翁丹楓，駱慧穎，蔡偉棟，黎三艷，李國平

冷凍切片是在低溫條件下使組織迅速凍結(jié)到一定硬度后進(jìn)行切片的一種方法，目前廣泛應(yīng)用于術(shù)中病理診斷[1]。高質(zhì)量且快速的冷凍制片病理學(xué)檢查能夠縮短術(shù)中等待時間，幫助臨床醫(yī)師在手術(shù)過程中盡快決定手術(shù)方案。本實驗通過比較3種不同冷凍方法下的冷凍制片速度和質(zhì)量，探究一種新的速凍包埋法的冷凍制片質(zhì)量效果，現(xiàn)介紹如下。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本收集福建醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心存檔的小白鼠肺、肝、腎、腦組織各25例，合計100例，以及福建醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院存檔的子宮肌瘤及甲狀腺標(biāo)本各20例，合計40例。

1.2 儀器與試劑Chaser冷凍包埋儀(江蘇無錫啟盛實驗設(shè)備公司)，冷凍錘，Thermo Fisher Linistat直線型自動染色機(jī)，Thermo切片機(jī)，OCT包埋劑，AAF混合固定液，HE染液，乙醇，二甲苯等。

1.3 方法小鼠采用頸椎脫臼法處死后，取小鼠肺、肝、腎、腦組織。小鼠及人標(biāo)本組織平均分為3份，分別采用不同方法包埋：(1)速凍臺冷凍法：組織放入預(yù)冷的組織托上加適量的OCT膠后放入冷凍箱速凍臺上進(jìn)行速凍；(2)冷凍錘速凍法：將組織放在預(yù)冷的組織托上后放至速凍點，加入適量OCT膠，待底部變白且表面未凝固時立即加蓋冷凍錘速凍，注意保持冷凍錘水平；(3)包埋儀速凍法：冷凍包埋儀凹槽里先加少許OCT膠后將組織放入槽內(nèi)，然后繼續(xù)把膠填滿包埋槽，最后將組織托朝下進(jìn)行包埋，速凍時間設(shè)置為30 s，之后取出放入冷凍機(jī)進(jìn)行切片。

1.4 HE染色與結(jié)果判定組織經(jīng)三種不同冷凍方式包埋切片后，經(jīng)AAF固定液固定1 min，然后放入自動染色機(jī)進(jìn)行HE染色、封固。冷凍切片質(zhì)量評分等級標(biāo)準(zhǔn)：甲級片(優(yōu))90分以上、乙級片(良)80～89分、丙級片(合格)60～79分，丁級片(不合格)低于60分。甲級、乙級片定義為質(zhì)量佳者，丙級、丁級片定義為質(zhì)量不佳者。

2 結(jié)果

2.1 不同冷凍方式制片時間的比較單因素方差分析結(jié)果表明，在小鼠肺、肝、腎、腦組織及人子宮肌瘤、甲狀腺組織中，包埋儀速凍法組織制片時間明顯短于冷凍錘速凍法(P<0.001)和速凍臺冷凍法，差異有顯著性(P<0.001)；冷凍錘速凍法與速凍臺冷凍法之間的制片時間差異無顯著性(P=0.861，表1)。

表1 不同冷凍方法組織制片時間

#A組與B組比較；*B組與C組比較；△A組與C組比較

2.2 不同冷凍方式制片HE染色質(zhì)量的比較在小鼠及人標(biāo)本中，包埋儀速凍法制片質(zhì)量明顯優(yōu)于冷凍錘速凍法(P<0.001)和速凍臺冷凍法(P<0.001)(表2)。鏡下觀察三種方式包埋制片的HE冰晶情況(圖1、2)，可見速凍臺冷凍法包埋的組織內(nèi)形成大量冰晶，細(xì)胞間出現(xiàn)不規(guī)則空隙，細(xì)胞被擠壓收縮，結(jié)構(gòu)變形；冷凍錘速凍法及包埋儀速凍法包埋的組織中冰晶較少，且結(jié)構(gòu)完整、染色均勻。包埋儀速凍法小鼠及人的各組織冰晶形成量與冷凍錘速凍法相比差異無顯著性(P>0.05，表3、4)，與冷凍臺速凍法相比差異有顯著性(P<0.001)。此外，切片質(zhì)量方面，包埋儀速凍法在小鼠腦(P=0.044)、肝(P=0.037)、腎(P=0.031)及人子宮肌瘤(P=0.005)、甲狀腺(P=0.017)組織制片質(zhì)量優(yōu)于冷凍錘速凍法，差異有顯著性。在固定與染色、外觀方面，3種冷凍方法各組織HE染色質(zhì)量差異無顯著性(P>0.05)。

表2 不同冷凍方法組織制片質(zhì)量

質(zhì)量佳：≥80分；質(zhì)量不佳：<80分

3 討論

冷凍制片技術(shù)因其制片時間短、組織結(jié)構(gòu)保存完好而成為術(shù)中病理診斷的首選檢查方法，但冷凍制片易出現(xiàn)冰晶，導(dǎo)致組織裂隙、細(xì)胞形態(tài)變化，嚴(yán)重影響冷凍制片快速診斷準(zhǔn)確性[2]。因此減少冰晶形成是術(shù)中冷凍制片的重要質(zhì)量保證。本實驗通過比較發(fā)現(xiàn)，與速動臺冷凍法相比，冷凍包埋儀及冷凍錘速凍法可有效減少冰晶的產(chǎn)生，并且包埋儀速凍法明顯縮短制片時間且制片質(zhì)量明顯好于冷凍錘速凍法及速凍臺冷凍法，大大提高了制片質(zhì)量及工作效率。

冰晶是緩慢冷凍過程中細(xì)胞內(nèi)的水分子向細(xì)胞間疏松區(qū)域游離、聚集，然后凝結(jié)成冰。組織細(xì)胞內(nèi)冰晶形成的區(qū)域無細(xì)胞結(jié)構(gòu)，呈結(jié)晶樣或不規(guī)則空隙，周圍組織或細(xì)胞間隙擴(kuò)大，組織結(jié)構(gòu)呈不同程度破壞[3]。在冷凍切片冷凍的過程中形成冰晶主要有兩個原因：(1)冷凍速率慢導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)的水分子向細(xì)胞間疏松區(qū)域游離、聚集，然后凝結(jié)成冰；(2)樣本周圍水溶液的組成成分。使用高度專業(yè)化快速冷凍系統(tǒng)或者高滲溶液能夠減少冰晶大小和密度[4]。蔗糖是一種化學(xué)惰性和親水性溶質(zhì)，可以干擾冰結(jié)晶過程中的氫鍵形成，控制冷凍樣品的脆性[5]。將組織樣本經(jīng)20%～30%的梯度蔗糖溶液脫水至組織沉底可減少冰晶形成。但是，其應(yīng)用于腦組織脫水時仍可形成較多、較大的冰晶，制片效果并不十分理想[6]。不同的組織可能需要不同的蔗糖濃度來獲得相似的冷凍切片質(zhì)量。另一方面，20%～30%蔗糖脫水法消耗時間通常需要12～24 h，而蔗糖濃度越高，溶液黏度越高，這可能會減慢樣品的滲透率，無法滿足術(shù)中快速病理診斷的需要。速凍可以阻止水分子游離，保持基質(zhì)的勻質(zhì)。組織冷凍速度決定了組織內(nèi)冰晶形成的方式與數(shù)量[3]。

①A①B①C②A②B②C

圖1小鼠腎標(biāo)本不同冷凍方式制片HE質(zhì)量比較：A.速凍臺冷凍法；B.冷凍錘速凍法；C.包埋儀速凍法圖2人子宮肌瘤不同冷凍方式制片HE質(zhì)量比較：A.速凍臺冷凍法；B.冷凍錘速凍法；C.包埋儀速凍法

表3 不同冷凍方法下小鼠組織的制片評分(min±s)

P1：A組與C組比較；P2：B組與C組比較

表4 不同冷凍方法下人組織的制片評分(min±s)

P1：A組與C組比較；P2：B組與C組比較

本科室使用的冷凍切片機(jī)箱內(nèi)的溫度一般控制在-20 ℃～-25 ℃，組織在速凍臺冷凍的時間在5～8 min，冷凍速度緩慢，形成的冰晶較多；加上冷凍錘可使組織冷凍時間縮短至3～5 min，而Chaser冷凍包埋儀能在短時間內(nèi)將箱室內(nèi)的溫度降至-80 ℃，工作溫度一般設(shè)定為-40 ℃，可使組織在30 s內(nèi)完成冷凍過程，快速越過冰晶形成期，極大地減少了冰晶的形成，其總制片時間比速凍臺冷凍法及冷凍錘速凍法縮短了近5 min。相對于使用超低溫的液氮冷凍法，冷凍包埋儀使用更安全，對操作人員沒有傷害。雖然冷凍錘速凍法與包埋儀速凍法在冰晶形成方面差異無顯著性，但是本實驗結(jié)果表明，包埋儀速凍法甲級片或者乙級片的數(shù)量明顯多于冷凍錘速凍法，主要表現(xiàn)在腦、肝、腎、子宮肌瘤及甲狀腺組織的切片質(zhì)量優(yōu)于冷凍錘速凍法，主要原因是冷凍錘的冷凍時間主要靠肉眼判別，存在一定主觀性差異，有可能在組織速凍的過程中過度冷凍，導(dǎo)致組織發(fā)脆，產(chǎn)生裂隙、皺褶及刀痕現(xiàn)象，影響了切片質(zhì)量。而冷凍包埋儀具備定時功能，能夠統(tǒng)一控制速凍時間及膠量，當(dāng)冷凍時間結(jié)束后會發(fā)出提示音提醒開始制片，避免導(dǎo)致冷凍過度產(chǎn)生脆裂現(xiàn)象。而肺組織結(jié)構(gòu)疏松，切片難度較大，兩種速凍方法下的切片質(zhì)量均較差，因此無明顯差異。

綜上所述，術(shù)中冷凍制片過程中，冷凍緩慢造成冰晶形成及組織裂隙產(chǎn)生對冷凍切片的質(zhì)量及術(shù)中快速診斷的準(zhǔn)確性有重要影響，而冷凍切片包埋儀能夠達(dá)到速凍要求，可以有效減少冰晶的含量，提高冷凍制片的質(zhì)量及工作效率，能夠滿足術(shù)中快速診斷的需要，值得在冷凍制片過程中推廣使用。