋后，以5 000 r·min－1的轉(zhuǎn)速離心5 min，取上清液于雞心瓶中，用10 m L 的含1.3%甲酸溶液的乙腈重復提取一次，合并有機相，移取2.0 m L 有機相加入優(yōu)化的QuEChERS 凈化管中(內(nèi)含有PSA 0.4 g、C180.25 g和GCB 8.2 mg)，渦旋振蕩2 min，以5 000 r·min－1的轉(zhuǎn)速離心2 min，取上清液經(jīng)過0.22μm 有機濾膜過濾，得到待測溶液，按照儀器工作條件對其進行測定。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜行為

按照儀器工作條件對10μg·kg－1的6種氨基甲酸酯類化合物的混合標準溶液進行測定，色譜圖見圖1。

2.2 QuECh ERS前處理條件的選擇

Qu ECh ERS前處理過程是液-液萃取和基質(zhì)分散固相萃取的結(jié)合，試驗對液-液萃取過程中的提取溶劑和鹽析劑進行了考察，同時對基質(zhì)分散固相萃取過程中的吸附劑種類和用量進行了考察。

圖1 6種氨基甲酸酯類化合物混合標準溶液的色譜圖Fig.1 Chromatogram of mixed standard solution of the 6 carbamate compounds

試驗選擇乙腈為提取溶劑，但是氨基甲酸酯農(nóng)藥極性較大，且在堿性條件下易分解，試驗采用正離子掃描模式，加入適量的甲酸有利于氨基甲酸酯類化合物的離子化，從而提高靈敏度，但加入過量的甲酸會抑制氨基甲酸酯類化合物的質(zhì)子化，降低靈敏度[12]。試驗考察了在乙腈中分別加入0.1%甲酸溶液、0.5%甲酸溶液、1%甲酸溶液和2%甲酸溶液時對6種氨基甲酸酯類化合物回收率的影響，結(jié)果見圖2。

圖2 不同的提取溶劑對6種氨基甲酸酯類化合物回收率的影響Fig.2 Effect of different extraction solvents on recovery of the 6 carbamate compounds

由圖2 可知:隨著甲酸溶液體積分數(shù)的增大，6種氨基甲酸酯類化合物的回收率逐漸增大;當甲酸溶液的體積分數(shù)為1%時，6種氨基甲酸酯類化合物的回收率達到較大值;繼續(xù)增大甲酸溶液的體積分數(shù)，6種氨基甲酸酯類化合物的回收率趨于穩(wěn)定。試驗選擇的提取溶劑為1%甲酸-乙腈溶液。

Qu ECh ERS方法中常用的鹽析劑為氯化鈉，試驗考察了氯化鈉的用量分別為0.5，2.0，3.5，5.0 g時對6種氨基甲酸酯類化合物回收率的影響，結(jié)果見圖3。

結(jié)果表明:隨著氯化鈉用量的增大，6種氨基甲酸酯類化合物的回收率逐漸增大;當氯化鈉用量為2.0 g時，6種氨基甲酸酯類化合物的回收率較好;繼續(xù)增加氯化鈉用量，6種氨基甲酸酯類化合物的回收率趨于穩(wěn)定。試驗選擇的鹽析劑為2.0 g的氯化鈉。

圖3 氯化鈉用量對6種氨基甲酸酯類化合物回收率的影響Fig.3 Effect of amount of the sodium chloride on recovery of 6 carbamate compounds

應用QuECh ERS對氨基甲酸酯類農(nóng)藥進行前處理過程中，經(jīng)常使用的吸附劑為PSA 和C18。PSA 吸附劑對脂肪酸結(jié)構(gòu)化合物具有較強的吸附作用，C18吸附劑可以去除非極性化合物，但是PSA吸附劑和C18吸附劑去除色素能力的較弱。由于蔬菜中含有大量的色素，試驗選擇加入GCB吸附劑去除蔬菜提取液中的色素，降低基質(zhì)噪聲，提高檢測靈敏度。以扁豆為研究對象，在樣品溶液中加入0.4 g PSA 吸附劑和0.25 g C18吸附劑，添加質(zhì)量分數(shù)為50μg·kg－1的混合標準溶液，以1%甲酸-乙腈溶液為提取溶劑，加入2.0 g氯化鈉，試驗考察了GCB的用量分別為5，10，30，40，50 mg時對6種氨基甲酸酯類化合物回收率的影響，結(jié)果見圖4。

圖4 GCB吸附劑的用量對6種氨基甲酸酯類化合物回收率的影響Fig.4 Effect of amount of GCB adsorbent on recovery of the 6 carbamate compounds

由圖4可知:GCB吸附劑的用量增加至30 mg時，6種氨基甲酸酯的回收率均達到較大值;繼續(xù)增加GCB 吸附劑的用量，克百威、3-羥基克百威的回收率反而下降。這可能是因為GCB 吸附劑對具有平面結(jié)構(gòu)的化合物有親和性，在去除葉綠素、甾醇、兒茶素和維生素等雜質(zhì)的同時，對具有芳香環(huán)平面結(jié)構(gòu)的克百威、3-羥基克百威也有較強的吸附作用。

2.3 Box-Behnken設計試驗

本工作在單因素試驗的基礎上，使用Design-Expert 8.0.6 試 驗 設 計 軟 件，通 過Box-Behnken設計試驗，將甲酸溶液的體積分數(shù)、氯化鈉用量、GCB用量作為變量因素，分別記為A、B 和C，氨基甲酸酯的回收率作為應變量，記為y，Box-Behnken設計的顯著性因素水平見表3。

對試驗結(jié)果進行多重回歸分析，數(shù)據(jù)與二階多項式方程相擬合，擬合方程為y＝－3.33A2－2.63B2－1.98C2－0.20AC＋1.40A ＋0.55B－3.35C＋83.36。

表3 顯著性因素水平Tab.3 Significance factor level

采用方差分析(ANOVA)對該模型進行統(tǒng)計學顯著性分析，該二次多元回歸模型具有顯著性意義(p＜0.01)，失擬項為不顯著，確定系數(shù)為0.986 0，表明試驗結(jié)果與模型預期匹配度為98.6%，校正確定系數(shù)為0.968 0，表明該模型可解釋96.8%的變化效應，本模型可應用于實際分析。

響應面圖可直觀地反應作為各因素交互項作用下的氨基甲酸酯類化合物的提取效果，結(jié)果見圖5。

圖5 氨基甲酸酯類純化試驗響應面圖Fig.5 Response surface diagram of carbamate purification test

由圖5可知:甲酸溶液的體積分數(shù)由0.1%增大至1.0%時，氨基甲酸酯類化合物的回收率呈增大趨勢，這可能是由于氨基甲酸酯類在堿性條件下易分解，降低p H 有利于對其進行提取;隨著甲酸溶液的體積分數(shù)進一步增大，氨基甲酸酯類化合物的回收率沒有顯著性變化。氯化鈉質(zhì)量在2.8 g 左右時，氨基甲酸酯類提取率最高，這可能是因為氯化鈉增強溶液的離子效應，促進分層提高氨基甲酸酯類化合物的提取效率。GCB的添加量對涕滅威亞砜、涕滅威砜、滅多威和涕滅威的提取效果無明顯影響，而GCB用量達到32 mg后，其他幾種氨基甲酸酯類農(nóng)藥的回收率均顯著性降低。根據(jù)構(gòu)建的模型計算得到最佳提取凈化條件為:含1.3%甲酸溶液的乙腈、3.0 g氯化鈉和8.2 mg GCB，預計回收率為85.0%。在最優(yōu)條件下進一步進行試驗驗證，6 種氨基甲酸酯農(nóng)藥的回收率為80%～105%，平均回收率為84.7%。優(yōu)化的Qu ECh ERS法不僅可以去除雜質(zhì)減少基質(zhì)干擾，還能夠滿足農(nóng)殘檢測回收率的要求。

2.4 工作曲線、檢出限和測定下限

分別向8份陰性扁豆樣品提取液中加入6種氨基甲酸酯類化合物混合標準溶液適量，配制0.200～100μg·L－1的工作溶液系列，按照儀器工作條件對其測定，以6種氨基甲酸酯類化合物的質(zhì)量濃度為橫坐標，與其對應的峰面積為縱坐標繪制工作曲線。結(jié)果表明，6種氨基甲酸酯類化合物的質(zhì)量濃度均在0.200～100μg·L－1內(nèi)與其對應的峰面積之間呈線性關系，線性回歸方程和相關系數(shù)見表4。以3倍信噪比和10倍信噪比計算方法的檢出 限(3S/N)和測定下限(10S/N)，結(jié)果見表4。

表4 線性參數(shù)、檢出限和測定下限Tab.4 Linearity parameters，detection limits and lower limits of determination

2.5 精密度和回收試驗

分別向陰性扁豆樣品基質(zhì)溶液中添加1，50，100μg·L－1的6種氨基甲酸酯類混合標準溶液，按照試驗方法進行測定，每個濃度水平的加標樣品平行測定6次，計算回收率和測定值的相對標準偏差(RSD)，結(jié)果見表5。

表5 精密度和回收試驗結(jié)果(n＝6)Tab.5 Results of tests for precision and recovery(n＝6)

結(jié)果表明:6種氨基甲酸酯類化合物的回收率為81.0%～111%，RSD 為2.8%～4.9%，說明該方法具有良好的精密度。

2.6 樣品分析

按照試驗方法對茼蒿、韭菜和扁豆等10份樣品進行測定。結(jié)果表明:在6個樣品中均檢出了氨基甲酸酯類化合物;1號茼蒿樣品中檢出涕滅威砜和克百威的質(zhì)量分數(shù)分別為1.77，1.86μg·kg－1;3號茼蒿樣品中檢出3-羥基克百威的質(zhì)量分數(shù)為2.08μg·kg－1;4號韭菜樣品中檢出涕滅威亞砜的質(zhì)量分數(shù)為1.53μg·kg－1;7號扁豆樣品中檢出克百威的質(zhì)量分數(shù)為1.93μg·kg－1;8號扁豆樣品中檢出涕滅威的質(zhì)量分數(shù)為1.27μg·kg－1;9號扁豆樣品中檢出克百威的質(zhì)量分數(shù)為1.19μg·kg－1。本工作建立了Qu ECh ERS對蔬菜樣品進行前處理，結(jié)合UPLC-MS/MS測定其中6種氨基甲酸酯類農(nóng)藥的分析方法。方法操作過程簡單、快速，靈敏度高，能滿足國內(nèi)外氨基甲酸酯類農(nóng)藥殘留分析測定的要求。