郝妍斐,盧永穎,王信林,郭欣茹,江修宇,張瀟文,杜 源,張雷明

(煙臺(tái)大學(xué)藥學(xué)院,分子藥理和藥物評(píng)價(jià)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(煙臺(tái)大學(xué)),山東 煙臺(tái) 264005)

肝臟是以代謝功能為主的器官,擔(dān)負(fù)人體的重要生理功能,據(jù)統(tǒng)計(jì),我國(guó)每年約有38萬人死于肝臟疾病,嚴(yán)重危害人類健康[1]．免疫性肝損傷通常由生物性因素等引起,其重要的特征是肝組織內(nèi)大量的炎細(xì)胞浸潤(rùn),產(chǎn)生免疫/炎癥應(yīng)答,從而導(dǎo)致以免疫反應(yīng)為基礎(chǔ)的肝損傷[2]．現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為,免疫性肝損傷的發(fā)病機(jī)制與免疫/炎癥應(yīng)答及免疫調(diào)節(jié)紊亂有關(guān)[3]．

研究顯示,固有免疫分子NOD樣受體蛋白3(NLRP3)炎性小體作為激活細(xì)胞炎癥反應(yīng)的分子裝置,在肝臟疾病的發(fā)病中發(fā)揮啟動(dòng)或促進(jìn)作用[4-5],提示肝臟NLRP3炎性小體的活化在免疫性肝損傷的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用．Toll樣受體4(TLR4)是最早發(fā)現(xiàn)的TLR家族的重要成員之一,在天然免疫中發(fā)揮著重要作用．NF-κB是廣泛存在于哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的重要轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子,在誘導(dǎo)炎癥因子表達(dá)方面起關(guān)鍵性調(diào)控作用[6]．TLR4與其配體結(jié)合后,可啟動(dòng)經(jīng)典的NF-κB信號(hào)通路,最終引起NF-κB的活化[7]．有文獻(xiàn)顯示,NF-κB 能夠調(diào)節(jié)由炎癥反應(yīng)、肝免疫功能紊亂誘發(fā)的急性肝損傷、肝硬化、肝細(xì)胞惡變及肝癌的生長(zhǎng)[8]．

龍膽科植物中的環(huán)烯醚萜苷類化合物具有肝保護(hù)作用[9]．龍膽苦苷(gentiopicroside)是龍膽屬植物龍膽的主要藥效成分[9],具有保肝、抗炎等作用[10-12],結(jié)構(gòu)式見圖1．有文獻(xiàn)報(bào)道,龍膽苦苷對(duì)膿毒癥小鼠急性肝損傷具有保護(hù)作用[13].然而,龍膽苦苷對(duì)免疫性肝損傷的保護(hù)作用及其機(jī)制尚未見確切報(bào)道.基于此,本研究考察了龍膽苦苷對(duì)Con A所致小鼠免疫性肝損傷的保護(hù)作用及其機(jī)制．

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 雄性BALB/c小鼠(體重20±1 g)60只,SPF級(jí),由濟(jì)南朋悅動(dòng)物繁育有限公司提供,動(dòng)物許可證號(hào)SCXK(魯)2014-0007．所有實(shí)驗(yàn)用小鼠均在煙臺(tái)大學(xué)藥學(xué)院動(dòng)物房?jī)?nèi)飼養(yǎng),室溫控制在22±1°C,相對(duì)濕度約為40%,動(dòng)物自由飲水?dāng)z食,給予正常晝夜光照．本研究經(jīng)過煙臺(tái)大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn),實(shí)驗(yàn)方案符合煙臺(tái)大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)的規(guī)定．

1.1.2 實(shí)驗(yàn)儀器與設(shè)備 電子天平(瑞士梅特勒-托利多(Mettler Toledo)有限公司);電熱鼓風(fēng)干燥箱(上海一恒科學(xué)儀器有限公司);移液器(德國(guó)艾本德(Eppendrof)公司);低溫離心機(jī)(德國(guó)艾本德(Eppendrof)公司);全波長(zhǎng)掃描酶標(biāo)儀(美谷分子儀器(Molecular Devices)上海有限公司)．

1.1.3 實(shí)驗(yàn)藥品與試劑 龍膽苦苷購(gòu)自南京廣潤(rùn)生物技術(shù)有限公司(GR-135-180320);聯(lián)苯雙酯滴丸購(gòu)自萬邦德制藥公司(A02J180304);刀豆蛋白A購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司;ALT、AST檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所．

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組 BALB/c小鼠60只,隨機(jī)分為6組:空白對(duì)照組、模型組、聯(lián)苯雙酯100 mg/kg(陽(yáng)性對(duì)照)組、龍膽苦苷25 mg/kg組、龍膽苦苷50 mg/kg組、龍膽苦苷100 mg/kg組,每組10只．

1.2.2 實(shí)驗(yàn)造模及給藥 參考相關(guān)文獻(xiàn),按1.2.1的實(shí)驗(yàn)分組灌胃給予相應(yīng)的溶媒或藥物,每天1次,連續(xù)7 d．末次給藥1 h后尾靜脈注射10 mg/kg Con A進(jìn)行造模,禁食8 h后,小鼠立即安樂死,同時(shí)取血清、肝臟、脾臟等進(jìn)行下述各項(xiàng)檢測(cè)．

1.3 檢測(cè)指標(biāo)

1.3.1 肝組織病理檢測(cè) 注射Con A 8 h后,每組隨機(jī)挑選3只小鼠進(jìn)行心臟灌注．先灌注20 mL生理鹽水,再灌注20 mL 4%多聚甲醛組織固定液,取小鼠右葉肝臟,固定于4%多聚甲醛組織固定液中,經(jīng)過脫水、石蠟包埋、制片、HE染色,光學(xué)顯微鏡觀察肝臟病理變化．

1.3.2 肝臟轉(zhuǎn)氨酶活性檢測(cè) 注射Con A 8 h后,麻醉小鼠并取血,室溫下靜置半小時(shí),4°C離心15 min(3 500 r/min),吸取上清,按ALT、AST檢測(cè)試劑盒(微板法)的標(biāo)準(zhǔn)操作流程,檢測(cè)血清中ALT、AST含量．為消除血清中脂血、溶血的影響,測(cè)定時(shí)每個(gè)樣品孔都設(shè)定自身對(duì)照．

1.3.3 肝、脾指數(shù)檢測(cè) 各組小鼠取血前稱重,記錄體重．麻醉取血后處死小鼠,剝離肝臟、脾臟,在預(yù)冷的生理鹽水中漂洗干凈,濾紙吸干水分,電子天平稱重,計(jì)算臟器指數(shù):臟器指數(shù)=(臟器質(zhì)量g/動(dòng)物質(zhì)量10 g)×100%.觀察肝、脾臟形態(tài)變化．

1.3.4 肝組織蛋白表達(dá)檢測(cè) 將肝組織置于裂解緩沖液中進(jìn)行勻漿以提取蛋白質(zhì),勻漿在8 000 r/min,4 ℃的條件下離心30 min,收集上清液．使用BCA法測(cè)定蛋白質(zhì)含量．通過Western blot分別測(cè)定肝臟中的NLRP3、TLR4、P65以及p-P65的表達(dá),并用ImageJ/Gel-pro軟件進(jìn)行定量分析．

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 龍膽苦苷對(duì)Con A致肝損傷小鼠肝臟病理學(xué)的影響

HE染色結(jié)果顯示,對(duì)照組小鼠肝臟細(xì)胞排列整齊規(guī)則,以中央靜脈為中心呈單行放射狀分布,細(xì)胞結(jié)構(gòu)形態(tài)正常．模型組小鼠“肝條索”消失,中央靜脈周圍大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn),肝細(xì)胞脂肪變性,壞死．聯(lián)苯雙酯100 mg/kg組小鼠肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)形態(tài)正常,細(xì)胞壞死及炎性細(xì)胞浸潤(rùn)聚集均顯著減少．龍膽苦苷 25 mg/kg劑量組小鼠肝臟較模型組有所好轉(zhuǎn),龍膽苦苷 50,100 mg/kg劑量組小鼠肝條索狀排列趨于正常,細(xì)胞壞死、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)顯著減少(圖2)．

2.2 龍膽苦苷對(duì)Con A致肝損傷小鼠血清ALT、AST含量的影響

取小鼠血清,根據(jù)ALT、AST試劑盒的標(biāo)準(zhǔn)操作流程,檢測(cè)血清中ALT、AST的含量．結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,模型組小鼠血清ALT、AST含量明顯升高(P<0.01),與模型組相比,聯(lián)苯雙酯100 mg/kg組顯著降低小鼠血清中ALT、AST含量(P<0.05或P<0.01),3個(gè)劑量組的龍膽苦苷均能顯著降低小鼠血清ALT及AST的含量(P<0.05或P<0.01)(圖3)．

2.3 龍膽苦苷對(duì)Con A致肝損傷小鼠肝、脾指數(shù)的影響

取小鼠肝臟、脾臟并稱重,計(jì)算肝、脾指數(shù)．結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,模型組小鼠肝、脾腫大,肝、脾指數(shù)均明顯升高(P<0.01);與模型組相比,聯(lián)苯雙酯 100 mg/kg 劑量組顯著降低小鼠脾臟指數(shù)(P<0.01),龍膽苦苷25、50、100 mg/kg劑量組均能顯著降低小鼠肝、脾指數(shù)(P<0.01或P<0.05)(圖4,圖5)．

2.4 龍膽苦苷對(duì)Con A致肝損傷小鼠肝組織NL-RP3、TLR4和P65的影響

2.4.1 龍膽苦苷對(duì)Con A致肝損傷模型小鼠肝組織NLRP3炎性小體表達(dá)的影響 采用Western blot技術(shù),檢測(cè)小鼠肝臟勻漿中NLRP3的表達(dá)．結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,模型組小鼠肝組織NLRP3表達(dá)明顯升高(P<0.05);與模型組相比,聯(lián)苯雙酯 100 mg/kg組小鼠肝組織NLRP3表達(dá)略有下降但并無顯著性差異;與模型組相比,龍膽苦苷 50及100 mg/kg劑量組小鼠肝組織NLRP3表達(dá)顯著降低(P<0.05)(圖6)．

2.4.2 龍膽苦苷對(duì)Con A致肝損傷小鼠肝組織TLR4表達(dá)的影響 采用Western blot技術(shù),檢測(cè)小鼠肝臟勻漿中TLR4的表達(dá)．結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,模型組小鼠肝組織TLR4表達(dá)明顯升高(P<0.05);與模型組相比,聯(lián)苯雙酯 100 mg/kg組小鼠肝組織TLR4表達(dá)顯著下降;與模型組相比,龍膽苦苷 50及100 mg/kg劑量組小鼠肝組織NLRP3表達(dá)顯著降低(P<0.05)(圖7)．

2.4.3 龍膽苦苷對(duì)Con A致肝損傷小鼠肝組織P65蛋白磷酸化的影響 采用Western blot技術(shù),檢測(cè)小鼠肝臟勻漿中P65和p-P65的表達(dá)．結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,模型組小鼠肝組織p-P65/P65表達(dá)明顯升高(P<0.05);與模型組相比,龍膽苦苷 25,50,100 mg/kg劑量組小鼠肝組織p-P65/P65表達(dá)均顯著降低(P<0.01)(圖8)．

3 討 論

肝病的發(fā)病與免疫功能密切相關(guān)[14]．1992年,TIEGS等[15]成功地應(yīng)用Con A誘發(fā)了小鼠特異性肝損傷,這一實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ褪怯蒚淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的免疫性肝損傷．Con A是一種植物凝集素,可以刺激T細(xì)胞活化,并在肝臟中特異性聚積[16],Con A與肝竇有很好的親和性,小鼠靜脈注射Con A后,T淋巴細(xì)胞隨循環(huán)系統(tǒng)進(jìn)入肝竇并在局部增殖,釋放多種細(xì)胞因子進(jìn)而導(dǎo)致肝損傷,這種誘導(dǎo)方式具有肝臟特異性和靶向性,與自身免疫性肝病和人類病毒性肝炎非常相似[17],因此本研究選用此模型來觀察龍膽苦苷對(duì)免疫性肝損傷的影響．

目前,臨床評(píng)價(jià)肝損傷的主要指標(biāo)有ALT和AST[18],生理狀態(tài)下,ALT、AST主要存在于肝細(xì)胞內(nèi),血清中這二者的含量很低．當(dāng)發(fā)生肝損傷時(shí),肝細(xì)胞破裂死亡,大量的ALT、AST釋放入血,導(dǎo)致機(jī)體血清中ALT、AST含量大量增加[19]．與此同時(shí),肝組織也發(fā)生病理性變化,出現(xiàn)脂肪變性、壞死以及炎細(xì)胞浸潤(rùn)．在本研究中,小鼠尾靜脈注射Con A后,肝組織結(jié)構(gòu)破壞,血清ALT、AST水平顯著升高,肝細(xì)胞出現(xiàn)彌漫性壞死,同時(shí)伴有淤血和炎細(xì)胞浸潤(rùn),說明造模成功．低、中、高劑量的龍膽苦苷均能顯著降低模型動(dòng)物血清ALT、AST的水平,肝細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)趨于正常,脂肪病變、壞死以及炎細(xì)胞浸潤(rùn)均顯著減少．上述結(jié)果提示,龍膽苦苷對(duì)Con A所致小鼠免疫性肝損傷有一定的保護(hù)作用．研究表明,由于炎癥作用,肝損傷時(shí)常會(huì)伴有肝、脾腫大[20]．在本實(shí)驗(yàn)中,小鼠腹腔注射Con A 8 h后,肝、脾明顯腫脹,而不同劑量的龍膽苦苷均能夠顯著減輕小鼠肝、脾的腫脹程度,表明龍膽苦苷能對(duì)Con A所致的肝損傷起到保護(hù)作用．

免疫性肝損傷發(fā)病機(jī)制可能與游入肝組織的炎癥細(xì)胞功能狀態(tài)密切相關(guān)[21]．NLRP3炎性小體作為固有免疫的重要組分在機(jī)體免疫反應(yīng)和疾病發(fā)生過程中具有重要作用．有研究顯示,NLRP3炎性小體在免疫性肝損傷的發(fā)生發(fā)展期間具有促炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵作用[22]．TLR4是細(xì)胞上的跨膜蛋白,廣泛存在于T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞表面,其參與的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)對(duì)免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié)發(fā)揮著至關(guān)重要的作用[23]．許多植物多糖可作為TLR4配體進(jìn)而激活TLR4/NF-κB信號(hào)通路,活化轉(zhuǎn)錄因子NF-κB,調(diào)控細(xì)胞因子的轉(zhuǎn)錄,提升機(jī)體的免疫防御能力[24-25]．由此發(fā)現(xiàn)NLRP3、TLR4以及NF-κB 信號(hào)通路的活化可能是急性肝損傷發(fā)生機(jī)制中的關(guān)鍵調(diào)節(jié)點(diǎn)．因此,本研究以上述三者為研究對(duì)象,研究了龍膽苦苷的肝損傷保護(hù)機(jī)制．結(jié)果顯示,龍膽苦苷可顯著抑制NLRP3炎性小體的表達(dá)以及TLR4/NF-κB信號(hào)通路的活化,進(jìn)而抑制炎癥反應(yīng),對(duì)肝臟起到保護(hù)作用．

本研究初步表明,龍膽苦苷對(duì)Con A誘導(dǎo)的小鼠免疫性肝損傷具有明顯的保護(hù)作用,其作用機(jī)制可能是通過抑制NLRP3、TLR4的活化以及降低NF-κB P65的磷酸化來發(fā)揮肝保護(hù)作用．其中NF-κB P65的磷酸化以及NLRP3炎性小體的表達(dá)兩者之間的具體調(diào)節(jié)關(guān)系有待進(jìn)一步研究．

4 結(jié) 論

綜上所述,龍膽苦苷對(duì)Con A致小鼠肝損傷有較好的保護(hù)作用;龍膽苦苷可能通過下調(diào)NLRP3并降低TLR4、p-P65/P65的表達(dá)來抑制機(jī)體炎癥反應(yīng),從而發(fā)揮肝保護(hù)作用．