朱愛齡，倪貌貌，宋亞萍，譚志文，俞 超，汪財生，張凱龍

(浙江萬里學(xué)院 生物與環(huán)境學(xué)院，寧波315100)

苯妥英鈉，又名大侖丁鈉，化學(xué)名為5，5-二苯基-2，4-咪唑烷二酮鈉鹽，是乙內(nèi)酰脲類抗癲癇藥物，常用于抗心律失常、抗三叉神經(jīng)痛和抗輕度高血壓等[1]，由前體苯妥英(Ⅲ)與對應(yīng)的化學(xué)計量比的氫氧化鈉成鹽制得[2]。前體苯妥英的合成過程是一個多步反應(yīng)，先由苯甲醛縮合合成安息香(Ⅰ)，經(jīng)氧化生成苯偶酰(Ⅱ)，再與尿素縮合得到，具體流程見圖1。

安息香氧化是制備苯偶酰的主要方式，也是苯妥英合成的關(guān)鍵步驟，傳統(tǒng)一次性計量氧化劑消耗量大、污染嚴(yán)重[3-5]，隨著近年來綠色化學(xué)和循環(huán)經(jīng)濟(jì)的興起，各類綠色氧化劑如過氧化氫、臭氧、氧氣、空氣引起了關(guān)注。在催化空氣氧化反應(yīng)領(lǐng)域，安息香氧化已被作為模式反應(yīng)廣泛用于催化劑性能的評價[6-9]。

圖1 安息香氧化制備苯偶酰及苯妥英Fig.1 Preparation of benzil and phenytoin by oxidation of benzoin

在苯妥英制備過程中，需要對苯妥英純度及低濃度苯偶酰、安息香等殘留量進(jìn)行測定。本工作建立了反相高效液相色譜法結(jié)合計時波長切換紫外檢測法同時測定苯妥英及其中間體苯偶酰、安息香的含量，方法簡單快捷、靈敏高效，可為苯妥英制備方法開發(fā)及相關(guān)產(chǎn)品檢測提供技術(shù)支持。

1 試驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

1201型高效液相色譜儀，配UV 1201 型紫外檢測器、P 1201型二元高壓泵;UV 2600型紫外-可見分光光度計;Milli-Q Integral 5 型超純水系統(tǒng);ME104E型分析天平。

安息香、苯偶酰和苯妥英的單標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液:1 000 mg·L－1，分別稱取安息香、苯偶酰和苯妥英100 mg，用乙腈溶解定容至100.0 m L，于4 ℃冷藏備用。使用時用乙腈稀釋至所需質(zhì)量濃度。

安息香(純度不小于99.5%)、苯偶酰(純度不小于98%)和苯妥英(純度不小于99%)等標(biāo)準(zhǔn)品;甲醇和乙腈均為色譜純;試驗(yàn)用水為超純水。

1.2 色譜條件

kromasil 100-5C18色譜柱(200 mm×4.6 mm，5μm);進(jìn)樣量20μL;柱溫30 ℃;流動相為體積比為80∶20 的乙腈-水溶液;等度洗脫，流量為1.0 m L·min－1。計時波長切換程序:0～3.0 min時，檢測波長為218 nm;3.0～4.0 min時，檢測波長為247 nm;4.0～6.0 min時，檢測波長為260 nm;根據(jù)保留時間定性，峰面積外標(biāo)法定量。

1.3 試驗(yàn)方法

以鹽酸酸化的二甲亞砜為溶劑，鐵鹽催化空氣氧化安息香制備苯偶酰，苯偶酰與尿素縮合制備苯妥英。稱取100 mg合成樣品，用乙腈溶解并定容至100.0 m L，稀釋50倍后，經(jīng)過0.45μm 濾膜過濾，得到濾液，按照儀器工作條件進(jìn)行測定，同時進(jìn)行雜質(zhì)含量分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜行為

按照儀器工作條件對安息香、苯偶酰和苯妥英的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行測定，色譜圖見圖2。

2.2 色譜條件的選擇

2.2.1 檢測波長

以乙腈為參比，用紫外-可見分光光度計在200～400 nm 內(nèi)對安息香、苯偶酰和苯妥英進(jìn)行掃描，結(jié)果見圖3。

由圖3可知:苯偶酰、安息香和苯妥英的最大吸收波長分別為260，247，218 nm，安息香和苯偶酰的最大吸收波長比較接近，但與苯妥英的最大吸收波長相差較遠(yuǎn)，三者在205 nm 處均具有較強(qiáng)吸收，同

圖2 混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的色譜圖Fig.2 Chromatogram of mixed standard solution

圖3 苯偶酰、安息香和苯妥英的紫外吸收光譜圖Fig.3 UV absorption spectra of benzil，benzoin and phenytoin

時流動相在該波長下吸收也較強(qiáng)，雜質(zhì)干擾也較多，并且低波段光源穩(wěn)定性低，基線漂移較大。綜合考慮，采用計時波長切換紫外檢測法不僅可以測定產(chǎn)物主成分含量，而且可以兼顧低含量的殘留雜質(zhì)的高靈敏度檢測[10-14]。

2.2.2 流動相的組成及其流量

試驗(yàn)考察了分別以甲醇-水溶液和乙腈-水溶液為流動相進(jìn)行等度洗脫時，對苯妥英、安息香和苯偶酰分離效果的影響。結(jié)果表明:以甲醇-水溶液為流動相時，分析時間較長，且色譜圖存在拖尾現(xiàn)象;以乙腈-水溶液為流動相時，色譜峰的峰形良好，且分析時間顯著縮短。試驗(yàn)選擇的流動相為乙腈-水溶液。

試驗(yàn)進(jìn)一步考察了分別以體積比為60∶40的乙腈-水溶液、體積比為70∶30的乙腈-水溶液和體積比為80∶20的乙腈-水溶液為流動相時，對苯妥英、安息香、苯偶酰分離效果的影響，結(jié)果見圖4。

圖4 不同組成的流動相條件下混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的色譜圖Fig.4 Chromatograms of mixed standard solution with different mixing ratios mobile phases

由圖4可知:當(dāng)流動相中乙腈比例較低時，流動相的洗脫能力較弱，各物質(zhì)的色譜峰保留時間較長，且以體積比為60∶40的乙腈-水溶液為流動相時，色譜峰出現(xiàn)一定程度的拓寬和變形;隨著流動相中乙腈比例的增大，各物質(zhì)的色譜峰保留時間減少，當(dāng)以體積比為80∶20的乙腈-水溶液為流動相時，苯妥英、安息香、苯偶酰的相鄰色譜峰分離度分別為1.88，3.95，均大于1.5，實(shí)現(xiàn)了三組分的完全分離。試驗(yàn)選擇的流動相為體積比為80∶20 的乙腈-水溶液。

試驗(yàn)進(jìn)一步考察了流動相為體積比為80∶20的乙腈-水溶液的流量分別為0.8，1.0，1.2 m L·min－1時，對苯妥英、安息香和苯偶酰分離效果的影響，結(jié)果見圖5。

圖5 體積比為80∶20的乙腈-水溶液在不同流量條件下混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的色譜圖Fig.5 Chromatograms of mixed standard solution with different flow rates of acetonitrile-water solution with the volume ratio of 80∶20

由圖5可知:當(dāng)流動相為體積比為80∶20的乙腈-水溶液的流量為0.8 m L·min－1時，苯妥英、安息香和苯偶?？蓪?shí)現(xiàn)完全分離，但分析時間較長;當(dāng)流動相為體積比80∶20 的乙腈-水溶液的流量為1.2 m L·min－1時，苯妥英和安息香的色譜峰較為接近，不利于較高濃度的苯妥英和安息香的完全分離。綜合考慮，試驗(yàn)選擇流動相為體積比為80∶20的乙腈-水溶液的流量為1.0 m L·min－1。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線、檢出限和測定下限

用乙腈將安息香、苯偶酰和苯妥英的混合標(biāo)準(zhǔn)溶 液 稀 釋 為0.1，0.5，1，5，10，20，40，60，80，100 mg·L－1的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液系列，按照儀器工作條件對其測定。以安息香、苯偶酰和苯妥英的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，與其對應(yīng)的峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。安息香、苯偶酰和苯妥英的質(zhì)量濃度均在0.1～100 mg·L－1內(nèi)與其對應(yīng)的峰面積之間呈線性關(guān)系，線性回歸方程和相關(guān)系數(shù)見表1。

以3倍信噪比和10倍信噪比計算方法的檢出限(3S/N)和測定下限(10S/N)，結(jié)果見表1。

表1 線性參數(shù)、檢出限和測定下限Tab.1 Linearity parameters，detection limits and lower limits of determination

2.4 精密度和回收試驗(yàn)

對實(shí)際樣品進(jìn)行低、中、高等3種水平的加標(biāo)回收試驗(yàn)，每個加標(biāo)樣品平行測定6次，計算回收率和測定值的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)，結(jié)果見表2。

表2 精密度和回收試驗(yàn)結(jié)果(n＝6)Tab.2 Results of tests for precision and recovery(n＝6)

由表2 可知:安息香的回收率為98.0%～99.0%，RSD 為2.0%～4.2%;苯偶酰的回收率為97.2%～105%，RSD 為2.3%～2.7%;苯妥英的回收率為95.4%～99.5%，RSD 為1.8%～2.1%?；厥章矢撸椒?zhǔn)確，可滿足分析要求。

本工作建立了反相高效液相色譜法結(jié)合計時波長切換紫外檢測法測定安息香、苯偶酰和苯妥英含量的分析方法。方法分析快速、靈敏度高、重現(xiàn)性好，適用于催化氧化安息香模式反應(yīng)研究，可適用于苯偶酰及苯妥英生產(chǎn)制備過程中的測定及殘留量分析。