曾 婷，付貴芳，謝繽靈，杜 涵，謝華平,3*，印遇龍,3,4

(1.動物腸道功能調(diào)控湖南省重點實驗室， 長沙 410081； 2.湖南師范大學生命科學學院, 動物營養(yǎng)與人體健康實驗室， 長沙 410081； 3.淡水魚類發(fā)育生物學國家重點實驗室， 長沙 410081； 4.中國科學院亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所, 中國科學院亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)過程重點實驗室， 長沙 410125)

斑馬魚(Daniorerio)，俗稱“zebrafish”，屬硬骨魚類，原產(chǎn)印度和孟加拉，為一種性情溫和、雜食性的熱帶淡水魚[1,2]。斑馬魚飼養(yǎng)成本低、繁殖力強、易大規(guī)模飼養(yǎng)，3個月可性成熟、胚胎易得、便于觀察，且斑馬魚和人類基因有高達87%的同源性，這些優(yōu)點使斑馬魚成為研究人體疾病和發(fā)育機理的理想模式生物[3,4]。

miRNA是一類內(nèi)生的、長度為19～23個堿基的非編碼RNA。一個miRNA可以調(diào)節(jié)多個基因[5]，也可以通過幾個miRNA的組合來精細調(diào)控某個基因的表達[6]。miRNA存在多種形式，其被RNA聚合酶II轉(zhuǎn)錄為有帽子結(jié)構(gòu)的和多聚腺苷酸尾巴(AAAAA)的初級轉(zhuǎn)錄本(pri-miRNA)，該轉(zhuǎn)錄本可以是蛋白質(zhì)編碼的，也可以是非蛋白質(zhì)編碼的。初級轉(zhuǎn)錄物在核糖核酸酶Drosha和輔助因子Pasha的共同作用下切割產(chǎn)生約70個堿基的莖環(huán)前體miRNA(pre-miRNA)，再被細胞質(zhì)核糖核酸酶Dicer切割生成成熟的miRNA和反義miRNA(miRNA*)[7]。成熟的miRNA被整合到RNA誘導的沉默復合物(RNA-induced silencing complex，RISC)中，該復合物通過與miRNA的堿基配對識別靶mRNA，最常見的是抑制靶mRNA的翻譯或使其翻譯不穩(wěn)定[8]。

miRNA最初被發(fā)現(xiàn)是在線蟲中參與lin-4的發(fā)育，而在哺乳動物中miRNA參與造血譜系分化和同源框基因調(diào)控[9,10]。隨后Muy等[11]研究發(fā)現(xiàn)microRNA表達水平的紊亂與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。Zhang等[12]的報道表明miR-196a在宮頸癌細胞中靶向調(diào)控netrin4基因，通過靶向同源基因團來調(diào)節(jié)哺乳動物的發(fā)育[13,14];miR-196a在胃癌的預(yù)后過程中表達上升[15]；還有研究表明，miR-196a在食管鱗癌細胞中表達顯著上調(diào)，同時，在食管鱗癌患者唾液中miR-196a的表達比正常人高27倍，因此，miR-196a可能作為潛在的食管鱗狀細胞癌診斷標志[16]。在非洲爪蟾中，miR-196a的劑量不同會導致特定的眼部發(fā)育異常[17]。通過生物信息學分析比對發(fā)現(xiàn)miR-196a-1基因在各個物種中十分保守，說明miR-196a-1基因在調(diào)控生物體的發(fā)育、腫瘤發(fā)生和發(fā)展中起著非常重要的作用。

CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)是近年來火熱的基因編輯技術(shù)。CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)由兩部分組成，CRISPR結(jié)構(gòu)骨架序列和Cas9蛋白。CRISPR結(jié)構(gòu)骨架序列由前導序列、Cas基因、CRISPR基因座共同組成，具有招募Cas蛋白作用[18]。Cas9蛋白具有能特異性切割DNA雙鏈的作用。CRISPR基因座經(jīng)過轉(zhuǎn)錄加工后，得到小片段的CRISPR RNA即crRNA，而crRNA與反式激活的crRNA即tracrRNA能形成一種嵌合RNA，該嵌合RNA與Cas9蛋白形成復合物，從而切斷基因組DNA[19,20]。后來科學家進一步改造，將crRNA和tracrRNA改造成一個向?qū)NA(sequence-specific guide RNA，sgRNA)[21]。目的基因靶位置序列的3’端有原間隔序列相鄰基序PAM(protospacer adjacent motifs),為5’-NGG-3’序列，這是Cas9蛋白的識別位點。最后，通過改變sgRNA序列，體外合成sgRNA，Cas9蛋白可以靶向切割目的基因，從而達到基因敲除的目的[22,23]。

目前，miRNA調(diào)控生物發(fā)育、腫瘤發(fā)生和發(fā)展機制越來越受到人們的關(guān)注，但是，許多miRNA的功能仍然未知。為了研究miR-196a-1基因在斑馬魚腸道發(fā)育過程中的作用，本文利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)構(gòu)建斑馬魚miR-196a-1基因敲除品系，為探究miR-196a-1在腸道發(fā)育中的作用奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試驗動物

本文用于試驗的TU品系斑馬魚來自本實驗室養(yǎng)殖。水溫28 ℃，pH值在6.5～7.5，14 h光照/10 h黑暗交替循環(huán)。1對斑馬魚1周產(chǎn)1次卵，1次產(chǎn)卵約200個胚胎，胚胎在恒溫28.5 ℃的E3水中培養(yǎng)，胚胎2 d后破膜，第5天開始喂食草履蟲至2周左右，之后轉(zhuǎn)移至養(yǎng)殖系統(tǒng)架上喂食豐年蟲，養(yǎng)殖系統(tǒng)上的斑馬魚1天喂食2次，早晚各1次。本文試驗一般在斑馬魚胚胎發(fā)育至1細胞期時進行顯微注射。

1.1.2 主要試劑

引物由擎科生物合成，PCR高保真酶購自擎科生物，DNA marker購自TAKARA公司，瓊脂糖購自BBI公司，PCR產(chǎn)物純化試劑盒購自生工生物，體外轉(zhuǎn)錄試劑盒購自Thermo Fisher Scientific公司，RNA純化試劑盒購自Qiagen公司，Cas9蛋白購自Thermo Fisher Scientific公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 sgRNA靶位點設(shè)計

負反轉(zhuǎn)構(gòu)造的存在說明研究區(qū)構(gòu)造演化經(jīng)歷了由早期擠壓應(yīng)力到晚期拉張應(yīng)力的轉(zhuǎn)換。早期擠壓形成的北西向構(gòu)造帶在晚期拉張應(yīng)力作用下使研究區(qū)具備了良好的油氣成藏條件。

首先在Ensembl網(wǎng)站上(http://www.ensembl.org/index.html)獲取目標基因的完整序列，各個轉(zhuǎn)錄本以及內(nèi)外顯子等信息。然后找出所有緊鄰5’-NGG-3’(PAM)的候選靶序列，靶序列一般大小為18～20 bp。sgRNA引物序列F基本結(jié)構(gòu)：靶序列前加保護堿基(tg)和T7啟動子(TAATACGACTCACTATA)或Sp6啟動子(ATTTAGGTGACACTATA)，靶序列后加sgRNA骨架序列上游序列(GTTTTAGAGGCTAGAA ATAGG)，sgRNA引物序列R：AAGCACCGACTCGGTGCCACT，根據(jù)miR-196a-1基因靶位點通過Primer3.0設(shè)計基因組正反檢測引物G196a-1-F和G196a-1-R(表1)。

表1 本文涉及到的引物和模板序列Tab.1 Primers and template sequences involved in this study

1.2.2 sgRNA的合成

使用通用模板(見表1)，以sgRNA1-F/sgRNA-R或sgRNA2-F/sgRNA-R為引物，在退火溫度為60 ℃，延伸時間為10 s的條件下，用高保真酶進行PCR擴增，獲得攜帶Sp6啟動子的miR-196a-1基因靶位點序列1以及T7啟動子的miR-196a-1基因靶位點序列2的sgRNA模板序列；PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳并切膠回收，以回收的PCR產(chǎn)物作為模板，用Sp6(或T7)體外轉(zhuǎn)錄試劑盒合成sgRNA，轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物用RNA純化試劑盒進行純化回收，瓊脂糖凝膠電泳及測定濃度后-80 ℃保存。

1.2.3 顯微注射以及靶位點有效性檢測

收集15 min內(nèi)產(chǎn)的斑馬魚受精卵，待發(fā)育至1細胞期時排列在注射板上，將miR-196a-1基因靶位點的sgRNA1(30 ng/μL)、sgRNA2(35 ng/μL)和Cas9蛋白(150～300 ng/μL)按1∶1∶0.7比例混勻；用定量顯微注射系統(tǒng)將混合溶液(約1 nL)共注射到斑馬魚受精卵中，注射后放置到28.5 ℃的恒溫箱中；受精卵培養(yǎng)至36 h時，分別收集野生型和部分注射后胚胎進行有效性鑒定，剩余胚胎繼續(xù)培養(yǎng)至成魚。

1.2.4 可穩(wěn)定遺傳突變體的篩選

將注射后的胚胎培養(yǎng)至2個月左右發(fā)育為幼魚，對幼魚逐條剪尾進行基因型鑒定。由于兩個靶位點之間相距132 bp，如果兩個靶位點都有效，就會造成較大片段的缺失。用基因組檢測引物對基因組進行PCR擴增，隨后進行瓊脂糖凝膠電泳，若PCR產(chǎn)物會同時出現(xiàn)野生型目的條帶以及比野生型目的條帶小100 bp左右的條帶，則這些幼魚為攜帶突變的F0代魚；將F0代幼魚繼續(xù)飼養(yǎng)1個月左右至成魚，與野生型進行雜交，用同樣的基因型鑒定方法篩選出可穩(wěn)定遺傳的魚，這些魚為F1代突變體。基因型鑒定后，根據(jù)瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果，將F1代突變體中比野生型目的條帶小的條帶進行切膠回收，并送公司測序，根據(jù)測序結(jié)果分析突變位點和突變的堿基數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 miR-196a-1基因生物保守性分析

首先在NCBI網(wǎng)站上(https://www.ncbi.nlm.nih.gov)查找miR-196a-1基因在各個物種中的序列，并將序列下載，利用blast比對各個物種的miR-196a-1基因序列，并找出保守序列。在miRBase網(wǎng)站上(https://www.mirbase.org)查找種子序列，與各個物種的miR-196a-1基因序列比對，發(fā)現(xiàn)各個物種的miR-196a-1基因的種子序列高度保守(見圖1)。

2.2 miR-196a-1基因靶位點確定

按1.2.1所述的方法在miR-196a-1基因序列上選擇基因敲除位點(見圖2)，靶位點序列前加保護堿基和啟動子序列，靶位點序列后加sgRNA骨架上游序列，將此作為正向引物sgRNA1-F和sgRNA2-F。sgRNA骨架下游序列作為反向引物sgRNA-R。

圖1 各個物種間miR-196a-1基因生物保守性分析Fig.1 Bioconservative analysis of miR-196a-1 gene among species加粗部分為保守序列區(qū)，序列標紅處為種子序列。miR-196a-1種子序列區(qū)高度保守The bold part showed the conserved sequence region, and the red part of the sequence is the seed sequence. The miR-196a-1 seed sequence is highly conserved

圖2 miR-196a-1基因靶位點示意圖Fig.2 The design diagram of miR-196a-1 gene targeting site以上序列是miR-196a-1基因序列的一部分，大寫加粗部分為外顯子，小寫未加粗部分為內(nèi)含子；下劃線為直線的表示靶位點序列，下劃線為雙直線的表示為PAM序列；下劃線為波浪線的則是檢測引物Above is partial sequence of the miR-196a-1 gene. The capitalized with bold sequences are exons, the lower case with bold parts are introns；The sequence with single underline indicated the target site1 and target site2 sequence, respectively;The doubled underlines means PAM sequence. Underlined by wavy lines are primers for genotyping

2.3 miR-196a-1基因注射有效性檢測與分析

為了確認靶位點有效，本文按方法1.2.3中所述將注射后胚胎培養(yǎng)至36 hpf (hours post fertilization)，隨機挑選5管，每管2顆胚胎，提取基因組DNA進行PCR擴增(見圖3)。結(jié)果顯示，3號和4號泳道除了一條210 bp的野生型條帶外，下方有一條較弱的小帶，證明選擇的兩個靶位點都有效，達到基因敲除效果。

圖3 胚胎注射有效性分析Fig.3 Analysis of effectiveness of embryo injection胚胎注射有效性分析PCR產(chǎn)物凝膠電泳圖。M：DNA標準；1～5：注射胚胎基因組DNA進行PCR擴增的產(chǎn)物；6：野生型對照。3和4泳道除了有一條明亮的210 bp的野生型條帶外，下方有一條較弱的小帶(黑色箭頭指示)， 這說明兩個靶位點都有效Gel electrophoresis of PCR products for embryo injection effectiveness analysis. M:DNA marker;1～5:PCR amplification products of genomic DNA with embryo injection;6:Wild type control group. In addition to a bright 210 bp wild-type band in lanes 3 and 4, there is a weaker band (indicated by a black arrow) below, indicating that both target sites are valid

2.4 F0代突變體篩選

將注射有效的剩余胚胎養(yǎng)至成魚，對成魚逐條剪尾提取基因組DNA進行PCR檢測分析(見圖4)。結(jié)果顯示第8號泳道除了一條210 bp的野生型條帶外，下方有一條較弱的小帶。

圖4 F0代兩個月幼魚篩選Fig.4 F0 generation two months juvenile screeningM：DNA標準；1～9：兩個月幼魚剪尾提取基因組DNA進行PCR擴增的產(chǎn)物；10：野生型對照。第8號泳道除了有一條明亮的210 bp的野生型條帶外，下方有一條較弱的小帶(黑色箭頭指示)M:DNA marker;1～9:PCR amplified products using two months juvenile genomic DNA injected with miR-196 guide RNAs;10:Wild type control. In addition to a bright 210 bp wildtype band, lane 8 has a weaker band below (Indicated by the black arrow)

2.5 穩(wěn)定遺傳突變體的篩選

本試驗將篩選到的第8號F0代突變體與野生型斑馬魚雜交，得到F1代魚，收集5管F1代胚胎，每管2顆，提取基因組DNA做PCR擴增并凝膠鑒定，結(jié)果如圖5a所示，發(fā)現(xiàn)除了210 bp的野生型條帶外，下方有一條100 bp左右的條帶，說明第8號F0代突變體可穩(wěn)定遺傳。將該100 bp左右的條帶進行切膠回收并送公司測序，峰圖顯示兩個靶位點都出現(xiàn)缺失，結(jié)果如圖5b所示。測序序列在NCBI blast 數(shù)據(jù)庫中進行比對，發(fā)現(xiàn)突變體的兩個靶位點之間缺失了103 bp堿基，證明兩個靶位點都有效，并造成大片段的缺失，結(jié)果如圖5c所示。將剩余的F1代胚胎養(yǎng)成2個月的幼魚，再逐條剪尾提取基因組DNA進行PCR檢測鑒定，結(jié)果如圖5d所示，獲得可穩(wěn)定遺傳的F1代魚。

圖5 F1代突變體篩選Fig.5 F1 generation mutant screening(a)F1代胚胎PCR產(chǎn)物凝膠電泳圖。M：DNA標準；1～9：注射胚胎sgRNA后，提取基因組DNA，進行PCR擴增的產(chǎn)物；10：野生型對照。第1、3、7號泳道除了有一條明亮的210 bp的野生型條帶外，下方有一條較弱的小帶(黑色箭頭指示)。證明F0代突變體篩選的8號魚可產(chǎn)生能穩(wěn)定遺傳的突變后代；(b)F1代胚胎PCR產(chǎn)物測序峰圖。將基因敲除條帶的PCR產(chǎn)物送公司測序，峰值圖中：“----”代表第一號靶位點序列，基因敲除后，第一號靶位點缺失了7個堿基?！啊贝淼诙柊形稽c序列，第二號靶位點缺失了8個堿基；(c)測序序列比對結(jié)果圖。發(fā)現(xiàn)第一號靶位點和第二號靶位點之間缺失103 bp，包括第一號靶位點缺失了7個堿基，第二號靶位點缺失了8個堿基以及第一號與第二號靶位點中間的堿基；(d)F1代突變體成魚PCR產(chǎn)物凝膠電泳圖。M：DNA標準；1～23泳道：注射胚胎基因組DNA進行PCR擴增的產(chǎn)物；24泳道：野生型對照。第1、3、10、12、19號泳道除了有一條明亮的210 bp的野生型條帶外，下方有一條較弱的小帶(黑色箭頭指示)(a)Gel electrophoresis of PCR products using F1 embryos as genomic DNA. M:DNA marker;1～9:PCR products using genomic DNA injected with sgRNA;10:Wild type control. In addition to a bright 210 bp wild-type band,there was a weaker band below in lanes 1, 3, and 7 (indicated by the black arrow). The fish No.8 selected by the F0 mutant can produce mutant offspring that can be stably inherited;(b) The F1 generation mutant embryo PCR product sequencing peak map, the small band of PCR product was purified and sent to the company for sequencing, “----”indicated the first target site sequence,7 bases missing from target site 1；“”marked the second target site sequence,7 bases missing at target 2;(c)Mutant sequence was compared with the control in the NCBI blast datebase,103 bp was missing between the first and second target sites;(d)Gel electrophoresis of PCR products of F1 adult mutant fish. M:DNA marker;1～23:PCR amplified product of genomic DNA with embryo injection;24:Wildtype control. Inaddition to a bright 210 bp wildtype band, there was a weaker band below in lanes 1, 3, 10, 12, 19 (indicated by the black arrow)

3 討論

CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)面世之前，一般采用鋅指核酸酶技術(shù)(Zinc-finger nucleases，ZFN)和基因打靶技術(shù)(transcription activator-like effector nucleases，TALEN)進行基因編輯，但ZFN和TALEN基因打靶技術(shù)存在很大的局限性。ZFN基因打靶技術(shù)操作過程十分復雜，并且一次不能對多個靶位點進行切割，打靶效率不高。在構(gòu)建動物模型的過程中，需要多次構(gòu)建表達載體，構(gòu)建載體過程繁瑣，試驗周期太長[24-26]。CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)相比前兩種技術(shù)設(shè)計簡單、高效，大大縮短了試驗周期，一經(jīng)面世，就被廣泛應(yīng)用。本文用斑馬魚作為模式動物，使用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)敲除miR-196a-1基因，斑馬魚作為模式動物的優(yōu)勢結(jié)合CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)的簡單操作，采用Cloning free技術(shù)，不需要進行載體的構(gòu)建，只需以寡聚核苷酸作為模板進行PCR，將PCR產(chǎn)物純化回收后直接作為合成sgRNA的模板，簡化了基因敲除的過程，大大提高了試驗效率，降低了試驗過程中潛在的風險。本文選用了兩個靶位點，采取了注射一對sgRNA的方式，如果兩個靶位點都有效，可以造成大片段的缺失，對斑馬魚易回復突變的特點進行補償作用，敲除結(jié)果也可在瓊脂糖凝膠電泳中直觀地觀察到，無需單個檢測。但CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)有易脫靶的局限性，這就需要對目的基因的敲除蛋白結(jié)構(gòu)域和靶位點的選擇有更高的要求。

因為顯微注射后的F0代胚胎為嵌合體，其突變不一定能夠遺傳到下一代，因此不直接對F0代突變體測序。篩選到的F0代突變體只進行PCR擴增鑒定，將鑒定有突變的個體與野生型斑馬魚雜交產(chǎn)生F1代，提取F1代胚胎基因組DNA做PCR擴增，瓊脂糖凝膠電泳驗證，隨后送公司進行Sanger測序，確定敲除位點和數(shù)量。

F1代突變體能夠穩(wěn)定遺傳，將F1代雜合突變體自交，經(jīng)基因型鑒定，出現(xiàn)25%的純合子，與預(yù)期結(jié)果相符合。將F1代miR-196a-1基因雜合突變體成魚自交，觀察F2代miR-196a-1基因純合突變胚胎，其外表發(fā)育正常，未出現(xiàn)明顯表型(圖6)，這說明缺失后不影響整體胚胎發(fā)育，導致miR-196a-1突變后斑馬魚胚胎整體未出現(xiàn)明顯缺陷，但是該基因是否引起細微結(jié)構(gòu)異常尚不清楚，需要進一步研究。該基因可能還有其他的miRNAs起著代償作用，共同降解靶基因。在后續(xù)的研究中，應(yīng)在miR-196a-1基因敲除模型上進一步敲除其它相關(guān)的miRNAs，觀察這些基因在調(diào)控斑馬魚腸道發(fā)育中的功能。本研究第一次成功構(gòu)建了miR-196a-1基因敲除斑馬魚模型，為后續(xù)的miR-196a-1基因功能研究提供了良好的研究基礎(chǔ)。

圖6 miR-196a-1基因純合突變體表型 (50 ×)Fig.6 Phenotype of miR-196a-1 null mutant (50 ×)(a)野生型對照組；(b)miR-196a-1基因純合突變體。結(jié)果顯示miR-196a-1基因純合突變體與野生型相比，外表沒有明顯變化(a)Wild-type control group;(b)Homozygous mutant of the miR-196a-1 gene. The results showed that the miR-196a-1 homozygous mutant had no obvious difference compared to the wild type