王麗瑩,李丹娜,宗明月,張慶然,陳麗霞,趙 烽

(1.煙臺大學(xué)新型制劑與生物技術(shù)藥物研究山東省高校協(xié)同創(chuàng)新中心、分子藥理和藥物評價教育部重點實驗室(煙臺大學(xué)),山東 煙臺264005;2.沈陽藥科大學(xué)中藥學(xué)院,遼寧 沈陽 110016)

炎癥是機(jī)體對于刺激的一種防御反應(yīng),過度炎癥能進(jìn)一步誘發(fā)多種相關(guān)疾病的發(fā)生,包括心血管疾病、癌癥和自身免疫性疾病等[1].苦蘵(Physalisangulata)屬于茄科酸漿屬植物[2],現(xiàn)代藥理學(xué)表明其有抗炎、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)等活性.睡茄交酯類化合物是該植物的主要成分,文獻(xiàn)表明睡茄交酯具有抗炎[3]、抗腫瘤[4]、免疫調(diào)節(jié)[5]和抗寄生蟲活性[6]等作用.Physagulin H(圖1)是一種從苦蘵中分離出來的典型的睡茄交酯類成分[3],在已發(fā)表的研究中顯示physagulin H具有抑制短膜蟲和錐蟲的活性[7],但至今沒有有關(guān)physagulin H的抗炎活性的報道.基于苦蘵的傳統(tǒng)應(yīng)用,本研究利用LPS誘導(dǎo)RAW 264.7細(xì)胞體外炎癥模型,檢測了physagulin H對LPS誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞 RAW 264.7釋放炎癥介質(zhì)NO、PGE2以及炎癥因子TNF-α 的抑制作用,對iNOS、COX-2蛋白表達(dá)的影響以及對IκB-α蛋白降解的抑制作用,對MAPKs信號通路中ERK、JNK和p38蛋白磷酸化水平的影響,旨在探討physagulin H的抗炎活性及其抗炎分子機(jī)制.

圖1 Physagulin H結(jié)構(gòu)式Fig.1 The structure of physagulin H

1 材料和方法

1.1 化學(xué)品和試劑

Physagulin H由沈陽藥科大學(xué)提供(HPLC≥98%),在100%細(xì)胞培養(yǎng)級二甲基亞砜(DMSO)中制備50 mmol/L溶液,胎牛血清(FBS)和RPMI 1640培養(yǎng)基購自Invitrogen(Thermo Fisher Scientific,Inc.,USA);MTT、DMSO、LPS購自Sigma-Aldrich(St.Louis,MO,USA);細(xì)胞核蛋白/漿蛋白抽提試劑盒、一氧化氮測定試劑盒、小鼠TNF-α ELISA試劑盒購自煙臺賽爾斯生物技術(shù)有限公司;小鼠PGE2ELISA試劑盒購自上海森雄科技有限公司;Anti-rabbit iNOS、COX-2 polyclonal antibody購自 Cayman公司;goat anti-rabbit p-ERK1/2、p-JNK、p-p38 polyclonal antibody購自Affinity公司;goat anti-rabbit IκB-α polyclonal antibody和β-actin抗體購自Santa Cruz Biotechnology,Inc;氫化可的松琥珀酸鈉注射液 (HSS)為煙臺東誠北方制藥有限公司產(chǎn)品;CKX31 型倒置顯微鏡(菲律賓奧林巴士公司);3111 型恒溫二氧化碳培養(yǎng)箱(美國 Thermo 公司);5810R臺式高速大容量冷凍離心機(jī)(Eppendorf 公司);SYNERGY HT型酶標(biāo)儀(美國,BIO-TEC 公司).

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

RAW 264.7細(xì)胞用含有10%熱滅活的胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基在37 ℃下含量為95%的空氣和5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng),每2 d常規(guī)更換培養(yǎng)基,胰酶消化傳代.

1.3 分組及藥物處理

將RAW 264.7細(xì)胞以1×106個/mL的密度在96孔板中培養(yǎng).孵育1 h后,將96孔板中的細(xì)胞分為空白組、陽性對照組、LPS組、給藥組,每個給藥濃度設(shè)3個平行復(fù)孔.空白組每孔分別加入0.4 μL DMSO,LPS組和給藥組每孔加入2 μL的LPS(終濃度為1 μg/mL),陽性對照組每孔加2 μL LPS和0.4 μL氫化可的松琥珀酸鈉注射液(HSS,終濃度為100 μmol/L),給藥組每孔加入0.4 μL physagulin H(終濃度為1.562 5,3.125,6.25和12.5 μmol/L).

1.4 MTT法評價藥物的細(xì)胞毒性

將RAW 264.7細(xì)胞以1×106個/mL的密度在96孔板中培養(yǎng),孵育1 h后加入0.4 μL physagulin H(終濃度為1.562 5,3.125,6.25,12.5,25,50和100 μmol/L),對照組加入等量的DMSO.繼續(xù)孵育24 h后,加入8 μL MTT(終濃度為200 μg/mL),再孵育4 h,棄去上清,加入150 μL DMSO以溶解甲臜.以630 nm為參比波長,用酶標(biāo)儀測定570 nm處的吸光度(A570).細(xì)胞存活率=(實驗組A570/對照組A570)×100%.

1.5 Griess法測定NO濃度

按“1.3”的方法分組處理細(xì)胞,孵育24 h,吸取100 μL/孔細(xì)胞上清液于酶標(biāo)板中,同時加入預(yù)先配制的Griess試劑(由A、B等量混合,100 μL/孔),搖床上低速振搖10 min,540 nm處測量吸光度,使用從亞硝酸鈉獲得的標(biāo)準(zhǔn)曲線計算細(xì)胞培養(yǎng)上清液中亞硝酸鹽的濃度.

1.6 ELISA法測定PGE2和TNF-α濃度

按“1.3”的方法分組處理細(xì)胞,孵育24 h和6 h后吸取100 μL/孔上清液,分別按照小鼠PGE2ELISA試劑盒和小鼠TNF-α ELISA試劑盒說明書,檢測PGE2和TNF-α的水平.

1.7 Western Blot法檢測iNOS,COX-2,IκB-α,p-ERK,p-JNK和p-p38蛋白水平

1.7.1 蛋白提取及定量 將RAW 264.7細(xì)胞以1×106個/mL的密度接種3 mL于60×15 mm培養(yǎng)皿中,培養(yǎng)1 h待細(xì)胞貼壁后,將其分為空白組、LPS組和給藥組.空白組加入6 μL的DMSO,LPS組加入30 μL的LPS(終濃度為1 μg/mL),給藥組加入30 μL的LPS和6 μL的physagulin H(終濃度分別為1.562 5、3.125、6.25和12.5 μmol/L),繼續(xù)培養(yǎng)24 h后提取總蛋白用于檢測iNOS和COX-2的水平.

同上分組給藥并LPS刺激10 min后提取總蛋白用于檢測IκB-α的水平,LPS刺激15 min后提取總蛋白用于檢測p-JNK的水平,LPS刺激1 h后提取總蛋白用于檢測p-ERK和p-p38的水平.收集細(xì)胞,按照細(xì)胞核蛋白/漿蛋白抽提試劑盒說明書操作提取各蛋白,按BCA定量試劑盒說明書進(jìn)行定量.恒定蛋白上樣的質(zhì)量為30 μg,加入5倍體積的loading buffer,使各組樣品蛋白濃度一致,100 ℃,5 min煮沸變性.

1.7.2 蛋白質(zhì)印跡分析 根據(jù) SDS-PAGE 凝膠配制試劑盒說明書配制相應(yīng)的分離膠與濃縮膠:iNOS(分子質(zhì)量:130 kU),COX-2 (分子質(zhì)量:72 kU)使用8%分離膠,5%的濃縮膠;p-JNK(分子質(zhì)量:46,54 kU),p-ERK(分子質(zhì)量:42,44 kU),p-p38(分子質(zhì)量:43 kU)使用10%的分離膠,5%的濃縮膠;IκB-α(分子質(zhì)量:36 kU),使用12%的分離膠,5%的濃縮膠.取 30 μg 總蛋白樣品進(jìn)行電泳,轉(zhuǎn)膜,膜與5%的脫脂奶粉置于脫色搖床室溫下封閉4 h.用TBS-T洗滌3次,每次10 min,將膜在相應(yīng)的一抗溶液(iNOS,COX-2,p-ERK1/2,p-JNK,p-p38,IκB-α,β-actin)中于4 ℃孵育過夜.TBS-T洗膜3次,每次10 min,加入二抗37 ℃溫育1 h.洗膜3次并加入 ECL 發(fā)光顯色液,放入暗盒中,壓片,顯影定影,收集圖像并使用軟件Image J分析條帶的灰度值,用目的蛋白的灰度值/β-actin的灰度值(%)或磷酸化蛋白的灰度值/非磷酸化蛋白的灰度值(%)來量化目的蛋白的表達(dá)情況.

1.8 統(tǒng)計分析

2 實驗結(jié)果

2.1 Physagulin H對RAW 264.7細(xì)胞存活的影響

當(dāng)細(xì)胞存活率<50%時,顯示強(qiáng)毒性;細(xì)胞存活率在50%～70%時,顯示中等毒性;細(xì)胞存活率在70%～90%時,顯示弱毒性;細(xì)胞存活率>90%時,無明顯毒性.如圖2所示,在physagulin H低于12.5 μmol/L的濃度處理下,細(xì)胞存活率均大于90%,故physagulin H在低于12.5 μmol/L濃度時對RAW 264.7細(xì)胞的增殖沒有明顯細(xì)胞毒性.

圖2 Physagulin H對RAW 264.7細(xì)胞增殖的影響Fig.2 Effect of physagulin H on the proliferation of RAW 264.7 cells

2.2 Physagulin H對LPS誘導(dǎo)的NO,PGE2和TNF-α 釋放的影響

如圖3所示,physagulin H在1.562 5～12.5 μmol/L范圍內(nèi)顯著抑制LPS誘導(dǎo)的NO和PGE2的過量產(chǎn)生并呈劑量依賴關(guān)系(**P<0.01)(圖3(a),(b)).同時,在濃度為3.125 μmol/L時,physagulin H對NO的抑制率與陽性藥物相當(dāng).這些結(jié)果表明,與陽性藥物HSS相比,physagulin H對NO過量產(chǎn)生可能具有更好的抑制作用.TNF-α實驗結(jié)果表明,physagulin H在3.125～12.5 μmol/L范圍內(nèi)對LPS誘導(dǎo)的TNF-α的產(chǎn)生具有顯著的抑制活性和良好的劑量依賴關(guān)系(**P<0.01)(圖3(c)).

2.3 Physagulin H對iNOS和COX-2蛋白表達(dá)的影響

如圖4所示,空白組RAW 264.7細(xì)胞中僅有少量iNOS和COX-2表達(dá).經(jīng)LPS處理24 h后,iNOS和COX-2蛋白的表達(dá)顯著增加(##P<0.01),而physagulin H對iNOS和COX-2蛋白的高表達(dá)具有顯著抑制作用(**P<0.01).

與空白組相比,##P<0.01;與LPS組相比,**P<0.01.圖4 Physagulin H對LPS誘導(dǎo)的RAW 264.7細(xì)胞iNOS和COX-2蛋白高表達(dá)的影響Fig.4 Effect of physagulin H on the high expression of iNOS and COX-2 proteins in LPS-activated RAW 264.7 cells

2.4 Physagulin H對IκB-α蛋白表達(dá)的影響

如圖5所示,空白組中IκB-α蛋白表達(dá)量正常,經(jīng)LPS刺激后蛋白發(fā)生降解表達(dá)量顯著下降(##P<0.01),而physagulin H在不同濃度下對IκB-α蛋白的降解均具有顯著抑制作用(**P<0.01).

與空白組相比,##P<0.01;與LPS組相比,**P<0.01.圖5 Physagulin H對LPS誘導(dǎo)的RAW 264.7細(xì)胞IκB-α蛋白降解的影響Fig.5 Effect of physagulin H on the degradation of IκB-α protein in LPS-activated RAW 264.7 cells

2.5 Physagulin H對MAPKs信號通路激活的影響

如圖6—圖8所示,空白組細(xì)胞中MAPK蛋白主要以未磷酸化形式存在,LPS刺激后ERK、JNK、p38發(fā)生磷酸化產(chǎn)生大量p-ERK、p-JNK、p-p38蛋白(##P<0.01);與LPS組相比,physagulin H在3.125～12.5 μmol/L濃度范圍內(nèi)對LPS誘導(dǎo)RAW 264.7細(xì)胞的JNK蛋白磷酸化有抑制作用(*P<0.05,**P<0.01),而對ERK和p38蛋白磷酸化均無顯著抑制作用.

3 討 論

Physagulin H是苦蘵中的主要活性成分之一,已有研究表明physagulin H具有抗寄生蟲的活性[7],但其抗炎活性卻鮮有報道.本研究采用LPS誘導(dǎo)的RAW 264.7細(xì)胞體外炎癥模型探討了physagulin H的抗炎活性及其發(fā)揮抗炎作用的分子機(jī)制.

巨噬細(xì)胞在抗炎過程中扮演著重要的角色,而LPS是一種炎癥激活劑,經(jīng)LPS刺激后,RAW 264.7細(xì)胞可引發(fā)炎癥介質(zhì)以及炎癥因子如NO,PGE2,TNF-α等的分泌[8-9].NO是一種由iNOS產(chǎn)生的重要炎癥介質(zhì),PGE2的產(chǎn)生主要受COX-2的調(diào)節(jié)[10].炎癥發(fā)生時TNF-α大量表達(dá),進(jìn)一步作用于其相應(yīng)的受體,促進(jìn)NF-κB的持續(xù)激活[11].NF-κB和MAPK信號傳導(dǎo)通路被認(rèn)為是調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)和過程的2條經(jīng)典通路,這2條信號通路的激活將引起炎癥因子的釋放,從而調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激反應(yīng)并加速炎癥反應(yīng)[12].當(dāng)細(xì)胞靜息時,NF-κB和抑制蛋白IκB-α結(jié)合成無活性形式游離在胞漿中,NF-κB蛋白序列上的核定位信號被IκB-α掩蓋.當(dāng)細(xì)胞受到刺激時,IκB激酶被激活,從而導(dǎo)致IκB蛋白磷酸化和泛素化,引起IκB-α蛋白發(fā)生降解,NF-κB二聚體p65和p50得到釋放,釋放的p65轉(zhuǎn)位到細(xì)胞核,與細(xì)胞核中目的基因結(jié)合,促進(jìn)目的基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá),產(chǎn)生炎癥反應(yīng)[13].MAPKs包括細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶(ERKs)和2種應(yīng)激激活蛋白激酶(SAPKs)家族,c-jun N末端激酶(JNK)和p38[14].大量文獻(xiàn)表明,LPS是MAPKs途徑中ERK,JNK和p38信號通路的重要激活劑,其進(jìn)一步促進(jìn)炎性因子的產(chǎn)生和炎性蛋白的表達(dá)[15].調(diào)控以上炎癥信號通路并抑制炎癥因子的過量產(chǎn)生已成為抗炎藥物的重要機(jī)制.

與空白組相比,##P<0.01;與LPS組相比,*P<0.05,**P<0.01.圖6 Physgulin H對LPS誘導(dǎo)的RAW 264.7細(xì)胞中MAPKs通路JNK蛋白磷酸化的影響Fig.6 Effect of physagulin H on the phosphorylation of JNK protein of the MAPKs pathway in LPS-activated RAW 264.7 cells

與空白組相比,##P<0.01;與LPS組相比,*P<0.05,**P<0.01.圖7 Physgulin H對LPS誘導(dǎo)的RAW 264.7細(xì)胞中MAPKs通路ERK蛋白磷酸化的影響Fig.7 Effect of physagulin H on the phosphorylation of ERK protein of the MAPKs pathway in LPS-activated RAW 264.7 cells

與空白組相比,##P<0.01;與LPS組相比,*P<0.05,**P<0.01.圖8 Physgulin H對LPS誘導(dǎo)的RAW 264.7細(xì)胞中MAPKs通路p38蛋白磷酸化的影響Fig.8 Effect of physagulin H on the phosphorylation of p38 protein of the MAPKs pathway in LPS-activated RAW 264.7 cells

本研究結(jié)果表明,physagulin H可抑制NO,PGE2和TNF-α的釋放,同時,physagulin H還下調(diào)iNOS和COX-2蛋白的表達(dá),這些發(fā)現(xiàn)表明,physagulin H可以通過抑制iNOS和COX-2的產(chǎn)生發(fā)揮抗炎作用.進(jìn)一步研究表明,physagulin H對IκB-α的降解具有顯著抑制作用,而physagulin H僅對MAPK信號通路中JNK 蛋白磷酸化有抑制作用.表明physagulin H可能通過抑制JNK/MAPKs信號通路的激活,抑制炎癥蛋白的表達(dá),進(jìn)而影響炎癥因子的釋放.綜上所述,physagulin H是通過阻斷LPS誘導(dǎo)的小鼠巨噬細(xì)胞中JNK/MAPKs和NF-κB信號傳導(dǎo)途徑的激活而發(fā)揮抗炎作用.結(jié)果表明,physagulin H在治療炎性疾病方面是一個有價值的天然化合物,這為指導(dǎo)苦蘵及其相關(guān)制劑在臨床上的應(yīng)用提供了理論依據(jù).本研究從體外實驗觀察了physagulin H的抗炎活性,要進(jìn)一步確證physagulin H的抗炎作用及分子靶點,還需要進(jìn)行體內(nèi)實驗等更深入的研究.