申田宇，陳力力，劉 焱，劉 金，陳 歡，張立釗，蔣立文

(1.湖南農(nóng)業(yè)大學食品科技學院， 長沙 410128； 2.食品科技和生物技術(shù)湖南省重點實驗室， 長沙 410128；3.湖南省發(fā)酵食品工程技術(shù)研究中心， 長沙 410128)

雞蛋的腐敗過程十分復雜，是微生物、環(huán)境因素和雞蛋本身特性三者互為條件發(fā)生綜合作用的結(jié)果，其中起主要作用的是不同種類的微生物。正常健康母雞剛產(chǎn)下的蛋，其內(nèi)容物中很少有微生物存在，這是因為蛋殼外表層有一種由輸卵管腺體分泌的透明黏質(zhì)蛋白質(zhì)形成的以白堊有機物或香脂類為主的無機物保護膜，具有防止水分喪失和細菌侵襲的能力[1]；但是這種保護功能隨著雞蛋貯存時間的延長和環(huán)境因素影響而逐漸下降，導致附著在蛋殼表面的細菌通過水平感染途徑侵入蛋內(nèi)得到繁殖。在雞蛋貯藏過程中，尤其是未經(jīng)過清洗、消毒等潔蛋處理的新鮮雞蛋，由于環(huán)境氣候、雞蛋營養(yǎng)物質(zhì)豐富等因素的影響，非致病性腐敗細菌如腸桿菌(Enterobacteriaceae)、腸球菌(Enterococcus)、假單胞菌(Pseudomonas)、芽孢桿菌(Bacillus)等從蛋殼表面侵入并大量繁殖，從而造成雞蛋腐敗變質(zhì)[2]。在此過程中，各種腐敗菌競爭能力與代謝特征的差異會造成雞蛋腐敗的時間和特征不同，對雞蛋品質(zhì)的影響也不同。如濃厚蛋白減少逐漸轉(zhuǎn)化為稀蛋白，出現(xiàn)蛋白液化；蛋黃膜失去彈性而破裂,蛋清和蛋黃混合；蛋液混濁不清,稀薄。在發(fā)生組織狀態(tài)變化的同時，營養(yǎng)物質(zhì)分解并產(chǎn)生具有腐敗氣味、強烈剌激性臭味、胺類臭味的物質(zhì)。這些蛋白液化和腐敗發(fā)臭變化可以以哈夫單位、氣室高度、蛋清pH、蛋黃指數(shù)、蛋白的持水能力、揮發(fā)性鹽基氮含量等蛋品新鮮度一般理化指標來評價。對于雞蛋微生物污染的研究，人們采用傳統(tǒng)的微生物分離培養(yǎng)方法對不同來源雞蛋細菌污染情況進行調(diào)查[3-5]，而對采用非培養(yǎng)的研究手段，如高通量測序分析變質(zhì)雞蛋內(nèi)容物細菌的菌相特點以及在雞蛋內(nèi)的代謝特點報道較少。同時，人們的研究著重在引起食物中毒、對人體健康帶來危害的致病菌方面，而雞蛋主要腐敗菌及其導致雞蛋變質(zhì)的微生物過程和生物化學過程還有待進一步深入研究。

本文采用高通量測序技術(shù)，以腐敗雞蛋內(nèi)容物細菌基因組DNA為模板進行Miseq測序，研究腐敗雞蛋內(nèi)容物的細菌種群結(jié)構(gòu)和菌相變化，為進一步分離雞蛋主要腐敗菌，研究其生物學特性、致腐能力、與雞蛋品質(zhì)劣變之間的關(guān)系以及為控制雞蛋腐敗菌對雞蛋品質(zhì)的影響奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 樣品材料

變質(zhì)雞蛋為市場購買的新鮮雞蛋，經(jīng)盒裝放置實驗室室溫條件下貯存至蛋白液化或有明顯臭氣味。

1.1.2 試劑與儀器

Easy Pure Genomic DNA Kit(H30909)試劑盒、凝膠回收試劑盒及PCR擴增試劑盒(北京全式金生物技術(shù)有限公司)。

HC-1016高速離心機(安徽中科中佳科學儀器有限公司)，JY300C型通用電泳儀(上海百典儀器設(shè)備有限公司)，9700型PCR儀(愛普拜斯公司)，SW-CJ-IF凈化工作臺(上海新苗醫(yī)療機械制造有限公司)，LDZX-50KBS立式高壓蒸汽滅菌器(上海申安醫(yī)療器械廠)。

1.2 試驗方法

1.2.1 樣品細菌基因組DNA提取及PCR擴增

以室溫下貯存至變質(zhì)的雞蛋樣品為研究對象，選取蛋白液化雞蛋[哈夫單位平均(26.85±1.81)]和臭雞蛋[揮發(fā)性鹽基氮平均值為(61.13±0.40)mg/100 mL]各3枚，分別制備混合樣品J(蛋白液化雞蛋內(nèi)容物)、JC(發(fā)臭雞蛋內(nèi)容物)，即無菌操作將雞蛋內(nèi)容物倒至帶玻璃珠的滅菌三角瓶中，充分振搖備用。按照試劑盒說明書分別抽提樣品基因組DNA，利用1.0%瓊脂糖凝膠電泳及采用分光亮度計在260 nm和280 nm下測定吸光度，計算OD260/OD280比值進行DNA質(zhì)量檢測，PCR擴增反應前用Tris-HCL緩沖液將模板DNA稀釋為5 ng/μL。

根據(jù)Miseq測序區(qū)域(V4+V5)，以提取的質(zhì)量合格的DNA作為模板，采用合成帶有barcode的特異引物Primer 338F(ACTCCTACGGGAGGCAGCAG)及Primer 806R(GGACTACHVGGGTWTCTAAT)進行細菌16S rDNA PCR擴增。PCR擴增為20 μL反應體系，即5×FastPfu Buffer 4.0 μL、2.5 mmol/L dNTPs 2.0 μL、Forward Primer(5 μmol/L) 0.4 μL、Reverse Primer(5 μmol/L) 0.4 μL、FastPfu Polymerase 0.4 μL、 Template DNA 10 ng，最后補ddH2O 至 20.0 μL。PCR反應參數(shù)為：變性95 ℃、30 s，退火55 ℃、30 s，延伸72 ℃、45 s，共27個循壞。隨后采用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物。

1.2.2 Miseq測序及數(shù)據(jù)分析

我們有理由相信，民勤的這種自強不息的精神，與文化的力量緊緊相連，定會產(chǎn)生一種更加強大的創(chuàng)造力和文化自信。她連結(jié)著沙漠，連結(jié)著民勤那久遠而深厚的人文歷史；連結(jié)著智慧勤勞的民勤人民。她將會以生生不息的原動力，形成永遠佇立著的座座藝術(shù)豐碑！

將上述PCR產(chǎn)物進行切膠純化(Qiagen膠回收試劑盒)，濃度用NanoDrop 2000(Thermo Fisher Scientific Inc.USA)測定，并采用QuantiFluorTM-ST藍色熒光定量系統(tǒng)(Promega 公司)進行定量檢測，隨后，按照每個樣品的測序量要求，進行相應比例的混合和MiSeq文庫構(gòu)建，Miseq測序由上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司llumina完成。

首先根據(jù)overlap關(guān)系對Miseq測序得到的PE reads進行拼接，采用Trimmomatic、FLASH對序列質(zhì)量進行質(zhì)控和過濾，根據(jù)barcode區(qū)分樣品后，采用軟件Usearch(vsesion 7.1 http://drive5.com/uparse/)，在相似度為97%水平下，對所有序列進行操作分類單元(operational taxonominc unit, OTU)劃分聚類分析和物種分類學分析。基于OTU聚類分析結(jié)果，采用mothur軟件及菌群豐度指數(shù)計算法對OTU進行群落的物種豐度和多樣性指數(shù)分析，用于指數(shù)評估的OTU相似水平為97%，另外基于分類學信息，在不同水平上對各樣品進行群落結(jié)構(gòu)的統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品序列及取樣深度驗證

樣品總基因組DNA的1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果表明,電泳目的條帶清晰。另外，J、JC樣品的OD260/OD280分別為2.06和1.97，質(zhì)量濃度分別為51.20 ng/μL和86.70 ng/μL，濃度和純度均符合PCR擴增要求。采用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增產(chǎn)物，其目的條帶的濃度和大小合適，符合下一步核酸序列測序要求。Miseq測序J及JC樣品分別獲得42 550條、38 477條優(yōu)化序列。在OTU相似水平97%下，最終序列平均長度為450 bp左右，且測序長度上下浮動不大，說明得到的序列可以用于后續(xù)分析。從樣本中隨機抽取一定數(shù)量的序列與它們所代表的物種數(shù)目構(gòu)建稀釋曲線，其稀釋曲線逐漸趨于平坦，說明數(shù)據(jù)量越多對于發(fā)現(xiàn)新的OTU邊際會越小，可以進行下一步的數(shù)據(jù)分析。

2.2 樣品多樣性分析

2.2.1 多樣性指數(shù)分析

表1中兩樣品的覆蓋率均在99.99 %以上，覆蓋率數(shù)值越高，樣本中序列被測出的概率就越高，表明測序結(jié)果代表了樣本中微生物的真實情況。Alpha多樣性是指一個特定區(qū)域或者生態(tài)系統(tǒng)內(nèi)的生物多樣性，常用的度量標準Chao指數(shù)和Ace指數(shù)越大則表示菌群的豐度會越高，Simpson指數(shù)越小而Shannon指數(shù)越大，說明樣品中群落的多樣性會越高。由表1可知J樣品的豐度小于JC樣品，而群落多樣性高于JC樣品。

表1 J及JC樣品多樣性指數(shù)統(tǒng)計表Tab.1 Alpha-diversity statistics of J and JC

2.2.2 Venn圖分析

圖1比較直觀地表現(xiàn)了樣本相似水平為97%時OTU數(shù)目組成的相似性及重疊情況。J樣品OTU數(shù)目為13，JC樣品為17，而它們共有的OTU數(shù)目為11，重疊度較高，說明樣品雞蛋腐敗變質(zhì)表現(xiàn)形式不同(蛋白液化或雞蛋發(fā)臭)。雖然污染細菌的種類具有較大的相似性，但也存在一定的差異，具體為：在共有的OTU14[吉倫氏檸檬酸桿菌(Citrobactergillenii)]、OTU23、OTU11[沙雷氏菌(Serratia)]、OTU27、OTU3 [假單胞菌(Pseudomonas)]中，JC樣品的豐度大于J樣品，占85%以上，JC樣品另外含有少量的OTU5 [肉桿菌屬(Carnobacterium)]、OTU24 [大腸桿菌志賀氏菌屬(Escherichia-Shigella)]等，而J樣品大部分為特有的OTU10 [芽孢桿菌(Bacillus)]、OTU8、OTU9、OTU7 [肉桿菌屬(Carnobacterium)]，所占比例90%以上。

圖1 J及JC樣品OTU水平Venn圖Fig.1 Venn diagram of J and JC on OTU

2.3 樣品物種組成分析

2.3.1 門、科水平物種組成分析

如圖2所示，在科水平上兩個樣品覆蓋14個科，J樣品的芽孢桿菌科(Bacillaceae)相對豐度最大為40.13%，其次是莫拉克斯氏菌科(Moraxellaceae)為39.21%，腸桿菌科(Enterobacteriaceae)為20.20%，將平均豐度低于0.1%的部分合并為其它，則其它的豐度僅為0.16%。而JC樣品相對豐度最大的是變形菌門的腸桿菌科(Enterobacteriaceae)為86.69%，假單胞菌科(Pseudomonas)為12.54%，其它的相對豐度總和為0.13%，其中包括所占比例較大的厚壁菌門肉桿菌科序列數(shù)為137。從圖2漸變的顏色可知，JC樣品種群比J樣品豐富。

圖2 J及JC樣品科水平物種熱圖Fig.2 Heat map analysis on family level of J and JC

2.3.2 屬水平物種組成分析

樣品細菌群落結(jié)構(gòu)在屬水平上的序列數(shù)和相對豐度見表2。表2直觀地表現(xiàn)出兩樣品同一菌屬的豐度具有一定的相似性與差異性。

表2 J及JC樣品屬水平物種組成Tab.2 Community analysis on genus level of J and JC

在J樣品中前四位高豐度值的是芽孢桿菌屬(Bacillus)、不動桿菌屬(Acinetobacter)、檸檬酸桿菌屬(Citrobacter)和沙雷氏菌屬(Serratia)，而在JC樣品中主要是檸檬酸桿菌屬(Citrobacter)，其次為假單胞菌屬(Pseudomonas)、芽孢桿菌屬(Bacillus)、沙雷氏菌屬(Serratia)、肉食桿菌屬(Carnobacterium)。這說明不同種屬細菌代謝特點導致雞蛋在腐敗過程中發(fā)生特殊的生化反應，表現(xiàn)出蛋白液化或明顯臭氣味的變質(zhì)現(xiàn)象。盡管埃希氏-志賀氏菌屬(Escherichia-Shigella)和腸球菌屬(Enterococcus)等序列極少豐度很低，但也不能排除其對雞蛋腐敗變質(zhì)的影響。另外，JC樣品中大部分為檸檬桿菌屬細菌，其豐度達81.23%，其他種群豐度小種類多，共有6個屬比J樣品豐富。

3.3.3 種水平物種組成分析

種水平物種組成分析結(jié)果見表3。由表3可知，兩個樣品在種水平上共覆蓋了23個種，其中主要為吉倫氏檸檬酸桿菌(Citrobactergillenii)、未分類芽孢桿菌(unclassifiedBacillus)、未分類不動桿菌(unclassifiedAcinetobacter)、未分類假單胞菌(unclassifiedPseudomonas)、未分類沙雷氏菌(unclassifiedSerratia)和腸道細菌肉桿菌(Carnobacteriummaltaromaticum)。

在23個種中有14個種為未分類或未培養(yǎng)的種群，同一個未分類的種又分屬于不同的OTU，如未分類不動桿菌分屬于OTU8、OTU28、OTU9，未分類沙雷氏菌分屬于OTU23和OTU11。每個OTU對應于一個不同的16S rRNA序列，即每個OTU是對應于一個不同的細菌(微生物)種的。由此說明，樣品中的不動桿菌和沙雷氏菌分別在種以下有細分的分類單元，如亞種、型，需要在后續(xù)研究中通過單菌株的生理生化試驗和16S rRNA序列測序加以鑒定和分析其生物學特性。

表3 J和JC樣品種水平物種組成Tab.3 Community analysis on specise level of J and JC

3 討論

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)變質(zhì)雞蛋內(nèi)容物中的主要菌群為變形菌門(Proteobacteria)腸桿菌科(Enterobacteriaceae)的檸檬酸桿菌屬(Citrobacter)、沙雷氏菌屬(Serratia)和莫拉菌科(Moraxellaceae)不動桿菌屬(Acinetobacter)、假單胞菌科(Pseudomonadaceae)假單胞菌屬(Pseudomonas)細菌以及厚壁菌門(Firmicutes)芽孢桿菌科(Bacillaceae)芽孢桿菌屬(Bacillus)和肉桿菌科(Carnobacteriaceae)肉桿菌屬(Carnobacterium)的細菌。

檸檬酸桿菌屬(Citrobacter)是動物及人類腸道內(nèi)正常的腸桿菌科菌群之一，其成員原來分別被包含在沙門氏菌屬(Salmonella)和埃希氏菌屬(Escherichia)中，1953年開始列為獨立的菌類，后改為屬[6]。最早只有弗氏檸檬酸桿菌(Citrobacterfleundii)1個種，1993年，通過DNA分子雜交試驗，分為11個種。檸檬酸桿菌是條件致病菌，其中弗氏檸檬酸桿菌(Citrobacterfleundii)是一種典型的導致人-畜-魚共患病的條件性致病菌，適當條件下可引起人類發(fā)生腹瀉、食物中毒和繼發(fā)感染等一系列疾病[7-9]。有研究報道，弗氏檸檬酸桿菌引起動物和人感染時有攜帶如β-內(nèi)酰胺酶等新型耐藥基因的可能，且發(fā)現(xiàn)有cfa、ST和SLT等多種毒力因子[10]。研究發(fā)現(xiàn)，檸檬酸桿菌能分解食品中的營養(yǎng)物質(zhì)，生成胺、硫化物、醇、醛、酮和有機酸等具有不良風味的代謝產(chǎn)物，最終導致食品變質(zhì)[11]。Brenner等[12]研究發(fā)現(xiàn)吉倫氏檸檬酸桿菌(Citrobactergillenii)與弗氏檸檬酸桿菌(Citrobacterfleundii)的相關(guān)度較近。同屬于腸桿菌科的沙雷氏菌屬(Serratia)包括粘質(zhì)沙雷氏菌(Serratiamarcescens)、液化沙雷氏菌(Serratialiquefaciens)、深紅沙雷氏菌(Serratiarubidaea)、普城沙雷氏菌(Serratiaplymuthica)、臭味沙雷氏菌(Serratiaodorifera)、無花果沙雷氏菌(Serratiaficaria)、居泉沙雷氏菌(Serratiafonticola)等多個種，其中與人類有關(guān)的為粘質(zhì)沙雷氏菌、深紅沙雷氏菌和液化沙雷氏菌，可引起人體疾病如呼吸道、泌尿道感染以及敗血癥。沙雷氏菌可在動植物食品中生長繁殖，陳歷水等[13]從保質(zhì)期內(nèi)出現(xiàn)腐敗、脹包的低溫肉制品中分離得到1種產(chǎn)耐高溫蛋白酶的沙雷氏菌屬細菌，說明沙雷氏菌對肉制品和其他富含蛋白質(zhì)食品的腐敗變質(zhì)有一定影響。本文樣品中沙雷氏菌屬占居的相對豐度較小，是否對高蛋白質(zhì)的雞蛋內(nèi)容物腐敗造成影響有待進一步研究。近年來，有大量文獻報道莫拉菌科不動桿菌屬細菌是肉類食品中重要的腐敗菌[14-16]，他們具有較強的蛋白酶活力及產(chǎn)生TVB-N的能力，污染食品后，能大量生長繁殖并水解食品中的蛋白質(zhì)，使其失去原有風味；并且可利用氨基酸作為生長基質(zhì)，產(chǎn)生酯、酸等物質(zhì)。因此本研究中不動桿菌可能是導致雞蛋腐敗變質(zhì)的主要菌群之一。到目前為止，已確認的假單胞菌共有29種，其中銅綠假單胞菌、熒光假單胞菌等引起食品中的蛋白質(zhì)和脂肪等營養(yǎng)物質(zhì)分解后，使食品出現(xiàn)臭味、苦味、腐敗味、脂肪氧化味或老化產(chǎn)生膠凝等一系列食品品質(zhì)問題。這些品質(zhì)變化說明，熒光假單胞菌明顯縮短一些富含蛋白質(zhì)和脂肪食品的保質(zhì)期，從而導致經(jīng)濟損失[17-19]。更有研究表明[20]，假單胞菌是導致冰鮮雞肉腐敗優(yōu)勢菌群之一，可導致蛋白質(zhì)分解，加速肉品腐敗變質(zhì)，產(chǎn)生一些帶有異味的物質(zhì)，如含硫化合物、酯、酸等。蛋白質(zhì)是雞蛋的主要成分之一。由于芽孢桿菌屬細菌具有抗逆能力強、耐高溫、易貯存等生物學特性，而且可以產(chǎn)生一些抗菌物質(zhì)，因此得到了廣泛的研究和應用[21-23]。然而芽孢桿菌酶系豐富代謝能力強的特點，也是食品腐敗菌的原因。研究發(fā)現(xiàn)肉毒梭狀芽孢桿菌(Clostridiumbotulinum)、脂肪酸芽孢桿菌(Bacillusstearothermophilus)、蠟樣芽孢桿菌(Bacilluscereus)、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)等可以導致肉類食品[24,25]、果汁飲料[26]以及豆類食品的腐敗變質(zhì)[27]。本研究J樣品的芽孢桿菌科相對豐度達40.13%，JC樣品中幾乎為零，因此認為芽孢桿菌可能是導致雞蛋腐敗變質(zhì)產(chǎn)生臭味氣體的主要腐敗菌之一。

賴氨酸芽孢桿菌屬(Lysinibacillus)、噬氫胞菌屬(Hydrogenophaga)、腸球菌屬(Enterococcus)、固氮弧菌屬(Azovibrio)、埃希氏菌屬(Escherichia-Shigella)、葡萄球菌屬(Staphylococcus)、肉食桿菌屬(Carnobacterium)、弓形桿菌屬(Arcobacter)、陶厄氏菌屬(Thauera)、寡養(yǎng)單胞菌屬(Stenotrophomonas)、脫氮副球菌屬(Stenotrophomonas)、代爾夫特菌屬(Delftia)、氣單胞菌屬(Aeromonas)、變形桿菌屬(Proteus)這幾種菌屬在雞蛋菌群中占的相對豐度不大，但是并不說明這幾種菌屬對雞蛋變質(zhì)沒有影響。研究報道[28-30]，這些菌屬中的肉食桿菌屬(Carnobacterium)、腸球菌屬(Enterococcus)、變形桿菌屬(Proteus)、弓形桿菌屬(Arcobacter)、固氮弧菌屬(Azovibrio)等都有致腐能力，所以導致雞蛋腐敗變質(zhì)的主要腐敗菌并一定不是占相對豐度大的優(yōu)勢菌屬，也有可能是相對豐度較小但致腐能力強的菌屬。

高通量測序是不依賴于微生物純培養(yǎng)的分子生物學方法，能在短時間內(nèi)產(chǎn)生大量的數(shù)據(jù)，已廣泛地應用于微生物生態(tài)研究。本文研究變質(zhì)雞蛋內(nèi)容物細菌種群多樣性，發(fā)現(xiàn)樣品中細菌種群豐富，主要的是腸桿菌科、芽孢桿菌科、莫拉菌科以及假單胞菌科的細菌，沒有發(fā)現(xiàn)雞蛋傳播傳染病病原沙門氏菌、彎曲桿菌以及李斯特氏菌，但是有一部分種群屬于分類不明確的“unclassified”。從屬水平分析，研究結(jié)果表明樣品中檸檬酸桿菌屬(Citrobacter)、芽孢桿菌屬(Bacillus)、沙雷氏菌屬(Serratia)、假單胞菌屬(Pseudomonas)相對豐度最高，同時也存在相對豐度極低但可能對雞蛋品質(zhì)造成影響的其它類群，如葡萄球菌屬、埃希氏菌屬、肉食桿菌屬、弓形桿菌屬細菌等。從種水平分析，僅一部分序列能明確分類，其它有待進一步研究。