侯翠英,臺丹丹,趙明日,孫 力

(煙臺大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,山東 煙臺 264005)

藻膽體(Phycobilisome,PBS)是藍(lán)藻、灰胞藻和紅藻所特有的捕光色素蛋白復(fù)合體,由負(fù)責(zé)捕獲和傳遞光能的藻膽蛋白(phycobiliprotein,PBP)和連接多肽組成(linker polypeptide,L)[1-2],通過核膜連接多肽(core-membrane linker polypeptide,LCM)錨定在類囊體膜的基質(zhì)側(cè)[3-4],并與二聚體光系統(tǒng)PSⅡ的兩個光反應(yīng)中心偶連[4]．根據(jù)已報(bào)道的藻膽體的結(jié)構(gòu)模型,藻膽體由藻紅蛋白(phycoerythrin,PE)和藻藍(lán)蛋白(phycocyanin,PC)及其連接多肽構(gòu)成的“棒”(rod)亞結(jié)構(gòu)域和由別藻藍(lán)蛋白(allphycocyanin,AP)及核連接多肽構(gòu)成的“核”(core) 亞結(jié)構(gòu)域兩部分組成,其中“核”被外周的“棒”狀結(jié)構(gòu)呈發(fā)散狀圍繞著[5-6]．外圍“棒”狀結(jié)構(gòu)將捕獲的光傳遞給“核”,最后傳遞給位于類囊體膜內(nèi)、藻膽體下方的PSⅡ的光反應(yīng)中心葉綠素a[7]．藻膽體的這種高效、單向光能傳遞完全取決于其各類藻膽蛋白-連接多肽復(fù)合體在藻膽體內(nèi)的有序組裝．

PBS最先是在單細(xì)胞紅藻紫球藻(Porphyridiumcruentum)中被發(fā)現(xiàn)的,但到目前為止有關(guān)藻膽體結(jié)構(gòu)與功能的研究報(bào)道主要來自藍(lán)藻[8-12],來自紅藻尤其是大型紅藻藻膽體的研究報(bào)道很有限．近期來自紫球藻(Porphyridiumcruentum)半球型藻膽體[13-14]、調(diào)毛藻GriffithsiapacificaBlock-type藻膽體[15-17]結(jié)構(gòu)研究,進(jìn)一步證明紅藻的藻膽體遠(yuǎn)比藍(lán)藻要復(fù)雜．PBS中各藻膽蛋白之間、各藻膽蛋白及其連接多肽之間、各藻膽蛋白-連接多肽復(fù)合體之間的相互作用和有序組裝方式,還需要進(jìn)一步深入研究確定．

多管藻(Polysiphoniaurceolata),屬紅藻門(Phodophyta),真紅藻綱(Florideae),仙菜目(Ceramiales)[18],是一種大型真核紅藻,主要在潮間帶的巖石上攀附生長或鹽澤地帶生長．

研究表明,多管藻中含有的藻膽蛋白有R-藻紅蛋白(R-phycoerythrin,R-PE)、R-藻藍(lán)蛋白(R-phycocyanin,R-PC)和別藻藍(lán)蛋白 3類,其中R-PE在498 nm、538 nm和567 nm處有特征吸收峰,攜帶藻紅膽素(phycoerythrobilin,PEB)和藻尿膽素(phycourobilin,PUB),紫外光下發(fā)黃色熒光[19-21];R-PC含有藻紅膽素(PEB)和藻藍(lán)膽素(phycocyanobilin,PCB),在550 nm和618 nm有特征光吸收,熒光發(fā)射峰在635～645 nm之間[22-24];AP攜帶藻藍(lán)膽素(PCB),在650 nm和620 nm分別有特征吸收峰和肩峰,熒光發(fā)射峰值在660～680 nm[25]．別藻藍(lán)蛋白可分為AP,AP-B和AP-核膜連接多肽復(fù)合體(AP-LCM) 3類,其中AP含量較多,AP-B和AP-LCM數(shù)量相等．當(dāng)用498 nm R-PE特征吸收光激發(fā)時,F670～680/F580～590可作為藻膽體結(jié)構(gòu)完整性的參照指標(biāo)[26-27],且比值越大,表明光能傳遞效率越高,結(jié)構(gòu)越完整．

從藻類樣品中提取、分離制備出結(jié)構(gòu)形態(tài)完整的藻膽體是藻膽體結(jié)構(gòu)與功能研究的重要基礎(chǔ)．到目前為止蔗糖密度梯度超速離心一直是高純度完整藻膽體有效分離制備的常用技術(shù)方法,所以本研究以多管藻為材料,在Triton X-100增溶和無Triton X-100增溶條件下利用亞超速蔗糖密度梯度離心進(jìn)行藻膽體的分離與制備,并進(jìn)一步用蔗糖密度梯度超速離心分析所得藻膽體樣品中的完整藻膽體組分;根據(jù)增溶前后的吸收和熒光光譜及F670～680/F580～590,比較表面活性劑增溶前后所得藻膽體的光譜特性差異及其結(jié)構(gòu)完整性,建立可用于有效制備帶有類囊體膜和不帶有類囊體膜的紅藻完整藻膽體的蔗糖密度梯度離心技術(shù)方法．

1 材料與方法

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)選用的多管藻是一種生活在較低溫度環(huán)境中、煙臺當(dāng)?shù)睾Ｓ蛞子诓杉暮Ｉ笮图t藻．

1.2 藻膽體的粗提取

取適量采集的多管藻瀝干水分,按照1∶1的質(zhì)量體積比加入1.0 mol/L PBS進(jìn)行研磨,樣品勻漿40 000×g,18 ℃,離心15 min,得到含有藻膽體的上清液．取部分上清液加入20% Trion X-100進(jìn)行增溶,使得溶液中Trion X-100最終體積分?jǐn)?shù)為2%,磁力攪拌過夜．將Triton X-100增溶和無Triton X-100增溶的藻膽體提取液避光于4 ℃冷藏保存,用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)．

1.3 密度梯度離心

1.3.1 亞超速蔗糖密度梯度離心 對2種藻膽體提取液進(jìn)行蔗糖密度梯度離心．分別將1.0、0.8、0.6、0.4、0.2、0.1 mol/L梯度液自下而上的鋪入容積為38 mL的離心管．將提取液注入梯度上層,95 000×g,20 ℃離心3 h,得到攜帶部分類囊體膜和無類囊體膜(Triton X-100增溶)的2種藻膽體．

1.3.2 超速蔗糖密度梯度離心 對亞超速離心制備的2種藻膽體進(jìn)一步進(jìn)行超速蔗糖密度梯度離心．38 mL的超速離心管加蓋后同樣自下而上的鋪入1.2、1.0、0.8、0.75、0.5 mol/L梯度液,最后將兩種藻膽體樣品分別加入梯度液上層,136 000×g,20 ℃離心5 h．收集不同梯度處的藻膽體樣品條帶,并進(jìn)行吸收光譜和熒光光譜分析,確定同一個樣品不同梯度帶的差別．

1.4 光譜測定

密度梯度離心后收集的樣品條帶利用紫外可見分光光度計(jì)(UV-190型,北京普析)以該梯度處的蔗糖溶液為空白對照,測定樣品在250～750 nm的吸收光譜．

將不同階段收集的藻膽體使用熒光分光光度計(jì)(PE LS-55)進(jìn)行Ex=498 nm、Ex=430 nm熒光發(fā)射光譜和Em=680 nm熒光激發(fā)光譜的測定．

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

用亞超速密度梯度離心從藻膽體提取液中分離制備藻膽體,用密度梯度超速離心分離藻膽體組分．通過吸收和熒光光譜分析,確定離心所得各梯度帶組分的藻膽蛋白組分及其藻膽體結(jié)構(gòu)完整性,對不同藻膽體組分的差異性進(jìn)行綜合分析．

2.1 亞超速蔗糖密度梯度離心

2.1.1 不同蔗糖密度梯度帶 如圖1所示,在95 000×g蔗糖密度梯度離心后,無表面活性劑增溶的藻膽體提取液被分離成3個組分(圖1(a)):在梯度液最上層蔗糖濃度為0.1 mol/L處的紅色條帶(0.1M-Band),在0.2 mol/L蔗糖梯度內(nèi)的紫色條帶(0.2M-Band)和0.8～1.0 mol/L蔗糖梯度底部的褐色條帶(0.8M-Band)．此外,在離心管的底部有少許雜質(zhì)沉淀．收集3個不同梯度條帶處的樣品并進(jìn)行吸收光譜和熒光光譜特性分析．

Triton X-100藻膽體提取液(圖1(b))離心后只有2個組分:位于最上層蔗糖濃度0.1 mol/L處的紅色條帶(0.1M-Triton-Band)和位于0.2 mol/L蔗糖梯度內(nèi)的紫色條帶(0.2M-Triton-Band),且分層更明顯尤其是0.2 mol/L蔗糖梯度內(nèi)的紫色條帶無彌散現(xiàn)象．這與Triton X-100促進(jìn)了疏水性成分的有效溶解有關(guān)．

2.1.2 0.1 mol/L蔗糖密度梯度帶 圖2給出的是0.1M-Band和0.1M-Trit-Band紅色樣品的吸收光譜．2個樣品在498 nm、539 nm、567 nm處有較強(qiáng)的R-PE的3個特征吸收峰,且在620 nm 處有明顯的R-PC的吸收峰(0.1M-Band)或肩峰(0.1M-Trit-Band),兩者在650 nm處的吸收較弱且均沒有表現(xiàn)出吸收峰或肩峰,但這并不能排除AP的存在．2個樣品光吸收的差別主要表現(xiàn)在:(1)0.1M-Band在686 nm有一個主要來源于PSⅡ葉綠素-蛋白復(fù)合體的吸收峰,而0.1M-Trit-Band沒有,此外在580～620 nm 0.1M-Trit-Band的光吸收稍強(qiáng)于0.1M-Band;(2)與0.1M-Trit-Band相比,0.1M-Band在539 nm 及480～530 nm有稍強(qiáng)的光吸收;(3)0.1M-Band在360～460 nm的光吸收均強(qiáng)與0.1M-Trit-Band．

如圖3的熒光發(fā)射光譜所示,當(dāng)選用498 nm R-PE特征吸收光激發(fā)0.1M-Band和0.1M-Triton-Band樣品時(圖3(a)),在578 nm表現(xiàn)出一個來自R-PE的強(qiáng)熒光發(fā)射峰,同時在640 nm有一個較弱的來自R-藻藍(lán)蛋白的熒光發(fā)射肩峰,而且0.1M-Triton-Band樣品在630～660 nm的熒光均稍強(qiáng)于0.1M-Band．如圖3(b)所示,當(dāng)選用葉綠素a (Chl a)的特征吸收430 nm光激發(fā)時,除共有的579 nm主峰外,兩者熒光發(fā)射譜的差別主要表現(xiàn)在625～725 nm之間,如0.1M-Triton-Band在638 nm和673 nm有略強(qiáng)的與R-藻藍(lán)蛋白、別藻藍(lán)蛋白及Chl a相關(guān)的熒光,而0.1M-Band在700～720 nm有相對略強(qiáng)的來自光反應(yīng)系統(tǒng)(PSⅡ/PSⅠ)Chl a-蛋白復(fù)合物的熒光．

綜合吸收光譜和熒光光譜特性,0.1M-Band和0.1M-Trit-Band樣品中主要含有R-PE和R-PC,0.1M-Trit-Band樣品中含有一些游離的Chl a,而沒表面活性增溶的0.1M-Band含有少量Chl a-蛋白復(fù)合物．此外,熒光發(fā)射譜(圖3a)中640 nm處的肩峰表明在0.1M-Band和0.1M-Trit-Band中含有R-PE和R-PC的復(fù)合物(R-PE-R-PC復(fù)合物),因?yàn)橛?98 nm 激發(fā)R-PE時有光能傳遞給R-PC,發(fā)出約640 nm的R-PC特征熒光．0.1M-Trit-Band樣品640 nm處熒光更強(qiáng)表明應(yīng)含有較多R-PE-R-PC復(fù)合體．

2.1.3 0.2 mol/L蔗糖密度梯度帶 如圖4吸收光譜所示,0.2 mol/L蔗糖梯度帶無表面活性劑增溶(0.2M-Band)和Triton X-100增溶(0.2M-Triton-Band)2種紫色樣品,在450～600 nm均有較強(qiáng)的R-PE特征光吸收,但0.2M-Triton-Band在499 nm和540 nm處的吸收略大于0.2M-Band及解離藻膽體樣品．同樣,3個樣品在600～660 nm 之間均表現(xiàn)出R-PC 620 nm和別藻藍(lán)蛋白～650 nm的吸收,而且0.2M-Triton-Band的吸收稍強(qiáng)于0.2M-Band和解離藻膽體,此外0.2M-Band和0.2M-Triton-Band有相似的吸收光譜線形而且均強(qiáng)于解離藻膽體.與0.2M-Triton-Band不同,0.2M-Band在686 nm 有一個明顯且相對較強(qiáng)的吸收峰,這一吸收應(yīng)主要源于PSⅡ/PSⅠ的Chl a-蛋白復(fù)合物,因?yàn)闊o表面活性劑增溶制備的樣品會含有部分與藻膽體相連的PSⅡ/PSⅠChl a-蛋白復(fù)合物．相比之下,顯然用Triton X-100增溶制備的0.2M-Triton-Band樣品中基本不含Chl a-蛋白復(fù)合物．

圖5是0.2M-Band、0.2M-Triton-Band和解離藻膽體的熒光發(fā)射光譜．在498 nm激發(fā)時(圖5(a)),0.2M-Band和0.2M-Triton-Band分別在674 nm和670 nm有強(qiáng)熒光發(fā)射峰,在589 nm和579 nm有弱熒光發(fā)射峰,且F674/F589和F670/F579大于3．與此相反,解離藻膽體主峰在578 nm,此外僅在約640 nm有弱的肩峰．這一結(jié)果表明,亞超速蔗糖密度梯度離心制備的0.2M-Band和0.2M-Triton-Band樣品是完整藻膽體,674 nm和670 nm的熒光發(fā)射峰來自于藻膽體中的末端熒光發(fā)射體AP-LCM和AP-B,而589 nm和579 nm的弱峰來自于R-PE,表明激發(fā)R-PE的498 nm光可以高效傳遞到藻膽體的末端熒光發(fā)射體AP-LCM和AP-B,但在解離藻膽體中(圖5(a)中的點(diǎn)線)沒有這種光能傳遞．

如圖5(b)所示,430 nm Chl a特征吸收激發(fā)時3個樣品的熒光發(fā)射光譜與圖5(a)相似,也表現(xiàn)出完整藻膽體的熒光發(fā)射光譜特征,但與0.2M-Triton-Band相比0.2M-Band在700～ 800 nm有相對較強(qiáng)的熒光發(fā)射,而且在約720 nm表現(xiàn)出可分辨的肩峰,表明0.2M-Band樣品含有來自PSⅡ/PSⅠ的Chl a-蛋白復(fù)合物．

0.2M-Band和0.2M-Triton-Band的光譜特性表明:(1)兩者具有非常相似的藻膽蛋白組成(圖4);(2)686 nm的吸收峰 (圖4)和700～800 nm的熒光(圖5(b))證明,兩者的主要不同在于0.2M-Band的藻膽體帶有部分類囊體膜PSⅡ/PSⅠ的Chl a-蛋白復(fù)合物,而Triton X-100 增溶處理的0.2M-Triton-Band藻膽體已不帶有PSⅡ/PSⅠ的Chl a-蛋白復(fù)合物;(3)大于3的F674/F589和F670/F579(圖5(a)) 或F674/F591和F674/F582(圖5(b))熒光比值證明,兩者在所含各藻膽蛋白組分之間有非常高效的光能傳遞,因此兩者均為95 000×g亞超速蔗糖密度梯度離心制備的完整藻膽體,但0.2M-Band的藻膽體帶有與其相結(jié)合的類囊體膜PSⅡ/PSⅠ組分而0.2M-Triton-Band不帶．

2.1.4 0.8～1.0 mol/L蔗糖密度梯度帶 位于0.8～1.0mol/L 蔗糖梯度帶的黃褐色樣品(0.8M-Band)僅出現(xiàn)在無表面活性劑增溶處理的藻膽體提取液中(圖1)．0.8M-Band的吸收光譜表現(xiàn)出較強(qiáng)的R-PE(470～600 nm)和R-PC與AP(610～650 nm)的特征光吸收(圖6虛線),680 nm的弱吸收峰主要來自PSⅡ/PSⅡ的Chl a-蛋白復(fù)合物,此外在250～450 nm有很強(qiáng)的光吸收．熒光激發(fā)光譜 (圖6實(shí)線)顯示,680 nm的熒光主要來自R-PE(500～565 nm)、R-PC和AP(615～650 nm),而位于約413 nm的激發(fā)峰證明Chl a對680 nm的熒光有貢獻(xiàn)．吸收光譜中498 nm處的特征吸收峰值最大但是對680 nm處的熒光貢獻(xiàn)較小,說明該條帶中藻紅蛋白498 nm的發(fā)色團(tuán)吸收的光能傳遞給末發(fā)射體的效率較低．

圖7是0.8M-Band樣品在498 nm和430 nm光激發(fā)時的熒光發(fā)射光譜．498 nm激發(fā)時有2個熒光發(fā)射峰(圖7實(shí)線),580 nm的熒光來自R-PE而670 nm的熒光主要來自PBS中的末端發(fā)射體AP-LCM和AP-B．這一結(jié)果表明,在0.8M-Band中有R-PE經(jīng)R-PC和AP向AP-LCM與AP-B的光能傳遞,但因F670/F580小于1其光能傳遞效率不高,因此該樣品中含有結(jié)構(gòu)不完整的部分解離藻膽體組分．用430 nm Chl a藍(lán)光區(qū)特征吸收光激發(fā)時,0.8M-Band樣品的熒光發(fā)射主峰位于682 nm且在約714 nm有可分辨的肩峰,兩者應(yīng)主要來自PSⅡ和PSⅠ的Chl a-蛋白復(fù)合物;位于578 nm的弱熒光發(fā)射峰應(yīng)來自于所含有的藻膽體R-PE．

根據(jù)光譜特性(圖6和圖7),0.8M-Band樣品含有藻膽體藻膽蛋白和類囊體膜PSⅡ和PSⅠ的Chl a-蛋白復(fù)合物．因F670/F580小于1(圖7實(shí)線),0.8M-Band樣品所含藻膽體內(nèi)的光能傳遞效率不高,其有部分解離或結(jié)構(gòu)不完整．498 nm (圖7實(shí)線)和430 nm (圖7虛線)光激發(fā)時的熒光發(fā)射光譜在670～700 nm之間有較大重疊,這證明0.8M-Band樣品中的藻膽體(或藻膽蛋白)與PSⅡ和PSⅠ的Chl a-蛋白復(fù)合物有一定程度的光能傳遞,表明兩者之間有結(jié)合或有著密切的結(jié)構(gòu)聯(lián)系．

2.2 超速蔗糖密度梯度離心

2.2.1 藻膽體的不同梯度帶組分 亞超速密度梯度離心制備出的位于0.2 mol/L蔗糖密度帶(0.2M-Band和0.2M-Triton-Band)的2種完整藻膽體樣品(圖1),一種是無Triton X-100增溶制備的攜帶(或含有)部分類囊體膜的藻膽體(the phycobilisome carrying (or containing) thylakoid membranes,TM-PBSs) (圖1(a) 0.2M-Band),另一種是經(jīng)Triton X-100增溶后制備的不帶(或不含)類囊體膜的藻膽體(the phycobilisome carrying (or containing) no thylakoid membrane,NTM-PBS) (圖1(b) 0.2M-Triton-Band)．

如圖8所示,在超速離心后2種PBS樣品TM-PBSs (圖8(a))和NTM-PBSs (圖8(b))被分離成位于相同蔗糖梯度液層(sucrose gradient layer,L)的4個紫紅色PBS組分,分別是0.8 mol/L PBS (PBS in 0.8 mol/L layer,PBS 0.8L)、1.0 mol/L PBS (PBS in 1.0 mol/L layer,PBS 1.0L)、1.2 mol/L PBS (PBS in 1.2 mol/L layer,PBS 1.2L)和1.2 mol/L管底PBS (PBS in 1.2 mol/L layer on the bottom,PBS 1.2B)．

在相同條件下,對收集到的1.0 mol/L梯度藻膽體 (TM-PBS 1.0L與NTM-PBS 1.0L)和1.2 mol/L管底藻膽體 (TM-PBS 1.2B與NTM-PBS 1.2B)再做一次超速離心,結(jié)果如圖9所示,這2類樣品均分離成2種組分,分別位于0.8 mol/L和1.2 mol/L 梯度層．這一結(jié)果表明,位于1.0 mol/L梯度和1.2 mol/L 管底的藻膽體,即TM-PBS 1.0 L與NTM-PBS 1.0 L和TM-PBS 1.2B與NTM-PBS 1.2B是2種不能穩(wěn)定存在的藻膽體,而位于0.8 mol/L的藻膽體(TM-PBS 0.8L與NTM-PBS 0.8L)和1.2 mol/L的藻膽體(TM-PBS 1.2L與NTM-PBS 1.2L)則是密度或大小不同且結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的2種藻膽體．

2.2.2 不同梯度帶藻膽體組分的光譜特性 圖10是帶類囊體膜藻膽體TM-PBSs中,4個超速離心組分的吸收光譜．從吸收光譜可以看出,除了R-PE、R-PC和AP的特征吸收外,4個組分都有685 nm Chl a-蛋白復(fù)合物的特征光吸收,A685從大到小依次為TM-PBS 1.0L、TM-PBS 1.2L、TM-PBS 1.2B和TM-PBS 0.8L,此外主要與Chl相關(guān)的～379 nm光吸收也有相同的大小順序．在498 nm TM-PBS 0.8L的峰值最低,表明其含有相對最低的R-PE,但其在620 nm和650 nm的較低光吸收應(yīng)主要與含有相對較低的Chl a-蛋白復(fù)合物有關(guān)．

與帶類囊體膜藻膽體TM-PBSs相比,不帶類囊體膜的藻膽體NTM-PBSs (圖11) 的4個組分均沒有685 nm Chl a-蛋白復(fù)合物的光吸收,但在300～400 nm處的光吸收差別較大且應(yīng)與Chl a無關(guān)．498 nm的光吸收差別表明,NTM-PBS 1.0 L有相對最高的R-PE含量,其次是NTM-PBS 1.2L和 NTM-PBS 1.2B,最低的是NTM-PBS 0.8L,620 nm和650 nm的光吸收有相似的特征．

如圖12和13所示,在498 nm R-PE特征吸收激發(fā)時,TM-PBS和NTM-PBS的4個藻膽體組分具有非常相似的熒光發(fā)射光譜:在670 nm有一個來自藻膽體末端發(fā)射體(AP-LCM和AP-B)的強(qiáng)熒光峰 (F670),在578 nm有一個來自R-PE的較弱的熒光峰(F578),而且F578的強(qiáng)弱與各組分在498 nm的光吸收(A498)的大小相一致(圖10、11)．F670強(qiáng)F578弱證明,在這4個組分的藻膽體中R-藻紅蛋白所吸收的光能可有效傳遞到末端發(fā)射體AP-LCM和AP-B,F670/F578比值最大的TM-PBS 0.8L和NTM-PBS 0.8L藻膽體組分光能傳遞效率最高,F670/F578比值最小的TM-PBS 1.0L和NTM-PBS 1.0L組分光能傳遞效率相對最低,而TM-PBS 1.2L與NTM-PBS 1.2L和TM-PBS 1.2B與NTM-PBS 1.2B藻膽體的光能傳遞效率介于上兩者之間．

選用430 nm Chl a特征吸收作激發(fā)光時,TM-PBS各組分的熒光發(fā)射光譜的主峰位于670～672 nm,次峰在578 nm (圖14);NTM-PBS各組分的熒光發(fā)射主峰在670～671 nm,次峰在578 nm(圖15)．由此可見,430 nm激發(fā)時TM-PBS和NTM-PBS的各組分表現(xiàn)出的仍然是與圖12和圖13相似的藻膽體的熒光發(fā)射光譜特征,而且含有類囊體膜Chl a-蛋白復(fù)合物吸收的TM-PBS藻膽體各組分在690～730 nm之間也沒有表現(xiàn)出明顯可見的熒光發(fā)射峰或肩峰(圖14)．此外,圖14和圖15中～ 501 nm處的弱熒光應(yīng)來自于Chl a和藻膽蛋白之外的未知成分,有待進(jìn)一步研究確定．

雖然在熒光發(fā)射光譜上含類囊體膜藻膽體TM-PBS組分沒有表現(xiàn)出明顯的Chl a-蛋白復(fù)合物的特征熒光峰或肩峰(圖14),但是如圖16所示,在430 nm激發(fā)時TM-PBS 0.8L與NTM-PBS 0.8L(圖16(a))和TM-PBS 1.2L與NTM-PBS 1.2L (圖16(b))的熒光差光譜中,在670～740 nm之間有明顯的熒光強(qiáng)度差別,且在約700 nm處均有一個差光譜峰．這種差異表明,不用表面活性劑增溶制備的藻膽體TM-PBS組分,如TM-PBS 0.8L和TM-PBS 1.2L,含有來自PSⅡ/PSⅠ的Chl a-蛋白復(fù)合物．

2.2.3 不同藻膽體組分的差異性 亞超速密度梯度離心制備出的2種藻膽體樣品TM-PBSs (圖1(a) 0.2M-Band)和NTM-PBSs (圖1(b) 0.2M-Triton-Band),在498 nm R-PE特征吸收激發(fā)時,670 nm處藻膽體末端發(fā)射體(AP-LCM和AP-B)的強(qiáng)熒光峰 (F670)與578 nm處來自R-PE弱熒光峰(F578) 的相對強(qiáng)度比值大于3,根據(jù)路榮昭等提出的鑒別藻膽體完整性的指標(biāo),說明用本方法制備的0.2 mol/L梯度帶紫色樣品屬于完整藻膽體,且藻膽體0.2M-Band的吸收值A(chǔ)498/A618、A498/A650大于藻膽體0.2M-Triton-Band (表1)．

表1 不同梯度帶藻膽體組分的光譜特性比較Tab.1 The spectral property comparison of the phycobilisome components from the different gradient layers

在超速離心后2種藻膽體樣品被分離成位于相同蔗糖梯度層的4個紫紅色藻膽體組分(PBS 0.8L、PBS 1.0L、PBS 1.2L、PBS 1.2B)．通過對比發(fā)現(xiàn)(表1),與TM-PBSs相比NTM-PBSs樣品A498/A618和A498/A650的比值明顯較大,可能是不加表面活性劑的樣品中葉綠素對618 nm,650 nm處的吸收值有貢獻(xiàn),造成618 nm,650 nm處的吸收值偏大;用波長為498 nm的光激發(fā)時,TM-PBS 0.8L和NTM-PBS 0.8L藻膽體的F670/F578的相對最大,其次是TM-PBS 1.2L和NTM-PBS 1.2L,且F670/F578比值均大于或略小于3,而TM-PBS 1.0L、NTM-PBS 1.0L和TM-PBS 1.2B、NTM-PBS 1.2B的F670/F578比值都小于3．這進(jìn)一步說明,PBS 1.0L、PBS 1.2B是兩種不穩(wěn)定的藻膽體形式,含有解離的藻膽蛋白成分;A498/A618和A498/A650比值偏大的NTM-PBS藻膽體,其熒光強(qiáng)度比值F670/F578也相應(yīng)較?。?/p>

3 討 論

紅藻藻膽體的結(jié)構(gòu)與功能一直是紅藻,尤其是海生紅藻光合作用研究的主要內(nèi)容之一．從藻類樣品中提取、分離制備具有天然結(jié)構(gòu)狀態(tài)的藻膽體是從事藻膽體藻膽蛋白與連接多肽組成、藻膽蛋白在藻膽體中的有序組裝、藻膽體在類囊體膜上與光系統(tǒng)PSⅠ/PSⅡ的結(jié)構(gòu)聯(lián)系及其光能傳遞功能等方面研究工作的必備條件．制備具有完整天然結(jié)構(gòu)藻膽體,需要在材料破碎、藻膽體提取及其分離純化全過程避免干擾藻膽體內(nèi)部各成分之間的相互作用,從而破壞其結(jié)構(gòu)的完整性．此外,為研究藻膽體與光系統(tǒng)PSⅡ的結(jié)構(gòu)關(guān)系還需避免破壞或干擾藻膽體核-膜連接多肽的結(jié)構(gòu)及其與類囊體膜的接合狀態(tài)．為此,本研究在前人工作基礎(chǔ)上[21,28-29],選用性質(zhì)最溫和的蔗糖密度梯度離心,利用藻膽體與其他組分沉降系數(shù)的不同,在亞超速和超速離心條件下,建立了從多管藻藻膽體提取液中高效分離純化完整藻膽體的密度梯度離心的技術(shù)方法．

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,在亞超速密度梯度離心條件下(0.1～1.0 mol/L蔗糖梯度,95 000×g3 h),從多管藻藻膽體提取液和Triton X-100增溶藻膽體提取液中,分別制備出均位于0.2 mol/L密度帶(圖1)的攜帶類囊體膜藻膽體(0.2M-Band)和不含類囊體膜的藻膽體(0.2M-Triton-Band)．熒光發(fā)射光譜(圖5)及大于3的F674/F589和F670/F579比值 (表1) 所表現(xiàn)出的高效光能傳遞證明:亞超速密度梯度離心制備的2種藻膽體0.2M-Band和0.2M-Triton-Band是具有完整結(jié)構(gòu)的多管藻藻膽體．兩者的主要差別在于:0.2M-Band藻膽體在約686 nm和700～800 nm處有來自光系統(tǒng)PSⅡ/PSⅠCh a-蛋白復(fù)合物的光吸收(圖4)和熒光(圖5(b)),證明0.2M-Band藻膽體帶有與其相結(jié)合的類囊體膜PSⅡ/PSⅠ組分,而經(jīng)Triton X-100增溶處理所得到的0.2M-Triton-Band藻膽體已不含類囊體膜組分．與0.2M-Triton-Band相比,帶類囊體膜的0.2M-Band藻膽體更適用于研究類囊體內(nèi)光系統(tǒng)PSⅡ/PSⅠ與藻膽體之間結(jié)構(gòu)聯(lián)系及相互作用關(guān)系．

蔗糖密度梯度超速離心(0.5～1.2 mol/L蔗糖梯度,136 000×g5 h)后,亞超速離心所得藻膽體0.2M-Band和0.2M-Triton-Band 均被分離成位于相同梯度層的4個組分(圖8),其中熒光比值F670/F578大于3(圖12—圖15,表1)的TM-PBS 0.8L和NTM-PBS 0.8L、TM-PBS 1.2L和NTM-PBS 1.2L是結(jié)構(gòu)相對穩(wěn)定的完整藻膽體,而TM-PBS 1.0L和NTM-PBS 1.0L、TM-PBS 1.2B和NTM-PBS 1.2B是可繼續(xù)分離成TM-PBS 0.8L和NTM-PBS 0.8L及TM-PBS 1.2L和NTM-PBS 1.2L的不穩(wěn)定藻膽體組分(圖9)．與含量較大的TM-PBS 0.8L和NTM-PBS 0.8L相比,含量較低、密度較大的TM-PBS 1.2L和NTM-PBS 1.2L應(yīng)為前兩者的部分復(fù)合物．TM-PBS和NTM-PBS 2類藻膽體的主要差別仍然主要表現(xiàn)在,前者含有來自PSⅡ/PSⅠ的Chl a-蛋白復(fù)合物,而后者不含Chl a-蛋白復(fù)合物 (圖11、12和16)．

與常用的超速密度梯度離心方法相比,本研究以海生大型紅藻多管藻為材料所建立的亞超速密度梯度離心方法不僅降低了儀器設(shè)備的使用成本,而且大大縮短了離心時間,有效提高了藻膽體的制備效率．本實(shí)驗(yàn)在無表面活性劑增溶條件下所分離制備的含有類囊體膜組分的藻膽體,如0.2M-Band及TM-PBS 0.8L和TM-PBS 1.2L,不僅可用于藻膽體藻膽蛋白組成、藻膽體有序組裝及光能傳遞研究,而且更適合用于研究藻膽體與光系統(tǒng)PSⅡ/PSⅠ結(jié)構(gòu)聯(lián)系及其相互作用關(guān)系．此外,將亞超速蔗糖密度梯度離心制備多管藻完整藻膽體及超速蔗糖密度梯度離心分離純化藻膽體不同梯度帶組分的技術(shù)方法,用于海生大型紅藻江蘺的藻膽體制備與分析也得到了相同的實(shí)驗(yàn)結(jié)果,表明該技術(shù)方法還可拓展用于其他大型紅藻藻膽體的制備與組分分析．綜上所述,本研究所建立的海生大型紅藻完整藻膽體的分離制備與分析技術(shù)方法,可為海生紅藻藻膽體結(jié)構(gòu)與功能研究提供有力的技術(shù)支持．