汪德會，李 攀，李能章，彭遠義

（西南大學(xué) 動物科技學(xué)院，重慶 400715）

革蘭陰性菌（Gram-negative bacteria）的外膜是一種由蛋白質(zhì)、脂多糖、磷脂等多種物質(zhì)組成的復(fù)合結(jié)構(gòu)，約占細胞壁干重的80%，是革蘭陰性菌抵抗外來有毒化合物的第一道防線?？椎鞍祝≒orins）是外膜蛋白（OMPs）家族中的一類典型膜通道蛋白，1979 年Nakae 第一次描述了它的特征并將其命名為孔蛋白。孔蛋白的結(jié)構(gòu)在莢膜紅細菌（Rhodobacter capsulatus）中首次得到了精準解析[1]，這類蛋白質(zhì)參與了多種營養(yǎng)物質(zhì)和有毒小分子（糖、藥物、小肽、化學(xué)物質(zhì))的運輸。此外，孔蛋白可誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生免疫應(yīng)答、參與細菌的耐藥和補體活化等，并可作為新型疫苗候選靶標和免疫佐劑[2-3]。本文從孔蛋白的分子結(jié)構(gòu)、在細菌感染和耐藥中的作用以及作為疫苗佐劑研究等予以綜述，為了解細菌的耐藥機制以及研發(fā)新的疫苗提供參考。

1 孔蛋白的分子結(jié)構(gòu)

孔蛋白貫穿于細菌外膜的磷脂雙分子層，在其外表面形成一富含水的通道，通常僅允許小于0.6 ku 的親水性小分子通過。革蘭陰性菌孔蛋白有單體和三聚體兩種結(jié)構(gòu)。

經(jīng)典的孔蛋白是由三個單體聚合而成的三聚體結(jié)構(gòu)，單體之間由L2 環(huán)（Loop）連接，每個單體由300～420 個氨基酸構(gòu)成，其N 端有由21 個氨基酸組成的信號肽序列，其C 端有一個苯丙氨酸殘基，該殘基是孔蛋白正確導(dǎo)入外膜并在其中折疊的重要前提[4]。經(jīng)典孔蛋白分為非特異孔蛋白（General or Non-specific porins）（如OmpF、PhoE 和OprP）和底物特 異 孔 蛋 白（Substrate specific porins）（如LamB 和ScrY）兩類，這兩類蛋白的單體分別由16 和18 條反平行的肽鏈折疊成一個β桶（β barrel）狀結(jié)構(gòu)，孔徑的最大橫徑在30 ?～35 ?之間，最大高度約為50 ?[5-6]。每個單體鏈在周質(zhì)內(nèi)側(cè)以7 或8 條短環(huán)連接，在細胞外側(cè)則以不規(guī)則的9 或7 條長環(huán)連接，最長的L3 環(huán)并不在胞外側(cè)暴露而是在桶內(nèi)通道高度的一半處折疊形成收縮區(qū)，在該收縮區(qū)內(nèi)，L3 環(huán)中的酸性殘基（Asp-113、Glu-117）和與之相對筒體壁中的一簇堿性殘基（Lys-16、Arg-42、Arg-82、Arg-132）形成了較強的橫向靜電場，對孔隙的滲透性起著決定性的作用[7]（圖1）。L3 環(huán)含有一個序列基序—PEFGG，在大腸桿菌孔蛋白（OmpF）中高度保守，該基序構(gòu)成了L3 環(huán)中最柔性的區(qū)域，使L3 環(huán)在孔徑內(nèi)有局部運動的可能性。底物特異孔蛋白與非特異孔蛋白不同的是，長環(huán)L1 也能在桶內(nèi)折疊，與L3 環(huán)共同決定孔徑的大小，并且外環(huán)通常聚合形成一個保護傘，起著保護孔徑和限制大分子物質(zhì)進入孔隙的作用，這可能與底物特異性結(jié)合相關(guān)[8]。

單聚體孔蛋白與三聚體孔蛋白的單體結(jié)構(gòu)類似，一般由8、12 或14 條肽鏈β折疊而成，因其孔隙內(nèi)缺少像三聚體孔蛋白L3 環(huán)類似的收縮區(qū)結(jié)構(gòu)，使得其孔徑比經(jīng)典的孔蛋白單體大；其孔徑一般為橢圓狀，單側(cè)在鏈S6～S10 處稍扁[7]。大腸桿菌單聚體孔蛋白（OmpG）構(gòu)型受pH 值的影響，在中性pH下， L6 和L7 環(huán)投射到細胞外介質(zhì)中，使孔洞打開，而在低pH 下，其在孔道內(nèi)折疊并阻塞孔道[9]（圖2）。

圖1 大腸桿菌三聚體孔蛋白OmpF 的結(jié)構(gòu)[8]

圖2 大腸桿菌單體孔蛋白OmpG 的結(jié)構(gòu)，A、B 和C、D 分別為孔徑開放和關(guān)閉狀態(tài)[9]

2 孔蛋白在細菌感染中的作用

2.1 孔蛋白介導(dǎo)的信號通路轉(zhuǎn)導(dǎo)及免疫反應(yīng)

孔蛋白是細菌外膜重要的組成成分，在細菌感染宿主的過程中，孔蛋白可黏附侵入不同類型的組織細胞，刺激宿主細胞產(chǎn)生一系列促炎因子、抗炎因子和趨化因子，并誘導(dǎo)下游效應(yīng)細胞的成熟與分化，從而增強細胞表面MHC 分子以及共刺激分子（Co-stimulatory molecules）的表達，在天然免疫和獲得性免疫中起著重要的作用。

孔蛋白的特異受體目前尚不明確，但其作為病原相關(guān)分子模式（Pathogen associated molecular patterns，PAMPs）能 被Toll 樣 受 體（Toll-like receptor，TLR）或其它模式識別受體（Pattern-recognition receptors，PRRs）所識別而發(fā)揮作用[3]（圖3）。TLR 廣泛表達于多種組織和細胞，其中TLR2 是TLR 家族中功能較多、識別譜最廣的受體之一，在天然免疫中起著重要的作用。大量研究表明，許多革蘭氏陰性菌孔蛋白均能被TLR2 或其它受體分子識別，使免疫細胞活化，誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)。例如，腦膜炎奈瑟氏菌（Neisseria meningitidis）孔蛋白PorB 能被TLR2 識別，通過髓樣分化因子88（MyD88）依賴途徑、絲裂原活化蛋白激酶（Mitogen-activated protein kinases，MAPK）和核轉(zhuǎn)錄因子kappa B（Nuclear factor κB，NF-κB）通路誘導(dǎo)抗原遞呈細胞（Antigen presenting cell，APC）的活化、增強MHC Ⅱ和CD86分子的表達、并誘導(dǎo)B細胞增殖和樹突狀細胞（DCs）的成熟，可在天然免疫與獲得性免疫中起著橋梁的作用[10-11]。研究顯示，PorB 可直接與TLR2 結(jié)合，在TLR6 敲除小鼠內(nèi)誘導(dǎo)B 細胞分泌高水平的IL-6，而在TLR1 敲除小鼠內(nèi)使B 細胞分泌IL-6 的能力明顯減弱，表明PorB 誘導(dǎo)細胞的活化需要TLR2/TLR1（而不是TLR2/TLR6）異源二聚體進一步來發(fā)揮其生物學(xué)效應(yīng)[12]。此外，痢疾桿 菌（Shigella dysenteriae）MOMP、流 感 嗜 血 桿 菌（Haemophilus influenzae）Hib 以及具核梭桿菌（Fusobacterium nucleatum）FomA 等孔蛋白也能被TLR2 識別，誘導(dǎo)相應(yīng)免疫細胞的活化，促使發(fā)生一系列免疫反應(yīng)[13-15]。

孔蛋白除了能被TLR2 識別之外，也能通過其它信號途徑或方式誘導(dǎo)免疫反應(yīng)。鼠傷寒沙門氏菌（Salmonella enterica serovar typhimurium）34 ku 和36 ku孔蛋白能在不同的組織細胞中通過相似或不同的信號通路誘導(dǎo)炎癥因子、共刺激分子的表達。其中，這兩種蛋白在小鼠巨噬細胞（RAW 264.7）中通過P38 和JNK MAPK 通路誘導(dǎo)一氧化氮分子（NO）的分泌[16]，在人白血病單核細胞（U937）中可通過Raf-1-MEK1-MEK2-MAPK 通路活化NF-κB 和AP-1，以及誘導(dǎo)蛋白酪氨酸激酶（NT-PTK）、蛋白激酶A（PKA）和蛋白激酶C（PKC）磷酸化并促使TNF-α 、IL-1β 、IL-6 和IL-10 的分泌[17-18]。此外，這兩種蛋白在小鼠脾細胞模型中活化CD4+T 細胞并促進IFN-γ和IL-4的分泌，在人外周淋巴細胞（Human PBMCs）中可誘導(dǎo)CD80 和CD86 的表達[19]。流感嗜血桿菌孔蛋白P2中的L5、L6 和L7 環(huán)也能激活JNK 和P38 MAPK 通路促進IL-6 和TNF-α的分泌，表明孔蛋白細胞的外側(cè)環(huán)可發(fā)揮生物學(xué)活性作用[20]。

圖3 革蘭陰性菌孔蛋白介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及免疫反應(yīng)[3]

2.2 孔蛋白參與補體的激活

補體系統(tǒng)（Complement system）是存在于人和動物血液、組織液和細胞膜表面的一種復(fù)雜的限制性蛋白水解系統(tǒng)，是機體固有免疫防御體系的重要組成部分，可參與病原微生物的防御和免疫調(diào)節(jié)。研究表明部分革蘭陰性菌孔蛋白可與補體C1q 結(jié)合，通過經(jīng)典途徑激活補體。嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophila）孔蛋白II 能與C1q 結(jié)合，并以非抗體依賴方式激活補體經(jīng)典途徑，然后酶解C4 并降低血清總?cè)苎钚訹21]。肺炎克雷伯氏菌（K.pneumoniae）孔蛋白OmpK36 通過與C1q 結(jié)合激活體內(nèi)經(jīng)典補體途徑，并使C3、C5-9（MAC）成分在孔蛋白中沉積[22]。淋球菌孔蛋白Por1B 通過酰胺鍵和酯鍵選擇性結(jié)合補體結(jié)合蛋白C4b 和C3b，促使C5 轉(zhuǎn)化酶的形成[23]。Mishra M 等研究顯示體外重組表達的銅綠假單胞菌孔蛋白OprF 可與補體C3b 結(jié)合，同時增加補體介導(dǎo)的殺菌效應(yīng)[24]。

3 孔蛋白在細菌耐藥中的作用

革蘭陰性菌目前占耐藥細菌的主導(dǎo)部分，隨著抗菌藥物的使用增多，其耐藥復(fù)雜性也隨之增加，給臨床用藥以及細菌疾病的防治帶來了巨大的挑戰(zhàn)?？椎鞍资羌毦饽て琳系闹匾煞郑粋€細胞擁有孔蛋白的數(shù)量和類型將決定其滲透性，從而決定細菌對抗生素的敏感或耐藥性。目前認為，孔蛋白表達量的變化、基因突變（點突變、缺失突變、插入元件）等均會引起細菌外膜通透性降低而引起細菌耐藥[25-26]。

3.1 孔蛋白基因突變與細菌耐藥

大量研究表明，孔蛋白的缺失可導(dǎo)致細菌耐藥。Hao 等從臨床分離了18 株耐碳青霉烯酶（Carbapenems）的產(chǎn)氣腸桿菌（Enterobacter aerogenes），其中14 株有耐碳青霉烯酶基因（blaKPC-2）的存在，對這14 株耐藥菌株進行SDS-PAGE 分析，發(fā)現(xiàn)有兩株（A4 和A23）缺失孔蛋白Omp35，兩株（A18 和A19）孔蛋白Omp36 的表達下降；而對這4 株孔蛋白缺陷菌株的功能恢復(fù)后發(fā)現(xiàn)其對碳青霉烯類藥物的最小抑菌濃度（MIC）降低了2～4 倍，表明孔蛋白Omp35和Omp36 缺失或表達減少會引起產(chǎn)氣腸桿菌對碳青霉烯酶藥物的耐藥[27]。另外，Zhen 等從214 株產(chǎn)KPC 的肺炎克雷伯菌（KPC producing Klebsiella pneumonia，KPC-KP）中篩選出了24 株耐頭孢他啶（Ceftazidime）菌株，根據(jù)最小抑菌濃度將其分為高、中、低三組，用ELISA 和RT-PCR 技術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)高MIC 組菌株的頭孢他啶水解酶活性以及耐藥基因（blaKPC）的轉(zhuǎn)錄水平均明顯高于其它兩組，同時SDS-PAGE 結(jié)果顯示MIC＞1 mg/mL 的所有菌株孔蛋白OmpK35 均缺失，而在敏感菌株中孔蛋白OmpK35和OmpK36 均存在；測序分析顯示，由于孔蛋白基因存在移碼致使轉(zhuǎn)錄提前終止（n=15）以及孔蛋白負調(diào)控基因micF 和ompR 的過表達導(dǎo)致OmpK35 缺失，表明孔蛋白缺失并伴有抗菌藥物的水解酶表達增加時，可加重細菌的耐藥[28]。

此外，孔蛋白基因點突變和插入元件（IS）也能引起細菌耐藥。Emmanuelle Dé等首次描述腸桿菌（Enterobacteriaceae）孔蛋白L3 環(huán)中第112 位氨基酸由G 突變?yōu)镈 可改變該蛋白的功能從而導(dǎo)致該菌對β-內(nèi)酰胺類藥物的耐藥[29]。同樣地，淋病奈瑟菌孔蛋白PIB L3 環(huán)基因突變同時伴隨mtrR 突變導(dǎo)致外排泵（Efflux pump）過表達時可導(dǎo)致該菌對青霉素和四環(huán)素耐藥[30]。Diene S M 等從一名沒有接受碳青霉烯類藥物治療的囊性纖維化（CF）患者身上分離了6 株銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa），其中有5 株對亞胺培南（Imipenem）耐藥，1 株敏感。在這6 株菌中均未檢測到碳青霉烯酶耐藥基因以及碳青霉烯酶活性，PCR 和測序顯示耐藥菌株（n=5）孔蛋白基因porD 中均存在插入序列ISPa46，而敏感菌株（n=1）存在的插入序列ISPa46 并未插入到porD 基因中，表明其耐藥原因與碳青霉烯酶無關(guān)，而是孔蛋白oprD基因中插入ISPa46 發(fā)生轉(zhuǎn)位導(dǎo)致耐藥[31]。臨床中耐藥細菌可能同時存在耐藥基因和孔蛋白基因突變，這些耐藥因素的疊加作用致使耐藥情況更加復(fù)雜化。

3.2 孔蛋白表達水平與細菌耐藥

細菌可以在不利于其生存的環(huán)境通過調(diào)控自身基因的表達來抵抗外來因素的威脅。研究顯示，細菌孔蛋白的表達減少可導(dǎo)致細菌耐藥。Lee J Y 等從357 株腸桿菌中篩選了31 株耐亞胺培南菌株，通過多位點序列（MLST）和ERIC-PCR 分析顯示這些菌株的遺傳關(guān)系較遠，并且在大多數(shù)耐藥菌株（n=29）中均不存在亞胺培南耐藥基因，同時其孔蛋白ompD和ompK35 基因的表達水平均下降；表明亞胺培南抗性似乎在大多數(shù)亞胺培南耐藥菌株中均是獨立發(fā)生的，而孔蛋白表達減少是導(dǎo)致亞胺培南敏感性降低的主要原因[32]。此外，非藥物特異孔蛋白表達增加時會影響細菌外膜通透性，從而導(dǎo)致細菌對某一類藥物敏感或耐藥。Anuwat A 等研究顯示伯克霍爾假單胞菌（Burkholderia pseudomallei，Bps）表達孔蛋白BpsOmp38 的菌株比對照菌株的抗菌敏感性更低，同時脂質(zhì)體腫脹試驗顯示，Bps 耐藥的藥物（頭孢西丁、頭孢吡肟和多瑞培南）并不能通過BpsOmp38 通道，Bps 敏感的藥物頭孢他啶和美羅培南卻與此相反；此外，編碼BpsOmp38 基因的氨基酸Tyr119 被Ala119 取代時有利于Bps 對抗菌藥物的吸收，而被Phe119 取代時則可抑制Bps 對抗菌藥物的吸收；表明BpsOmp38 是一個特異性孔蛋白并與膜通透性相關(guān)，而殘基Tyr119 的替代影響了BpsOmp38 通道對中性糖和抗菌藥物的吸收[33]。

4 孔蛋白作為疫苗候選靶標和免疫佐劑

孔蛋白作為一類膜通道蛋白暴露于革蘭陰性菌表面，具有高度的免疫原性，可作為疫苗候選靶標及活性佐劑。Yadav 等將40 ku 嗜水氣單胞菌孔蛋白OmpF 腹腔免疫小鼠，在49 d 后還能檢測到很高的免疫球蛋白IgG 滴度，同時發(fā)現(xiàn)該蛋白的抗血清能同時與不同親水性的氣單胞菌反應(yīng)；此外，該蛋白在體外能夠促進小鼠淋巴細胞的增殖和T 細胞分泌IL-4 和IFN-γ[34]。而將同菌株孔蛋白Omp48 免疫鯪魚，該蛋白可對鯪魚針對同一菌株和遲緩型愛德華菌（Edwardsiella tarda）提供60%～70%的抗感染能力，表明OmpF 和Omp48 有作為疫苗抗原的潛質(zhì)[35]。Li等研究顯示，副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus）的孔蛋白VP1061 和VP2850 對魚和小鼠針對溶藻弧菌（V.alginolyticus）、嗜水氣單胞菌（A.hydrophila）和熒光假單胞菌（Pseudomonas fluorescens）的感染具有交叉抵抗能力，而有望成為新型多價疫苗[36]。Tan 等將B型多殺性巴氏桿菌（Pasteurella multocida，Pm）孔蛋白OmpH 分別皮下和腹腔注射免疫小鼠，該蛋白可對小鼠針對同型Pm 菌株分別提供80%和100%的抗感能力；而本實驗室將A 型Pm OmpH 與PM0979 融合表達免疫小鼠，該融合蛋白可對小鼠針對A 型和B 型Pm 分別提供70%和30%的抗感染能力[37-38]。另外，奈瑟菌屬孔蛋白PorB 作為TLR2 的激動劑已成為佐劑的研究熱點，其誘導(dǎo)APCs 的活化以及下游效應(yīng)分子的表達必須依賴完整的MyD88 信號分子[11]。其中Liu 等用Nlac PorB 作為佐劑并以卵清蛋白（OVA）作為標準抗原免疫小鼠，與單獨免疫卵清蛋白相比，可誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生高滴度、OVA 特異的IgG 和IgM，與用Nme-PorB 和鋁膠佐劑免疫小鼠產(chǎn)生的抗體滴度相同，并可促進炎性因子IL-4、 IL-10、IL-12 和INF-γ的分泌，以及誘導(dǎo)Th1 和Th2 型免疫反應(yīng)[39]。最近研究顯示，PorB 可誘導(dǎo)小鼠分泌與Th2/Th1 型反應(yīng)相關(guān)的OVA 特異性抗體IgG1、IgG2b、IgG2c 和IgG3 以 及效應(yīng)分子MIG、MCP-1、IP-10、MIP-1、CXCL1 和IL-2，同時促進T 細胞分泌IL-4、IL-5、IL-13 和IFN-γ；PorB 佐劑疫苗還能促進抗原特異性的CD4+T 和CD8+T 細胞的增殖，同時能降低小鼠在單增李斯特菌低劑量感染時的定殖，提高在高劑量感染時的存活率[40]。表明以TLR2配體為主的奈瑟菌孔蛋白PorB 具有廣泛的佐劑和抗原活性，可用于疫苗佐劑研發(fā)。

5 小結(jié)與展望

孔蛋白有單聚體和三聚體兩種結(jié)構(gòu)，其可通過激活補體、作為PAMPs 識別TLR2、通過膜通透性變化等參與細菌的致病過程，同時其本身可作為疫苗候選靶標和佐劑（表1）?？椎鞍譒3 環(huán)在胞內(nèi)折疊形成收縮區(qū)，以限制大分子物質(zhì)進入胞內(nèi)，并且L3環(huán)基因突變可導(dǎo)致細菌耐藥[29]，深入探究L3 環(huán)的結(jié)構(gòu)和功能有助于了解細菌的耐藥機制，同時為臨床研發(fā)小分子量、靶向細胞外的一類藥物以減少耐藥細菌的產(chǎn)生提供參考。然而，細菌的耐藥除與細胞膜通透性有關(guān)外，還與耐藥基因、細菌水解酶的多少以及用藥情況息息相關(guān)，這為臨床用藥帶來了極大的挑戰(zhàn)[2]。佐劑是疫苗的重要組成部分,安全有效的佐劑能夠提高疫苗的免疫效果，TLR激動劑已廣泛用于人和動物的疫苗生產(chǎn)，例如瘧疾、HIV、結(jié)核、癌癥等許多疑難疾病的疫苗也加入了這些佐劑[41]。研究孔蛋白的TLR2 激動劑效應(yīng)可為臨床疫苗研發(fā)的多樣性提供新的可能。因此，深入研究孔蛋白的分子結(jié)構(gòu)以及與宿主的相互作用，有利于了解細菌的耐藥和致病機制，同時為開發(fā)針對細菌病的新型疫苗奠定基礎(chǔ)。

表1 革蘭陰性菌孔蛋白結(jié)構(gòu)及功能應(yīng)用