張雨婷，汪亦君，夏 沛，張文輝，宋恩霖

富含半胱氨酸運(yùn)動神經(jīng)元蛋白1(cysteine-rich motor neuron 1, CRIM1)屬于腱蛋白樣富含半胱氨酸重復(fù)序列蛋白家族成員之一，其生理功能主要通過影響VEGFA的活性[1]調(diào)節(jié)器官發(fā)育過程中血管生成。目前已發(fā)現(xiàn)CRIM1與多種腫瘤發(fā)生、發(fā)展有關(guān)，如在肺癌[2]和膠質(zhì)母細(xì)胞瘤[3]中均存在CRIM1的高表達(dá)，在前列腺癌PC細(xì)胞中CRIM1的高表達(dá)促進(jìn)其浸潤侵襲能力[4]，但CRIM1與腫瘤微血管生成的關(guān)系目前尚未見報(bào)道。本文通過檢測子宮頸鱗狀細(xì)胞癌組織中CRIM1蛋白表達(dá)，分析其與腫瘤微血管密度(microvascular density, MVD)的關(guān)系，并進(jìn)一步觀察CRIM1對子宮頸鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞VEGF表達(dá)的影響，探討CRIM1與子宮頸癌微血管生成的關(guān)系及其分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 臨床資料收集中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院確診的浸潤性子宮頸鱗狀細(xì)胞癌石蠟包埋標(biāo)本50例，患者平均年齡42歲；其中14例腫瘤直徑大于4 cm，29例伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，18例伴子宮旁浸潤，高分化16例，中分化22例，低分化12例。所有患者術(shù)前均未行放、化療。另取10例慢性子宮頸炎上皮標(biāo)本作為對照組。

1.2 方法

1.2.1免疫組化 采用免疫組化MaxVision法染色，3～5 μm厚切片，65 ℃烘箱烤片2 h，常規(guī)二甲苯脫蠟，梯度乙醇水化，自來水沖洗，檸檬酸鈉抗原熱修復(fù)，3%H2O2處理，PBS漂洗。一抗CRIM1工作液50 μL，4 ℃過夜，PBS洗滌后，50 μL MaxVision二抗工作液(KIT-5010，福州邁新公司)室溫下孵育30 min，洗滌后DAB顯色，蘇木精復(fù)染，中性樹膠封固。以PBS代替一抗作陰性對照。測量累積光密度(integral optic density, IOD)進(jìn)行蛋白表達(dá)半定量結(jié)果判定。在光鏡下(×400)選取腫瘤組織中陽性最強(qiáng)的3個高倍視野，數(shù)碼拍照，應(yīng)用圖像分析軟件Image Pro Plus 6.0準(zhǔn)確分割陽性區(qū)域，測量IOD值。相同條件下，每張圖片測量3次，每張切片選取3張視野測量，以9次測量的IOD均值作為該視野中蛋白的表達(dá)強(qiáng)度。

1.2.2MVD檢測 采用Weinner計(jì)數(shù)法檢測子宮頸鱗狀細(xì)胞癌組織中MVD。CD34免疫組化染色后(鼠抗人CD34單克隆抗體：Kit-004，福州邁新公司)以黃色顆粒狀標(biāo)記的血管內(nèi)皮為標(biāo)準(zhǔn)。MVD計(jì)數(shù)采用Weinner等[5]計(jì)數(shù)法：切片在光鏡下(×100)挑選MVD分布最高區(qū)域，在光鏡下(×200)計(jì)數(shù)5個不同視野中被CD34染成陽性的微血管數(shù)量，取其平均值作為MVD值。每個與鄰近微血管分離明顯的陽性染色單個血管內(nèi)皮細(xì)胞或血管內(nèi)皮細(xì)胞簇均視為1個獨(dú)立的微血管，結(jié)構(gòu)不相連的分支血管結(jié)構(gòu)也計(jì)為1個微血管。直徑≥8個紅細(xì)胞的血管，帶有厚的平滑肌血管或者硬化壞死區(qū)血管不在計(jì)數(shù)范圍內(nèi)。

1.2.3子宮頸鱗狀細(xì)胞癌SiHa細(xì)胞CRIM1基因瞬時轉(zhuǎn)染 子宮頸鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞SiHa(TCHu113，中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫)，應(yīng)用含10%胎牛血清及雙抗的DMEM培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)于37 ℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中。按每毫升3×105個細(xì)胞接種2 mL細(xì)胞懸液于6孔板，24 h后更換為無血清、無雙抗的基礎(chǔ)培養(yǎng)基。實(shí)驗(yàn)分為3組：Control、Vector(空載質(zhì)粒)、pCMV3-CRIM1組，分別用無血清、無雙抗的DMEM 500 μL稀釋6 μg的pCMV3-CRIM1過表達(dá)質(zhì)粒(HG11666-UT，北京義翹神州生物公司)、6 μg的pCMV/hygro-Negative空載質(zhì)粒(CV001，北京義翹神州生物公司)和兩支10 μL脂質(zhì)體Sinofection(STFO2，北京義翹神州生物公司)，室溫孵育5 min，各自將質(zhì)粒和轉(zhuǎn)染試劑混合形成轉(zhuǎn)染復(fù)合物，室溫孵育20～25 min，加入對應(yīng)孔板中。Control組加入正常培養(yǎng)細(xì)胞的完全培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)6 h，更換培養(yǎng)基為新鮮含10%血清不含雙抗的培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)至48 h，通過Western blot檢測轉(zhuǎn)染效果及相關(guān)蛋白變化。

1.2.4Western blot法 RIPA裂解液加入蛋白酶和磷酸酶抑制劑配成細(xì)胞裂解液提取細(xì)胞總蛋白，用以檢測CRIM1(兔抗人多克隆抗體：H00051232-M01，臺灣Abnova公司)、p-ERK(兔抗人多克隆抗體：AF1015，美國Affinity公司)、total-ERK(兔抗人多克隆抗體：16443-1-AP，美國Proteintech公司)和VEGF(兔抗人多克隆抗體：19003-1-AP，美國Proteintech公司)蛋白表達(dá)；蛋白濃度測定后，按每孔20 μL上樣量用Loading Buffer和RIPA液配平，沸水加熱后冷卻離心上樣，行十二烷基磺酸鈉聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)凝膠電泳，轉(zhuǎn)至PVDF膜上。5%脫脂奶粉封閉，加入一抗(工作濃度1 ∶500，內(nèi)參β-actin為1 ∶4 000)4 ℃過夜；TBST洗滌后加入二抗(工作濃度1 ∶5 000)常溫?fù)u床孵育；洗滌膜后，利用ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒孵育發(fā)光，顯影。利用Image Pro Plus 6.0軟件測量目的蛋白條帶和內(nèi)參條帶的灰度值，以目的條帶灰度值與內(nèi)參灰度值的比值作為蛋白的相對表達(dá)水平。

1.2.5細(xì)胞上清液中VEGF含量ELISA檢測 收集各組癌細(xì)胞的上清液，離心后去沉淀取上清備用。按照ELISA試劑盒(EHC108.96.2，深圳欣博盛公司)說明書進(jìn)行操作，檢測標(biāo)準(zhǔn)品及各組待測樣品的OD值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算各組待測樣品中VEGF的含量。

1.2.6CCK-8實(shí)驗(yàn) 留取上述兩組的癌細(xì)胞上清液，取對數(shù)生長期的HUVEC(HF1121，上海富衡生物公司)制成細(xì)胞懸液，按每孔100 μL含2 000個細(xì)胞的濃度接種于96孔板，分為Control、Vector、pCMV3-CRIM1和DMEM組，每組5個復(fù)孔。細(xì)胞貼壁后將留取的癌細(xì)胞上清液分別作用于2組的HUVEC，Control組HUVEC加入完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h后棄去上清，加入10%的CCK-8工作液(CK04，北京沃比森科技公司)，在培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)3 h，于酶標(biāo)儀450 nm處測OD值，計(jì)算各組細(xì)胞增殖活力值。

1.2.7Matrigel膠管腔形成實(shí)驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)根據(jù)In Vitro Angiogenesis Assay內(nèi)管腔形成試劑盒(ECM625，美國Merck Millipore公司)說明書進(jìn)行，槍頭、EP管、96孔板置于-20 ℃預(yù)冷過夜，Matrigel膠置于4 ℃預(yù)冷過夜；次日，吸取Matrigel膠每孔50 μL加入96孔板，放入4 ℃冰箱10 min(可使Matrigel膠鋪板更加均勻沒有氣泡)，放入37 ℃培養(yǎng)箱，放置1 h待Matrigel膠聚合成凝膠。PBS清洗3次，胰蛋白酶消化HUVEC，1 000 r/min離心5 min。HUVEC細(xì)胞用DMEM培養(yǎng)基制備成細(xì)胞懸液(每孔約1×105個細(xì)胞)，取上述轉(zhuǎn)染后的癌細(xì)胞上清100 μL和HUVEC細(xì)胞懸液100 μL以1 ∶1混合，合計(jì)200 μL加入96孔板中，記作0 h，放入5%CO2、37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)10 h后取出，倒置顯微鏡下觀察并計(jì)數(shù)拍照小管形成情況。

1.2.8人重組蛋白作用SiHa 將SiHa細(xì)胞消化離心制成細(xì)胞懸液，調(diào)整濃度接種于6孔板中，實(shí)驗(yàn)分為5組：0、12.5、25、50、100 ng/mL，24 h后將人重組CRIM1蛋白(H00051232-Q01，臺灣Abnova公司)稀釋加入腫瘤細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)24 h，提取細(xì)胞蛋白及細(xì)胞上清，分別用Western blot法和ELISA法檢測細(xì)胞蛋白中VEGF表達(dá)和上清中VEGF的含量變化。

2 結(jié)果

2.1 子宮頸鱗狀細(xì)胞癌中CRIM1的表達(dá)CRIM1在正常子宮頸上皮中呈弱陽性甚至陰性；而在子宮頸鱗狀細(xì)胞癌組織中均呈彌漫陽性，且主要表達(dá)于子宮頸鱗狀細(xì)胞癌的細(xì)胞質(zhì)和(或)細(xì)胞核(圖1)。光密度檢測分析：CRIM1在子宮頸鱗狀細(xì)胞癌中的表達(dá)顯著高于其在正常子宮頸上皮中的表達(dá)(P<0.001，表1)。

表1 子宮頸鱗狀細(xì)胞癌和正常子宮頸組織中CIRM1的表達(dá)

2.2 子宮頸鱗狀細(xì)胞癌中CRIM1的表達(dá)與MVD的關(guān)系子宮頸鱗狀細(xì)胞癌中CD34標(biāo)記的微血管分布于癌巢之間和癌巢內(nèi)瘤細(xì)胞之間(圖2)，平均MVD值為31。相關(guān)性分析顯示：在子宮頸鱗狀細(xì)胞癌中，CRIM1的表達(dá)與MVD呈正相關(guān)(r=0.546，P<0.01)。

①②

圖1子宮頸鱗狀細(xì)胞癌組織中CRIM1的表達(dá)，胞質(zhì)和(或)胞核陽性，MaxVision法圖2子宮頸鱗狀細(xì)胞癌組織中CD34內(nèi)皮標(biāo)記的微血管，MaxVision法

2.3 CRIM1與SiHa細(xì)胞血管誘生能力的關(guān)系

2.3.1過表達(dá)CRIM1的SiHa細(xì)胞上清液促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖 CCK-8細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，pCMV3-CRIM1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組癌細(xì)胞上清液刺激下的內(nèi)皮增殖活力(1.02±0.024)顯著高于Control組(0.93±0.030，P<0.01)和Vector組(0.93±0.028，P<0.01)。

2.3.2SiHa細(xì)胞中CRIM1過表達(dá)增強(qiáng)內(nèi)皮細(xì)胞管腔形成能力 管腔形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，pCMV3-CRIM1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組癌細(xì)胞上清液作用下內(nèi)皮細(xì)胞的管腔形成能力(1.20±0.137)顯著高于Control組(1.0±0.088)和Vector轉(zhuǎn)染組(0.89±0.120)(P均<0.05)。

2.4 CRIM1活化ERK信號上調(diào)VEGF表達(dá)促進(jìn)SiHa細(xì)胞血管誘生能力

2.4.1CRIM1的高表達(dá)上調(diào)SiHa細(xì)胞中VEGF蛋白表達(dá) CRIM1基因轉(zhuǎn)染組SiHa細(xì)胞中CRIM1和VEGF的表達(dá)水平分別為0.819±0.086和0.404±0.039，顯著高于Control組(0.092±0.021，P<0.001；0.059±0.008，P<0.001)和Vector轉(zhuǎn)染組(0.122±0.019，P<0.001；0.056±0.008，P<0.001)；Vector轉(zhuǎn)染組和Control組蛋白表達(dá)差異無顯著性(圖3)，且ELISA檢測結(jié)果顯示，陽性轉(zhuǎn)染組細(xì)胞上清液中VEGF含量為(763.751±25.816) pg，顯著高于Control組[(653.501±25.487) pg，P<0.01]和Vector轉(zhuǎn)染組[(649.006±36.539) pg，P<0.01)]，提示CRIM1基因轉(zhuǎn)染成功，且CRIM1高表達(dá)可上調(diào)SiHa細(xì)胞VEGF的表達(dá)水平。

圖3 CRIM1基因轉(zhuǎn)染上調(diào)SiHa細(xì)胞中VEGF的表達(dá)：Control.空白對照組；Vector.陰性轉(zhuǎn)染組；pCMV3-CRIM1.陽性轉(zhuǎn)染組

2.4.2CRIM1上調(diào)VEGF表達(dá)依賴于ERK信號的活化 pCMV3-CRIM1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組SiHa細(xì)胞中p-ERK和VEGF的表達(dá)水平(0.417±0.016，0.244±0.014)顯著高于Control組(0.134±0.007，P<0.001；0.066±0.004，P=0.01)。ERK抑制劑U0126與pCMV3-CRIM1轉(zhuǎn)染質(zhì)粒聯(lián)合處理的SiHa細(xì)胞中p-ERK的表達(dá)水平(0.218±0.008)顯著低于pCMV3-CRIM1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組(P<0.001)，且該組細(xì)胞中VEGF的表達(dá)水平(0.061±0.009)也顯著低于pCMV3-CRIM1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組(0.244±0.014，P<0.001)，SiHa細(xì)胞中CRIM1的表達(dá)在兩組間差異無顯著性(圖4)。

圖4 ERK信號的活化對CRIM1上調(diào)SiHa細(xì)胞VEGF表達(dá)的影響：Control.空白對照組；pCMV3-CRIM1.質(zhì)粒陽性轉(zhuǎn)染組；CRIM1+U0126.ERK抑制與pCMV3-CRIM1表達(dá)質(zhì)粒聯(lián)合處理組

2.5 外源性CRIM1對SiHa細(xì)胞中VEGF蛋白表達(dá)的影響不同濃度的外源性CRIM1對SiHa細(xì)胞中VEGF蛋白表達(dá)水平無明顯影響(P>0.05)，且ELISA檢測結(jié)果亦顯示，不同濃度外源性CRIM1蛋白刺激下的各組SiHa細(xì)胞上清中VEGF的表達(dá)水平差異無顯著性(P>0.05)。

3 討論

實(shí)體腫瘤新形成的微血管在結(jié)構(gòu)上缺乏完整性[5]，易于腫瘤細(xì)胞浸潤轉(zhuǎn)移。有文獻(xiàn)報(bào)道許多促血管生成因子提高子宮頸癌的浸潤轉(zhuǎn)移能力，與子宮頸癌預(yù)后不良顯著相關(guān)[6-8]。故研究新的微血管生成調(diào)節(jié)因子對子宮頸癌血管生成的機(jī)制和生物治療具有重大意義。

CRIM1屬于腱蛋白樣富含半胱氨酸重復(fù)序列蛋白家族成員之一。Pennisi等[9]通過構(gòu)建CRIM1等位基因敲除的小鼠模型，發(fā)現(xiàn)CRIM1非正常表達(dá)使小鼠出現(xiàn)諸如死亡、并指、大腦血腫、眼睛缺陷和皮膚血泡等表現(xiàn)，提示CRIM1屬于重要的器官發(fā)育調(diào)節(jié)因子。在腎小球血管發(fā)生過程中CRIM1調(diào)節(jié)VEGFA的活性及其細(xì)胞表面的遞呈[1]，且通過促進(jìn)內(nèi)皮VEGFR2的磷酸化調(diào)節(jié)VEGFA自分泌以維持血管穩(wěn)定性[10]。CRIM1可高表達(dá)于有復(fù)發(fā)潛能的胃腸間質(zhì)瘤[11]、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤[3]，影響肺癌A549細(xì)胞黏附和遷移行為[2]，且與髓性白血病及卵巢癌耐藥有關(guān)[12-13]，提示CRIM1是潛在血管生成調(diào)節(jié)因子，且與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)，但關(guān)于它與腫瘤血管生成的研究卻鮮有報(bào)道。CD34內(nèi)皮標(biāo)記對腫瘤組織中新生的微血管和不完整的血管較為敏感[14]。本實(shí)驗(yàn)通過內(nèi)皮CD34標(biāo)記檢測子宮頸鱗狀細(xì)胞癌 MVD，免疫組化檢測子宮頸鱗狀細(xì)胞癌組織中CRIM1的表達(dá)，分析CRIM1與子宮頸鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞血管誘生能力的關(guān)系。

CRIM1在子宮頸鱗狀細(xì)胞癌組織中的表達(dá)顯著高于正常子宮頸上皮組織，且與MVD呈正相關(guān)，提示CRIM1可能參與子宮頸鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)生、發(fā)展，且與子宮頸鱗狀細(xì)胞癌微血管生成有關(guān)。對子宮頸鱗狀細(xì)胞癌SiHa細(xì)胞進(jìn)行CRIM1基因瞬時轉(zhuǎn)染后癌細(xì)胞上清液刺激下的內(nèi)皮細(xì)胞的增殖能力和管腔形成能力顯著升高，表明CRIM1能增強(qiáng)子宮頸鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞的血管誘生能力。腫瘤微血管生成是一個復(fù)雜的多因素參與的過程，包括腫瘤組織中的瘤細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和其他一些基質(zhì)細(xì)胞之間的相互作用。目前較為熟知的調(diào)節(jié)途徑是瘤細(xì)胞通過表達(dá)分泌某些血管生成因子誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞的血管生成，稱之為旁分泌調(diào)節(jié)途徑[15]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示CRIM1可能通過某種信號途徑上調(diào)血管生成因子的表達(dá)，從而旁分泌性促進(jìn)內(nèi)皮的血管生成。本課題組發(fā)現(xiàn)CRIM1轉(zhuǎn)染后癌細(xì)胞中VEGF的表達(dá)明顯上調(diào)，且此時癌細(xì)胞上清液中VEGF含量的升高；該結(jié)果與有關(guān)CRIM1調(diào)節(jié)器官生長發(fā)育過程中的血管新生的實(shí)驗(yàn)結(jié)果基本一致，說明CRIM1調(diào)節(jié)腫瘤的血管生成機(jī)制是通過介導(dǎo)VEGF表達(dá)變化而實(shí)現(xiàn)的。據(jù)報(bào)道，CRIM1對VEGF的調(diào)節(jié)作用與其分子結(jié)構(gòu)上RGD模序結(jié)合integrin β1從而活化ERK信號有關(guān)[16]。本課題利用ERK特異性抑制劑U0126預(yù)處理癌細(xì)胞后再進(jìn)行CRIM1基因轉(zhuǎn)染，發(fā)現(xiàn)正常轉(zhuǎn)染的癌細(xì)胞中VEGF表達(dá)升高的同時，p-ERK表達(dá)水平也顯著高于正常轉(zhuǎn)染組，當(dāng)U0126抑制ERK信號的活化時，癌細(xì)胞中VEGF的水平顯著低于正常轉(zhuǎn)染組，但兩組間CRIM1的表達(dá)差異無顯著性，表明CRIM1通過活化下游ERK信號上調(diào)子宮頸鱗狀細(xì)胞癌VEGF的表達(dá)。ERK信號的活化與多種腫瘤微血管生成有關(guān)[17-18]，其受多種上游調(diào)節(jié)因子的激活。CRIM1激活子宮頸鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞ERK信號是否也與CRIM1和integrin β1的相互作用尚需進(jìn)一步分析。利用人工重組CRIM1蛋白直接刺激子宮頸癌細(xì)胞，其癌細(xì)胞及上清液中VEGF的表達(dá)水平均無顯著變化，說明CRIM1自身并不能作為一種分泌性蛋白發(fā)揮作用。此外，本課題組織學(xué)研究發(fā)現(xiàn)CRIM1表達(dá)于子宮頸鱗狀細(xì)胞癌的細(xì)胞質(zhì)和(或)細(xì)胞核，CRIM1促進(jìn)子宮頸鱗狀細(xì)胞癌微血管生成的功能是否與它在癌細(xì)胞中的表達(dá)定位有關(guān)，值得我們深入探討。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)首次證實(shí)CRIM1在子宮頸鱗狀細(xì)胞癌中高表達(dá)，CRIM1能通過活化ERK信號上調(diào)癌細(xì)胞VEGF的表達(dá)，促進(jìn)子宮頸癌微血管生成。