王 帥，史永富

(1.安徽省臨泉縣農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全檢測站，臨泉236400;2.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院 東海水產(chǎn)研究所 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部水產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗測試中心(上海)，上海200090)

三氯生(TCS)是家庭廚衛(wèi)和個人護(hù)理產(chǎn)品(PPCPs)中常用的抗菌劑。2016 年美國和歐盟國家均已禁止TCS作為抗菌劑應(yīng)用于洗護(hù)產(chǎn)品中，含有TCS的藥物和PPCPs通過人們正常的生活使用，該類物質(zhì)隨著生活污水持續(xù)排放到水生環(huán)境中，導(dǎo)致其廣泛分布并穩(wěn)定存在于地表、污水、污泥、水體以及底泥中，被認(rèn)為是新興污染物[1-3]。甲基三氯生(MTCS)是TCS在環(huán)境中通過微生物甲基化轉(zhuǎn)化生成的降解產(chǎn)物[4]，MTCS比TCS具有更強(qiáng)的親脂性、持久性和毒性，可在更廣的范圍內(nèi)進(jìn)行生物積累和分布[5-6]。TCS也可通過氯化反應(yīng)和光化學(xué)反應(yīng)生成氯化酚和二噁英[7]，還可與水體中的游離氯或氯胺反應(yīng)生成三氯甲烷和其他毒性衍生物[8]。TCS作為具有抗菌活性的醚類，在生物體內(nèi)表現(xiàn)出中等程度的內(nèi)分泌干擾、氧化應(yīng)激以及神經(jīng)毒性，能夠破壞包括魚類、兩棲動物和哺乳動物在內(nèi)的多個物種的內(nèi)分泌功能，引起多個物種的生長、發(fā)育、繁殖以及組織器官功能損傷，甚至導(dǎo)致畸形和癌癥等[8-11]。MTCS比TCS的脂溶性更強(qiáng)，生物積累性更加持久，多數(shù)情況下比TCS 在水生生物中更常見，能夠產(chǎn)生更強(qiáng)的毒性作用[12-14]。當(dāng)以含有TCS和MTCS的沉積物作為肥料施于農(nóng)田土壤中[15]，或使用污染農(nóng)田周邊的水體灌溉農(nóng)田和果園，或農(nóng)田靠近污水處理廠，以上情況均增加了TCS 和MTCS引入蔬菜和水果中的風(fēng)險，進(jìn)而通過食物鏈傳遞影響消費(fèi)者的健康。

TCS和MTCS的檢測一般采用氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(GC-MS/MS)和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(LCMS/MS)[16-19]，使用GC-MS/MS 一般需要對TCS進(jìn)行衍生化反應(yīng)，使其轉(zhuǎn)化為弱極性衍生物以便于檢測[15]。目前，國內(nèi)關(guān)于蔬菜和水果中TCS 和MTCS的研究報道較少，本工作建立了GC-MS/MS測定蔬菜和水果中TCS和MTCS的含量，有助于認(rèn)識TCS在環(huán)境中的轉(zhuǎn)化傳遞行為，初步研究了TCS和MTCS在蔬菜和水果中的污染問題，可對農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全進(jìn)行風(fēng)險評估，對農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全監(jiān)測具有十分重要的意義和應(yīng)用前景。

1 試驗部分

1.1 儀器與試劑

Thermo TSQ Quantum 型氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀;XYC-BDM-24 型氮吹儀;LG100B 型理化干燥箱;Hitachi?RX 型高速冷凍離心機(jī);B5510E-MT型超聲波清洗機(jī);JA12002型電子天平;Talboys數(shù)顯型旋渦混合器;BUCHI R-100 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀;DMT-2500型多管旋渦混合儀。

TCS標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液:100 mg·L－1，稱取5.0 mg TCS標(biāo)準(zhǔn)品，用甲醇溶解并轉(zhuǎn)移至50 m L棕色容量瓶中，用甲醇定容，混合均勻，密封，于4 ℃下保存。

MTCS標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液:100 mg·L－1，稱取5.0 mg MTCS標(biāo)準(zhǔn)品，用甲醇溶解并轉(zhuǎn)移至50 m L棕色容量瓶中，用甲醇定容，混合均勻，密封，于4℃下保存。

混合標(biāo)準(zhǔn)溶液系列:移取三氯生標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液和甲基三氯生標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液適量，用甲醇將其稀釋為0.4，1.0，2.0，5.0，10.0，20.0μg·L－1的 混 合 標(biāo) 準(zhǔn)溶液系列，密封，于4 ℃下保存。

TCS(純度為99.5%)和MTCS(純度為98.9%)標(biāo)準(zhǔn)品;衍生試劑為體積比為99∶1的N，O-雙(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺-三甲基氯硅烷混合溶液;乙酸乙酯和甲醇均為色譜純。

1.2 儀器工作條件

1)色譜條件 DB-17MS 毛細(xì)管色譜柱(30 m×0.25 mm，0.25μm);進(jìn)樣口溫度為280℃;進(jìn)樣體積為1μL;不分流進(jìn)樣;載氣為氦氣(純度為99.999%)，流量為1.4 m L·min－1。柱升溫程序:初始溫度為150 ℃，保持1 min;以25 ℃·min－1的速率升溫至250 ℃;再以5 ℃·min－1的速率升溫至260 ℃;最 后 以30 ℃·min－1的 速 率 升 溫 至290 ℃，保持1 min;總運(yùn)行時間9 min。

2)質(zhì)譜條件 電子轟擊離子源(EI);離子源溫度為250 ℃;電離能量為70 e V;多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)模式;傳輸線溫度為250 ℃;溶劑延遲3 min。

1.3 試驗方法

試驗以西紅柿、黃瓜、橙子和蘋果為樣品，將西紅柿、黃瓜和蘋果分別切塊，橙子去皮后切塊，勻漿，于－22 ℃下儲藏備用。分別稱取各樣品5.00 g于30 m L具塞塑料離心管中，加入10 m L 乙酸乙酯，在多管旋渦混合儀中以2 500 r·min－1的轉(zhuǎn)速勻漿2 min，超聲提取10 min，再以10 000 r·min－1的轉(zhuǎn)速離心10 min，將上層有機(jī)相轉(zhuǎn)至雞心瓶中，下層殘渣再用10 m L乙酸乙酯重復(fù)提取一次，合并2次提取液至雞心瓶中。將雞心瓶中的提取液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至近干，用2 m L 乙酸乙酯洗滌雞心瓶，重復(fù)洗滌2次，收集洗滌液于10 m L具塞玻璃離心管中，吹氮至近干。向吹干的具塞玻璃離心管中加入100μL體積比為99∶1的N，O-雙(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺-三甲基氯硅烷混合溶液進(jìn)行硅烷化衍生化反應(yīng)，在60 ℃下衍生40 min，衍生結(jié)束后，吹氮至近干。用1.0 m L乙酸乙酯溶解殘渣[20]，得到待測液，按照儀器工作條件進(jìn)行測定。

2 結(jié)果與討論

2.1 前處理方法的選擇

TCS結(jié)構(gòu)中含有酚羥基，具有一定的極性，使其在進(jìn)樣口靈敏性較低，在色譜柱中反應(yīng)性較高，導(dǎo)致其色譜峰容易產(chǎn)生拖尾現(xiàn)象，影響測定結(jié)果的準(zhǔn)確度[21]。同時，MTCS是TCS在環(huán)境中的甲基化轉(zhuǎn)化產(chǎn)物，必須避免使用甲基化試劑(如重氮甲烷)進(jìn)行衍生化反應(yīng)。試驗采用硅烷化衍生試劑[20]對TCS進(jìn)行改性，硅烷基(Si(CH3)3－)取代TCS中酚羥基中的H，使其轉(zhuǎn)化為弱極性穩(wěn)定存在的TCS硅烷化衍生物，以改善色譜峰形和測定結(jié)果的準(zhǔn)確度。TCS硅烷化衍生化反應(yīng)見圖1。

用氮?dú)鈱⒀苌磻?yīng)的殘留物吹干后，形成的白色結(jié)晶物在正己烷中的溶解度較小，試驗選擇極性更高的非質(zhì)子溶液乙酸乙酯對殘渣進(jìn)行溶解[15]。同時，以乙酸乙酯作為提取溶液，降低前處理過程中試劑轉(zhuǎn)換帶來的干擾效應(yīng)，提高方法的兼容性。一般情況下，樣品在經(jīng)過提取、濃縮過程后，會對樣品進(jìn)行凈化處理，例如采用鹽酸-高氯酸溶液去除蛋白質(zhì)[22-23]，凝膠滲透色譜(GPC)-硫酸溶液去除脂肪[23-24]，固相萃取(SPE)柱凈化去除共同提取的極性干擾物[25-26]等。水產(chǎn)品和畜產(chǎn)品中因含有較多的脂肪和蛋白質(zhì)需經(jīng)過凈化處理后再進(jìn)行分析，但蔬菜和水果基質(zhì)成分相對簡單，經(jīng)證實(shí)方法的準(zhǔn)確度和精密度能夠滿足分析要求，試驗選擇樣品在經(jīng)過提取、濃縮過程后無需再進(jìn)行凈化處理。

圖1 TCS硅烷化衍生化反應(yīng)Fig.1 Silylation derivation reaction of TCS

2.2 三氯生和甲基三氯生的定性鑒別

2.2.1 全掃描模式

試驗對TCS衍生物和MTCS進(jìn)行一級質(zhì)譜全掃描，質(zhì)荷比(m/z)掃描范圍為50～500，在電離能量為70 eV 的轟擊下，掃描得到TCS 衍生物和MTCS的全掃描一級質(zhì)譜圖，以確定其分子離子和碎片離子的質(zhì)荷比m/z。

為了確保對目標(biāo)物鑒定的專屬性，以TCS衍生物和MTCS的分子離子為母離子進(jìn)行二級質(zhì)譜全掃描，進(jìn)一步確定與母離子對應(yīng)的特征子離子。TCS衍生物和MTCS的一級質(zhì)譜全掃描質(zhì)譜圖以及二級質(zhì)譜圖見圖2～4。

圖2 TCS衍生物的全掃描一級質(zhì)譜圖和其衍生物碎片m/z 362的二級質(zhì)譜圖Fig.2 Full scanning MS spectrum of derivate of TCS and MS2 spectrum of its derivate fragment at m/z 362

圖3 TCS衍生物的全掃描一級質(zhì)譜圖和其衍生物碎片m/z 360的二級質(zhì)譜圖Fig.3 Full scanning MS spectrum of derivate of TCS and MS2 spectrum of its derivate fragment at m/z 360

由圖2(a)可知:TCS衍生物經(jīng)過一級質(zhì)譜全掃描后確定分子離子為m/z361.88，但在一級質(zhì)譜重復(fù)性試驗過程發(fā)現(xiàn)其分子離子也出現(xiàn)m/z360.24的情況，如圖3(a)所示，這可能與衍生化反應(yīng)或者同位素的存在有關(guān)，但兩種情況下，離子豐度最高的離子質(zhì)荷比m/z均為347，即TCS衍生物裂解失去甲基所得。MTCS 的全掃描一級質(zhì)譜圖確定分子離子為m/z304，豐度最高的離子為m/z304.23，如圖4(a)所示，即MTCS失去一個氯和一個甲基所得。

圖4 MTCS的全掃描一級質(zhì)譜圖和特征碎片的二級質(zhì)譜圖Fig.4 Full scanning MS spectrum of MTCS and the MS2 spectrum of characteristic fragment

將m/z361.88，304.23 分 別 對 應(yīng) 的TCS 衍 生物和MTCS的母離子進(jìn)行二級質(zhì)譜全掃描后，得到對應(yīng)的豐度最高的子離子分別為m/z347.46，254.32，如圖2(b)和圖4(b)所示。TCS衍生物母離子為m/z360.24 時，得到的豐度最高的子離子為m/z344.99，見圖3(b)。

2.2.2 多反應(yīng)監(jiān)測模式

MRM 模式下，質(zhì)量分析器1掃描得到TCS衍生物和MTCS的母離子，給予碰撞解離電壓10 V，在碰撞室內(nèi)碰撞解離，質(zhì)量分析器2掃描得出與之對應(yīng)的子離子，經(jīng)過這樣兩次選擇，可以得到屬于目標(biāo)物的特征離子對。鑒于TCS衍生物全掃描一級質(zhì)譜產(chǎn)生的母離子有兩種情況，將TCS衍生物的母離子和子離子對調(diào)整為m/z362/347和m/z360/345，分別建立MRM 模式掃描方法進(jìn)行比對，MRM 掃描程序見表1。

表1 MRM 模式掃描程序Tab.1 Scanning program with MRM mode

采用以上2 種MRM 模式掃描程序分別對25μg·L－1的TCS衍生物和MTCS的混合溶液進(jìn)行掃描，得到總離子流色譜圖見圖5。

結(jié)果表明:TCS衍生物和MTCS的總離子流色譜圖完全一致，分辨率也基本相當(dāng)，峰形尖銳對稱且分離度良好，專屬性強(qiáng)，無任何干擾。

圖5 TCS衍生物和MTCS的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的總離子流色譜圖Fig.5 TIC chromatogram of mixed standard solution of derivate of TCS and MTCS

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線、檢出限和測定下限

按照儀器在MRM 模式1和MRM 模式2條件下對0.4，1.0，2.0，5.0，10.0，20.0μg·L－1的 混 合 標(biāo)準(zhǔn)溶液系列進(jìn)行測定，以TCS 衍生物對應(yīng)的TCS和MTCS的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，與其對應(yīng)的峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。TCS和MTCS的質(zhì)量濃度在0.4～20.0μg·L－1內(nèi)與其對應(yīng)的峰面積之間呈線性關(guān)系，線性回歸方程和相關(guān)系數(shù)見表2。

以3倍信噪比和10倍信噪比計算方法的檢出限(3S/N)和測定下限(10S/N)，結(jié)果見表2。

由表2可知:TCS和MTCS在MRM 模式掃描程序1時的線性相關(guān)系數(shù)較MRM 模式掃描程序2大，說明TCS 和MTCS 在MRM 模式掃描程序1時的線性關(guān)系更好，且TCS 在MRM 模式掃描程序1時的檢出限和測定下限也低于MRM 模式掃描程序2，試驗選擇MRM 模式掃描程序1對TCS和MTCS進(jìn)行分析。

表2 線性參數(shù)、檢出限和測定下限Tab.2 Linearity parameters，detection limits and lower limits of determination

2.4 精密度和回收試驗

對空白西紅柿、黃瓜、橙子和蘋果樣品添加0.02，0.10，1.00μg·kg－1的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，每個加標(biāo)樣品平行測定6次，計算TCS和MTCS的回收率和測定值的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)，結(jié)果見表3。

表3 精密度和回收試驗結(jié)果(n＝6)Tab.3 Results of tests for precision and recovery(n＝6)

空白西紅柿樣品和對其添加0.20μg·kg－1混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的西紅柿樣品的色譜圖見圖6。

圖6 空白西紅柿樣品和添加0.20μg·kg－1混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的西紅柿樣品的色譜圖Fig.6 Chromatograms of blank tomato sample and tomato sample added with 0.20μg·kg－1 of mixed standard solution

2.5 樣品分析

按照試驗方法對從市場上隨機(jī)采購的蔬菜(西紅柿、黃瓜、芹菜和土豆)和水果(橘子、蘋果、草莓和獼猴桃)等32個樣品進(jìn)行測定。結(jié)果表明:西紅柿樣品中檢出了TCS和MTCS，其中TCS的質(zhì)量分?jǐn)?shù) 為0.219 ng·g－1，MTCS 的 質(zhì) 量 分 數(shù) 為0.092 ng·g－1;TCS和MTCS的檢出率均為3.1%。該樣品的色譜圖見圖7。

圖7 實(shí)際西紅柿樣品的色譜圖Fig.7 Chromatogram of substantial tomato sample

本工作采用GC-MS/MS 對蔬菜和水果中的TCS和MTCS進(jìn)行定性和定量分析，并應(yīng)用于實(shí)際蔬菜和水果樣品的測定。本方法簡單易操作，檢出限和測定下限低，專屬性強(qiáng)，可靈敏、穩(wěn)定地測定蔬菜和水果樣品中痕量水平的TCS和MTCS，可為甄別農(nóng)業(yè)初級產(chǎn)品中的新興污染物TCS及其甲基代謝產(chǎn)物提供有效的技術(shù)支撐。