劉嵐君 何季 文雪峰

摘要：為探究間作不同農(nóng)作物對(duì)刺梨園土壤微生物類群和酶活性的影響，在貴州省黔南州龍里縣谷腳鎮(zhèn)刺梨種植基地設(shè)置刺梨/辣椒間作、刺梨/玉米間作和刺梨單作三個(gè)種植模式的試驗(yàn)區(qū)，取0～20 cm深度和20～40 cm深度的土樣，分別測(cè)試其土壤微生物數(shù)量和酶活性，探明不同種植模式下土壤微生物（細(xì)菌、真菌、放線菌）數(shù)量和酶活性的變化。結(jié)果表明：間作對(duì)刺梨園土壤微生物數(shù)量和酶活性有促進(jìn)的作用。間作模式下土壤微生物數(shù)量明顯高于單作，綜合比較發(fā)現(xiàn)：玉米//刺梨>辣椒//刺梨>刺梨單作;間作模式下土壤酶活性高于刺梨單作，其中：玉米//刺梨>辣椒//刺梨>刺梨。分析還表明：刺梨園土壤微生物數(shù)量和土壤酶活性之間呈正相關(guān)關(guān)系。

關(guān)鍵詞：刺梨園土壤;間作;微生物;酶活性

中圖分類號(hào)：S1542;S1543

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1008-0457（2019）06-0008-06國(guó)際DOI編碼：10.15958/j.cnki.sdnyswxb.2019.06.002

Effects of Intercropping Different Crops on Soil Microbial Group and Enzyme Activities in Rose Roxburghii Orchard

LIU Lan-jun，HE Ji*，WEN Xue-feng

（College of Agriculture，Guizhou University，Guiyang，Guizhou 550025，China）

Abstract：In order to explore the effects of intercropping different crops on soil microbial groups and enzyme activities in Rose roxburghit，a test area with three planting patterns：the thorn pear/pepper intercropping，thorn pear/maize intercropping and thorn pear monocropping in the thorn pear planting base in Gujiao Town，Longli County，Guizhou Provincesoil samples with depths of 0～20 cm and depths of 20～40 cm were tested for soil microbial quantity and the changes of soil microbes （bacteria，fungi，actinomycetes）and enzyme activities under different planting patterns The results showed that intercropping had a promoting effect on soil microbial quantity and enzyme activity in the thorn garden The amount of soil microbes in the intercropping mode was significantly higher than that in the single crop The comprehensive comparison showed that：corn-thorn pear> pepper-thorn pear> thorn pear single crop; soil enzyme activity in the intercropping mode was higher than that of thorn pear in the single crop，among which：corn-thorn pear >pepper-prickly pear > prickly pear single The analysis also showed that there was a positive correlation between soil microbial quantity and soil enzyme activity in the garden

Key words：Rose roxburghii orchard soil; intercropping; microorganism; enzyme activity

間作是指在同一塊土地上，分行或者分帶間種植2種或2種以上生長(zhǎng)周期相同或相近的作物，該種植模式可以根據(jù)它的特性來充分地利用土地[1]。合理的間作模式具有密植效應(yīng)、時(shí)空效應(yīng)、補(bǔ)償效應(yīng)、邊際效應(yīng)、異質(zhì)效應(yīng)，提高了對(duì)土地、養(yǎng)分、光能、熱能的利用率[2-3]，實(shí)現(xiàn)農(nóng)業(yè)的高產(chǎn)高效。間作的種植模式除了提高作物的產(chǎn)量，還能提高作物的抗病率。間作的種植模式使經(jīng)濟(jì)和生態(tài)的雙贏[4]。間作對(duì)土壤微生物的數(shù)量和酶活性有著積極的影響，張向前、黃國(guó)勤等人[5]研究發(fā)現(xiàn)，和單作相比，玉米和花生間作可以促進(jìn)或提高土壤微生物的群落功能多樣性和土壤酶活性，并且對(duì)玉米的產(chǎn)量和品質(zhì)有著顯著的提高作用。微生物是土壤的重要組成部分，土壤酶是一種生物活性物質(zhì)，主要來自于植物根系、土壤微生物和動(dòng)植物殘?bào)w分解[6-7]。它們都參與土壤的生化反應(yīng)，推動(dòng)了土壤生理生化反應(yīng)的進(jìn)程，是土壤生態(tài)中不可缺少的對(duì)象[8]，因而研究土壤微生物和酶，對(duì)評(píng)價(jià)土壤質(zhì)量和肥力有重要意義。微生物對(duì)土壤的微環(huán)境十分敏感，受很多因素的影響。就栽培方面而言，施肥、嫁接、輪作、間作等對(duì)微生物的數(shù)量有顯著影響。前人的研究表明，間作的種植模式相對(duì)于單作能提高土壤微生物的根際效應(yīng)，提高土壤微生物的含量，改善土壤的微環(huán)境，進(jìn)而改善土壤的酶活性[9-14]。土壤中微生物所分泌的某些化學(xué)物質(zhì)能夠?qū)γ感纬杉捌浠钚援a(chǎn)生重要影響，因此，土壤中細(xì)菌、真菌、放線菌的數(shù)量與酶的數(shù)量和活性有著非常緊密的關(guān)系。

刺梨富含維生素C，對(duì)人類身體有益。通過間作方式種植刺梨，不僅可以助力脫貧攻堅(jiān)，而且還可以提高土地的利用率。本文探討不同間作模式對(duì)刺梨園土壤微生物類群（細(xì)菌、真菌、放線菌）的數(shù)量和土壤酶活性的影響，進(jìn)而分析間作與單作的種植方式下土壤肥力的狀況，為農(nóng)民提供刺梨間作種植的生態(tài)管理依據(jù)。

1材料與方法

11研究區(qū)概況

本試驗(yàn)設(shè)在貴州省黔南州龍里縣谷腳鎮(zhèn)刺梨種植基地，地處東經(jīng)106°45′19″～107°15′1″，北緯26°10′19″～26°49′33″之間，海拔介于1080～1500 m之間。該區(qū)屬亞熱帶季風(fēng)濕潤(rùn)氣候，年降雨量平均為10893 mm，平均氣溫15℃?？λ固氐孛裁黠@，黃壤。

12材料與方法

121樣地設(shè)置及樣品采集

根據(jù)典型性原則和代表性原則在研究區(qū)設(shè)置兩種不同間作模式及單種刺梨的對(duì)照試驗(yàn)區(qū)（見表1）。共三個(gè)處理，每個(gè)處理三次重復(fù)，共9個(gè)實(shí)驗(yàn)小區(qū)，試驗(yàn)區(qū)為平地，每個(gè)樣地的面積為15 m×15 m，種植刺梨的品種為貴農(nóng)5號(hào)，施用的肥料統(tǒng)一為氮磷鉀復(fù)合肥。

2017年1～2月期間對(duì)每個(gè)樣地0～20 cm和20～40 cm土層分層采集土樣，采用“S形”取樣，四分法混勻樣品，每個(gè)樣品取1～15 kg。取回的土樣部分放在冰箱冰藏，用于測(cè)定土壤微生物。部分土樣風(fēng)干研磨后過1 mm篩，裝袋儲(chǔ)藏用來測(cè)定土壤酶。

122測(cè)定方法

土壤微生物的測(cè)定方法：首先稱取10 g土壤樣品放入盛有90 mL無菌水的三角瓶中，置于搖床上振蕩1 h，靜置30 min，使土樣與水分充分混勻，使土壤中的微生物細(xì)胞充分分散，從土壤中分離出來。此為10-1的土壤懸液，吸取1 mL此土壤懸液于9 mL無菌水中，另用無菌吸管吹吸3次混勻，制成10-2土壤懸液。以此類推，制成10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8不同稀釋度的土壤懸液。然后根據(jù)菌群選擇合適的稀釋度來進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，本文采用的是稀釋平板法，分別設(shè)置三個(gè)濃度梯度，三次重復(fù)。最后用平板接種法將菌種接至平板培養(yǎng)基上（用移液管吸取一定體積的菌液移至平板培養(yǎng)基上）進(jìn)行培養(yǎng)。其計(jì)數(shù)方法為涂布平板計(jì)數(shù)法，設(shè)置三個(gè)重復(fù)，分別編號(hào)，把配好的培養(yǎng)基分別倒入培養(yǎng)皿中，凝固，然后移液槍吸取不同稀釋度的懸液放在編好號(hào)的培養(yǎng)基中間。用無菌玻璃棒均勻的在平板表面上輕輕的涂布。培養(yǎng)條件是把在無菌操作臺(tái)上涂布好的平板再次用紫外線殺菌，然后放入恒溫冰箱（25℃-28℃）進(jìn)行培養(yǎng)，至菌落長(zhǎng)出后即可計(jì)數(shù)。培養(yǎng)時(shí)間由短到長(zhǎng)分別是：細(xì)菌1～2 d，真菌3～4 d，放線菌5～7 d。細(xì)菌的培養(yǎng)—牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基;真菌的培養(yǎng)—馬丁-孟加拉紅瓊脂培養(yǎng)基;放線菌的培養(yǎng)—改良高氏1號(hào)瓊脂培養(yǎng)基。

微生物計(jì)算公式：cfug-1=MD/W

式中M為菌落平均數(shù);D為稀釋倍數(shù);W為土壤烘干質(zhì)量

土壤酶的測(cè)定方法：用苯酚鈉和次氯酸鈉對(duì)脲酶進(jìn)行比色，過氧化氫酶活性采用高錳酸鉀滴定法，蔗糖酶活性采用3，5-二硝基水楊酸比色法測(cè)定，酸性磷酸酶活性采用硝基酚比色法。

123數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)結(jié)果均用3次重復(fù)所得數(shù)據(jù)的平均值進(jìn)行分析。用Excel 2010進(jìn)行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)、初步處理和作圖，用SPSS 170軟件分別對(duì)微生物和土壤酶進(jìn)行顯著性分析。

2結(jié)果與分析

21不同間作模式下對(duì)刺梨園土壤微生物類群的數(shù)量特征

211不同間作模式下土壤細(xì)菌的數(shù)量從圖1中可以看出，兩種間作模式下土壤細(xì)菌數(shù)量高于刺梨單作，即間作對(duì)土壤細(xì)菌的生長(zhǎng)有促進(jìn)作用。比較結(jié)果為：辣椒//刺梨>玉米//刺梨>刺梨。在土壤深度0～20 cm，BO和AO的土壤細(xì)菌數(shù)量顯著高于CK（P<005），其中，AO是CK的364倍，BO是CK的294倍;AO和BO間沒有顯著差異（P>005），但AO較BO有上升的趨勢(shì)，其增加的百分?jǐn)?shù)為2371%;在土壤深度20～40 cm，AO和BO的細(xì)菌含量顯著高于CK（P<005），其中，AO是CK的251倍，BO是CK的219倍; BO和AO的細(xì)菌數(shù)量沒有顯著差異性（P>005）。如圖所示，隨著土層深度的增加，細(xì)菌數(shù)量是逐漸降低的。

212不同間作模式下土壤真菌的數(shù)量

如圖2所示，間作模式下土壤真菌含量均高于單作，即間作對(duì)土壤真菌生長(zhǎng)有促進(jìn)作用。比較結(jié)果為：玉米//刺梨>辣椒//刺梨>刺梨。在土壤深度0～20 cm，AO和BO與CK之間土壤真菌數(shù)量有著顯著差異性（P<005），其中，AO是CK的165倍，BO是CK的183倍;BO和AO之間有顯著差異（P>005）。在土壤深度20～40 cm，AO和BO的土壤真菌含量顯著高于CK（P<005），AO是CK的185倍，BO是CK的2倍。其中，BO較AO有上升趨勢(shì)，增加的百分?jǐn)?shù)為833%;從上圖可知，土壤真菌的數(shù)量隨著土層深度的增加呈逐漸下降趨勢(shì)，0～20 cm層的真菌數(shù)量較多。

213不同間作模式下土壤放線菌的數(shù)量

如圖3可知，間作模式下土壤放線菌的含量高于刺梨單作，即間作對(duì)土壤放線菌的生長(zhǎng)有促進(jìn)作用。比較結(jié)果為：玉米//刺梨>辣椒//刺梨>刺梨。在土壤深度0～20 cm，AO和BO與CK之間土壤放線菌的含量有著顯著差異性（P<005），其中，AO是CK的140倍，BO是CK的162倍;BO較AO的含量有增長(zhǎng)趨勢(shì)，其增加的百分?jǐn)?shù)為1593%。在土壤深度20～40 cm，AO和BO的土壤放線菌的含量顯著高于CK（P<005），其中，AO是CK的133倍，BO是CK的138倍，BO和AO的放線菌含量沒有顯著差異性（P>005），有增長(zhǎng)的趨勢(shì)，增長(zhǎng)的百分?jǐn)?shù)為375%。由圖中還可以看出來，土壤放線菌的數(shù)量隨著土層深度的增加而逐漸減小。

LEfSe組間群落差異分析。即linear discriminant analysis（LDA），線性判別分析。LEfSe根據(jù)分類學(xué)組成對(duì)樣品按照不同的分組條件進(jìn)行線性判別分析，找出對(duì)樣品劃分產(chǎn)生顯著性差異影響的群落或物種。

2結(jié)果與分析

21腸道微生物Beta多樣性分析

211UniFrac分析

對(duì)樣品兩兩之間進(jìn)行比較分析，得到樣品間的UniFrac距離矩陣，進(jìn)行可視化操作，能夠得到UniFrac差異性矩陣熱圖（見圖1）。圖1可以看出，肥胖與偏瘦組差異性較強(qiáng)，肥胖組與超重組、超重組與正常組間差異較小。

212基于距離矩陣構(gòu)建的PCoA

由圖2可觀察到，肥胖組與正常組、肥胖組與偏瘦組差異較大，正常組與超重組有部分重合，菌群組成有一定相似性，正常組與偏瘦組重合較多，相似性較強(qiáng)。超重組與肥胖組在圖2b中有部分重合，顯示具有一定相似性。

213多樣品相似度樹狀圖

由圖3可觀察到，不同樣品中，肥胖組、超重組、正常組各組間的腸道微生物菌群在進(jìn)化上存在差異性，但肥胖組與超重組、正常組與肥胖組也存在一定的相似性。

214基于UniFrac的NMDS非度量多維尺度分析

從圖4a基于Weighted UniFrac NMDS看，肥胖組與偏瘦組距離較遠(yuǎn)，散布性強(qiáng)，差異性較大，肥胖與正常組重合度較高，差異較小;而圖4b Unweighted UniFrac NMDS 難以明顯區(qū)分。

215基于物種信息的Bray￣Curtis距離分析

在門水平，肥胖組與其他組距離較遠(yuǎn)，正常組與超重組距離較近;在種屬水平上，肥胖組與超重組距離較近，差異較小（見圖5）。

22腸道微生物構(gòu)成與豐度變化

221群落物種分布柱狀圖

在屬水平上，鑒定出99個(gè)屬（見圖6a），其中相對(duì)豐度大于100%的屬包括：擬桿菌屬（Bacteroides 4168%，F(xiàn)aecalibacterium 646%）、考拉桿菌屬（Phascolarctobacterium 176%）、巨單胞菌屬（Megamonas 166%，Parabacteroides 273%，Parasutterella190%，梭菌屬（Fusobacterium 212%）、毛螺菌屬（Lachnospira136%）、Alistipes（118%）、薩特菌屬（Sutterella 103%，Subdoligranulum 133%）和羅氏菌屬（Roseburia 158%）。共占測(cè)序序列總數(shù)的6478%。

在種水平上（見圖6b），相對(duì)豐度大于100%的屬包括：?jiǎn)涡螖M桿菌（Bacteroides uniformis 344%，Bacteroides massiliensis 238%）、脆弱擬桿菌（Bacteroides fragilis 383%，F(xiàn)usobacterium mortiferum188%）。

222熱圖（見圖7）

從圖7中可以看出，門水平，Actinobacteria、Fusobacteria、Proteobacteria顏色差異明顯;綱水平，Deltaproteobacteria、Coriobacteriia、Betaproteobacteria、Bacilli、Erysipelotrichia顏色變化較大;目水平，F(xiàn)usobacteriales、Pasteurellales、Coriobacteriales、Burkholderiales、Lactobacillales、Erysipelotrichales、Enterobacteriales顏色變化較大;科水平Prevotellaceae、Alcaligenaceae、Acidaminococcaceae、Pasteurellaceae、Rikenellaceae、Streptococcaceae、Desulfovibrionaceae、Peptostreptococcaceae、Veillonellaceae、Coriobacteriaceae、Erysipelotrichaceae顏色變化較大;屬水平Erysipelatoclostridium、Romboutsia、Megamonas、Parasutterella、Phascolarctobacterium、Anaerostipes、Subdoligranulum、Flavonifractor、Streptococcus、Lachnospira、Dorea 顏色范圍較廣。

23LDA EffectSize 組間群落差異分析

圖8a顯示，正常組中，Cyanobacteria、Betaproteobacteria起到重要作用;肥胖組中，Erysipelotrichaceae、Erysipelotrichales、Erysipelotrichia起到重要作用;超重組中，Pseudomonadales起到重要作用。

從圖9可以觀察到，o_Bifidobacteriales與g_Bifidobacterium，在正常組中豐度最高，肥胖組與超重組豐度較低，在偏瘦組中未檢測(cè)到;g_Parabacteroides在超重組豐度最高，正常組、肥胖組、偏瘦組均有檢測(cè)到;p_Cyanobacteria在正常組豐度最高，肥胖組與超重組豐度較低，在偏瘦組中未檢測(cè)到;s_uncultured_Lachnospiraceae_bacterium在偏瘦組中豐度最高，肥胖組與超重組豐度較低，正常組中個(gè)別樣本豐度極高，整體豐度較低;g_Terrisporobacter在肥胖組豐度極高，超重組豐度較高，在正常組、偏瘦組豐度極低;c_Erysipelotrichia與o_Erysipelotrichales在肥胖組豐度較高，超重組、正常組、偏瘦組豐度較低;f_Erysipelotrichaceae在肥胖組豐度最高，其他組中豐度較低;g_Candidatus_Stoquefichus在偏瘦組豐度較高，在肥胖組、超重組、正常組豐度較低;g_Holdemanella在肥胖組豐度較高，正常組豐度較低，超重組與偏瘦組豐度極低;g_Megamonas在肥胖組豐度較高，超重組豐度較低，正常組與偏瘦組豐度極低;s_uncultured_bacterium在肥胖組最高，超重組、正常組與偏瘦組豐度較低;c_Betaproteobacteria在正常組最高，超重組與偏瘦組豐度較低，肥胖組豐度最低;g_Bilophila和s_Bilophila_wadsworthia在偏瘦組豐度最高，正常組豐度較低，肥胖組與超重組豐度極低;o_Pseudomonadales在超重組豐度最高，肥胖組與正常組豐度較低，偏瘦組豐度極低。

3結(jié)論與討論

在菌群構(gòu)成上，豐度最高的是擬桿菌門（Bacteroidetes），其次為厚壁菌門（Firmicutes）、變形菌門（Proteobacteria）、梭桿菌門（Fusobacteria），放線菌門（Actinobacteria），這5個(gè)菌門在腸道微生物群中占據(jù)絕對(duì)優(yōu)勢(shì)。

隨著BMI值的升高，腸道微生物群的多樣性和豐度呈現(xiàn)出差異。豐度數(shù)據(jù)顯示，肥胖組與其他三組，特別是偏瘦組的差異巨大。對(duì)比超重組和正常組發(fā)現(xiàn)，二者具有顯著豐度差異的菌群，大多數(shù)是超重組低于正常組。在菌群構(gòu)成多樣性上，肥胖組中菌群多樣性較低，超重組和正常組差異較小。腸道微生物是一個(gè)動(dòng)態(tài)平衡的系統(tǒng)，系統(tǒng)內(nèi)菌群間的關(guān)聯(lián)較為復(fù)雜，具有一定的自我恢復(fù)能力，因此，超重組人群腸道微生物構(gòu)成的改變可能慢于BMI的提升，更傾向于正常組的腸道微生物構(gòu)成，或者在此階段，腸道微生物的結(jié)構(gòu)變化對(duì)肥胖的發(fā)生影響較小，飲食、運(yùn)動(dòng)等因素對(duì)BMI的影響較大。

LEfSe分析顯示：肥胖組中，Erysipelotrichaceae、Erysipelotrichales、Erysipelotrichia起著重要作用;正常組中，Bifidobacteriales、Cyanobacteria、Betaproteob￣acteria起著重要作用;超重組中，Pseudomonadales起著重要。結(jié)合豐度差異，顯示肥胖與腸道微生物中厚壁菌豐度變化的關(guān)聯(lián)更多在科屬水平，肥胖組種起著重要作用的細(xì)菌屬于厚壁菌門，而門水平上擬桿菌門豐度變化顯著，可能厚壁菌門與擬桿菌門共同作用對(duì)肥胖的影響更大;正常組中，雙歧桿菌發(fā)揮重要作用，維護(hù)腸道。

參考文獻(xiàn)：

[1]TURNBAUGH P J， LEY R E， HAMADY M， et al. The Human Microbiome Project [J]. Nature， 2007， 449 （7164） ： 804-810.

[2]ABUBUCKER S， SEGATA N， GOLL J， et al. Metabolic Reconstruction for Metagenomic Data and Its Application to the Human Microbiome[J]. PLoS computational biology， 2012， 8（6）：e1002358.

[3]HUTTENHOWER C， GEVERS D， KNIGHT R， et al. Structure. function and diversity of the healthy human microbiome[J]. Nature， 2012， 486（7402）：207-214.

[4]CONSORTIUM H M P. A framework for human microbiome research [J]. Nature， 2012， 486（7402）：215-221.

[5]PEEK R M， BLASER M J. Helicobacter pylori and gastrointestinal tract adenocarcinomas[J]. Nature reviews cancer， 2002， 2（1）：28-37.

[6]LEY R E， BACKHED F， TURNBAUGH P， et al. Obesity alters gut microbial ecology[J]. Proceedings of the national academy of sciences of the united states of america， 2005， 102（31）：11070-11075.

[7]TURNBAUGH P J， LEY R E， MAHOWALD M A， et al. An obesity￣associated gut microbiome with increased capacity for energy harvest[J]. Nature， 2006， 444（7122）：1027-1031.

[8]BLASER M J， Chen Y， REIBMAN J. Does Helicobacter pylori protect against asthma and allergy [J]. Gut，2008， 57（5）：561-567.

[9]ZHAN G， CHI￣HONG T， STROBER B E， et al. Substantial Alterations of the Cutaneous Bacterial Biota in Psoriatic Lesions[J]. PLoS one， 2008， 3（7）：e2719.

[10]ISLAMI F， KAMANGAR F. Helicobacter pylori and esophageal cancer risk： a meta￣analysis. Cancer Prev[J]. Res， 2008， 1（5）：329-338.

[11]GARRETT W S， GALLINI C A， YATSUNENKO T， et al. Enterobacteriaceae Act in Concert with the Gut Microbiota to Induce Spontaneous and Maternally Transmitted Colitis[J]. Cell host & microbe， 2010， 8（3）：292-300.