穆姣姣 崔相勇

舒巴坦是一種典型的競(jìng)爭(zhēng)性不可逆的β-內(nèi)酰胺酶抑制劑，與β-內(nèi)酰胺環(huán)類抗生素聯(lián)合應(yīng)用，通過對(duì)酶的抑制，保護(hù)抗生素免受破壞，提高抗菌活性，被廣泛應(yīng)用于醫(yī)療行業(yè)。由于原料奶中的青霉素類抗生素殘留量有限量要求，因此為消除這種青霉素類抗生素殘留，不法商販向原料奶中添加β-內(nèi)酰胺酶來(lái)降解抗生素；而為了逃避質(zhì)檢機(jī)構(gòu)對(duì)β-內(nèi)酰胺酶的檢測(cè)，商販極有可能向原料奶中添加舒巴坦，來(lái)抑制β-內(nèi)酰胺酶活性。為保證乳制品質(zhì)量安全和保障消費(fèi)者的身體健康，建立原料奶中舒巴坦的準(zhǔn)確快速檢測(cè)方法是十分必要的。

本文采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（LC-MS/ MS）來(lái)測(cè)定原料奶中的舒巴坦，沉淀蛋白試劑為甲醇，以乙腈及0.1%甲酸為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，經(jīng)過反相色譜分離后以多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式（MRM）進(jìn)行檢測(cè)。

一、材料和方法

1.儀器。API 4000型三重四極桿質(zhì)譜儀，配有Analysis1.4.2軟件處理系統(tǒng)，美國(guó)Sciex公司；與之聯(lián)用的LC-20A液相色譜儀（包括自動(dòng)進(jìn)樣器、二元輸液泵及柱溫箱），日本島津公司。

2 .藥品及試劑。舒巴坦標(biāo)準(zhǔn)品（含量89.7%），批號(hào)：130430-200906，購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所。實(shí)驗(yàn)室用水為一級(jí)水。甲醇、乙腈為色譜純，其余試劑均為分析純。

3.標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液。精密稱取舒巴坦0.1000g，置于100mL容量瓶中，用水溶解并定容至刻度，作為標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液。此標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液每毫升相當(dāng)于1.0mg舒巴坦。

4.質(zhì)譜條件。儀器配有ESI電噴霧離子化源；離子噴射電壓：-3000V；源溫度：550C；源內(nèi)Gas1壓力：60psi，Gas2壓力：60psi；氣簾氣壓力：15psi；均為氮?dú)狻Ｘ?fù)離子模式檢測(cè)；舒巴坦的碰撞能量（CE）為-20eV，解簇電壓（DP）為-36V；用于定量分析的離子對(duì)為m/z231.8-m/z139.9。

5.色譜條件。色譜柱：Symmetry C18柱，3.5μm，150×2.1mm I.D.，waters公司；流動(dòng)相：B（乙腈）-A（含0.1%甲酸）；進(jìn)樣量：20μL；柱溫：25C；流速：0.3mL/min。梯度洗脫條件：0-1min，5%B；1-3min，5%-98%B；3-4.5min，98%B；4.5-5min，98%-5%B。

6.原料奶樣品的預(yù)處理。稱取原料奶樣品5g（精確至0.01g），加入15mL甲醇，渦旋沉淀蛋白1min；轉(zhuǎn)移并定容于25mL容量瓶中，震蕩1min后，置于超聲波中超聲提取15min；轉(zhuǎn)移至50mL離心管中，10000r/min離心10min；取上清液經(jīng)0.22μm有機(jī)濾膜過濾，取20μL供LC-MS/MS分析。

7.空白原料奶萃取液制備。選擇未添加舒巴坦的原料奶，按步驟6提取，進(jìn)行LC-MS/MS分析，以確定在舒巴坦色譜出峰處不存在干擾。

二、結(jié)果

1.色譜行為和專屬性。按上述步驟6操作，分別制備空白原料奶樣品、空白原料奶加入舒巴坦標(biāo)準(zhǔn)溶液（相當(dāng)于含10μg/kg舒巴坦）進(jìn)行測(cè)試。色譜圖分別見圖1-A和圖1-B，舒巴坦色譜出峰處不存在干擾，內(nèi)源性物質(zhì)不干擾測(cè)定。

2.線性范圍和檢出限。取空白原料奶萃取液，依次加入適量舒巴坦標(biāo)準(zhǔn)系列溶液，配制成相當(dāng)于濃度為2μg/kg、5μg/kg、10μg/kg、20μg/kg、50μg/kg的萃取液，按上述步驟6操作，進(jìn)樣分析；以舒巴坦峰面積為縱坐標(biāo)，舒巴坦?jié)舛葹闄M坐標(biāo)，進(jìn)行回歸運(yùn)算，求得擬合方程為y=4830x-2910，即為標(biāo)準(zhǔn)曲線，相關(guān)系數(shù)為0.9981。由此可見，舒巴坦在2μg/kg-50μg/kg范圍內(nèi)線性良好，方法檢出限為2μg/kg（此時(shí)信噪比S/N=3）。

3.精密度和回收率。制備相當(dāng)于含舒巴坦2μg/kg、10μg/kg、50μg/kg的低、中、高3個(gè)濃度的原料奶樣品，按上述步驟6的操作方法進(jìn)行處理，每濃度六樣本分析，同時(shí)做標(biāo)準(zhǔn)曲線，以當(dāng)時(shí)的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品的測(cè)得濃度，計(jì)算得出本法的精密度與回收率。低、中、高3個(gè)濃度的回收率范圍分別為91.56%-96.1%、93%-98.4%和92.5%-100.2%，均在85%-115%之間；精密度RSD分別為5.4%、3.9%和6.6%，均小于10%。

三、討論

1.質(zhì)譜條件優(yōu)化。（1）將濃度為200ng/mL的舒巴坦標(biāo)準(zhǔn)溶液吸入注射器，置于蠕動(dòng)泵進(jìn)樣器上，設(shè)置蠕動(dòng)泵以25μL/min的速度進(jìn)樣來(lái)優(yōu)化質(zhì)譜條件，使舒巴坦響應(yīng)信號(hào)最高。分別選擇舒巴坦在正、負(fù)兩種離子化模式下進(jìn)行掃描，比較響應(yīng)值，結(jié)果發(fā)現(xiàn)負(fù)離子化效率高于正離子化效率，且負(fù)離子響應(yīng)較為穩(wěn)定，因此使用負(fù)離子掃描模式。（2）經(jīng)過Q1全掃描，發(fā)現(xiàn)m/z231.8的響應(yīng)信號(hào)最高，作為舒巴坦定量分析的母離子，在子離子掃描模式（MS2）下，可得到一些碎片離子，其中m/z139.9響應(yīng)最高，其次是m/z63.9，在MRM掃描模式下，選擇m/z231.8 → m/z139.9用于舒巴坦的定量分析。（3）在蠕動(dòng)泵持續(xù)進(jìn)樣的條件下，對(duì)解簇電壓、碰撞能量、離子源參數(shù)進(jìn)行進(jìn)一步優(yōu)化，使得舒巴坦響應(yīng)值達(dá)到最佳。

2.色譜條件優(yōu)化。為了減少原料奶中內(nèi)源性物質(zhì)對(duì)測(cè)定產(chǎn)生干擾，需將其與舒巴坦進(jìn)行色譜分離，所以需對(duì)色譜條件進(jìn)行選擇及優(yōu)化。在質(zhì)譜分析常用的流動(dòng)相條件下，舒巴坦在小粒徑的C18色譜柱上都可以得到較好的保留，試驗(yàn)中選擇了Symmetry C18柱（3.5μm，150×2.1mmI.D.）。LC-MS/MS反相色譜分析方法中用到的有機(jī)相主要為乙腈和甲醇，選用乙腈作為有機(jī)相時(shí)，舒巴坦的色譜行為較好。為了改善舒巴坦峰形，選擇了0.1%的甲酸作為水相。

3.提取條件的選擇。試驗(yàn)中采用有機(jī)試劑沉淀體系，操作簡(jiǎn)單，考察了甲醇和乙腈作為沉淀試劑的沉淀蛋白效果。采用乙腈作沉淀試劑，在稀釋5倍下能獲得良好的沉淀效果，但舒巴坦峰形較差；采用甲醇作沉淀試劑，沉淀蛋白效果良好，同時(shí)改善了峰形。此外，超聲提取的使用會(huì)提高舒巴坦的提取效率。