陳素傲，金世柱

(哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院消化內(nèi)科，哈爾濱 150081)

潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis，UC)是一種慢性、特發(fā)性炎癥紊亂性疾病，病變通常累及直腸，也可累及結(jié)腸的任何部位。臨床上以持續(xù)的便血、腹痛、里急后重為典型癥狀[1]。近20年來(lái)，其發(fā)病率逐漸增加[2-3]。其發(fā)病機(jī)制尚不明確，遺傳因素、環(huán)境因素、微生物因素及腸道免疫系統(tǒng)分子成分等可能促成了疾病的發(fā)生和發(fā)展[4]。目前，多種造模方法可用于誘導(dǎo)UC動(dòng)物模型，如化學(xué)法、免疫復(fù)合法、基因法、中醫(yī)模型等[5-6]，各種造模方法均有其不同特點(diǎn)(見(jiàn)表1)。其中，化學(xué)法中葡聚糖硫酸鈉(Dextran Sodium Sulfate，DSS)誘導(dǎo)的UC模型因與人類潰瘍性結(jié)腸炎表現(xiàn)最相似被廣泛應(yīng)用[7-8]。本文對(duì)近年來(lái)DSS誘導(dǎo)UC動(dòng)物模型的最新研究進(jìn)展做一概述。

1 DSS致潰瘍性結(jié)腸炎作用機(jī)制

DSS是一種水溶性硫酸多糖體，對(duì)腸道上皮細(xì)胞具有直接毒性作用，破壞腸道屏障完整性，導(dǎo)致急性結(jié)腸炎的發(fā)生，表現(xiàn)為直腸出血、腹瀉、潰瘍和粒細(xì)胞浸潤(rùn)，和人類潰瘍性結(jié)腸炎臨床和組織學(xué)表現(xiàn)相似[9]。DSS不僅能直接損傷上皮細(xì)胞，還能改變結(jié)腸黏液層菌群變化，致使腸內(nèi)細(xì)菌更易進(jìn)入上皮細(xì)胞造成上皮損傷[10]。DSS能使結(jié)腸緊密連接蛋白和緊密連接相關(guān)蛋白o(hù)ccludin、Zo-1表達(dá)下降，破壞結(jié)腸黏膜屏障緊密性從而導(dǎo)致潰瘍性結(jié)腸炎的發(fā)生[11]。DSS誘導(dǎo)UC模型還可能與DSS具有肝素樣作用，能抑制血液凝固、血小板聚集和增強(qiáng)纖維蛋白溶解的作用及結(jié)腸黏膜組織缺氧有關(guān)[12-13]。DSS誘導(dǎo)UC的發(fā)生還與腸道菌群的失衡有關(guān)。DSS可降低腸道菌群多樣性和豐富性，降低菌群穩(wěn)定性，從而導(dǎo)致腸道菌群失調(diào)。乳酸桿菌、雙歧桿菌等菌群對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎有保護(hù)作用，而大腸桿菌對(duì)UC的發(fā)生發(fā)展有促進(jìn)作用[14-16]。此外，DSS誘導(dǎo)UC的發(fā)生發(fā)展與炎癥因子表達(dá)失衡密切相關(guān)。促炎因子如TNF-α、IL-1β、IL-6等的表達(dá)增加和抑炎因子如IL-4、IL-10等表達(dá)下降促進(jìn)結(jié)腸損傷從而誘導(dǎo)潰瘍性結(jié)腸炎的發(fā)生發(fā)展[17-18]。最后，RhoA/ROCK信號(hào)通路、AKT2信號(hào)通路及NF-кB等信號(hào)通路的異常也是DSS誘導(dǎo)結(jié)腸炎發(fā)生的重要機(jī)制之一[19-21]。

表1 不同造模方法比較Table 1 Comparison of different Murine model

2 DSS誘導(dǎo)潰瘍性結(jié)腸炎模型

DSS誘導(dǎo)鼠潰瘍性結(jié)腸炎模型因其操作簡(jiǎn)便、成功率高等優(yōu)點(diǎn)被廣泛應(yīng)用。根據(jù)不同的實(shí)驗(yàn)?zāi)康?，研究人員可選擇不同的造模方法制成急性或慢性UC模型。急性UC模型通常采用2%～5% DSS(分子量36×103～50×103)溶液，飲用5～7 d的方法制成。如Nunes等[22]給予C57BL/6小鼠2% DSS溶液自由飲用7 d誘導(dǎo)急性UC模型；Jin等[23]給予C57BL/6小鼠2.5% DSS溶液自由飲用7 d誘導(dǎo)急性UC模型。處理7 d后，小鼠出現(xiàn)明顯的結(jié)腸炎癥狀，包括顯著的腹瀉、便血，體重下降，結(jié)腸縮短，疾病活動(dòng)指數(shù)評(píng)分和組織學(xué)評(píng)分的增加。結(jié)腸損傷相關(guān)的炎癥因子如TNF-α、iNOS、COX-2、MPO等表達(dá)增加。慢性UC模型則通過(guò)反復(fù)周期性給予DSS溶液誘導(dǎo)結(jié)腸炎模型。如葛君等[24]給予C57BL/6小鼠自由飲用1.5% DSS溶液4個(gè)周期，第一周期給予7 d DSS溶液，10 d蒸餾水，之后的三個(gè)周期分別給予5 d DSS溶液和蒸餾水，共47 d來(lái)誘導(dǎo)慢性UC模型；Ajayi等[25]給予BALB/c小鼠自由飲用2.5% DSS溶液3個(gè)周期，每個(gè)周期包括2.5% DSS溶液自由飲用7 d，隨后換成14 d正常飲用水來(lái)誘導(dǎo)慢性UC模型。Zhang等[26]給予C57BL/6小鼠2% DSS溶液5 d共三個(gè)周期，間隔2個(gè)14 d期間給予正常飲用水成功建立慢性UC模型。誘導(dǎo)成功后，小鼠出現(xiàn)便血、體重下降，結(jié)腸長(zhǎng)度縮短等表現(xiàn)，病理提示隱窩萎縮、扭曲等結(jié)構(gòu)改變，腸壁出現(xiàn)淋巴細(xì)胞、漿細(xì)胞等炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，腸壁變薄等慢性炎癥改變。相應(yīng)的，TNF-α、IL-1β、MPO等表達(dá)增加。

3 DSS誘導(dǎo)潰瘍性結(jié)腸炎影響因素

DSS誘導(dǎo)潰瘍性結(jié)腸炎模型受多種因素影響，如DSS分子量、DSS濃度、DSS給藥時(shí)間及給藥方式等，選擇適合的藥物濃度、給藥方式及給藥時(shí)間等有助于節(jié)省時(shí)間、人力，從而有助于建立高成功率的UC模型。

3.1 DSS分子量

DSS具有高度可變的分子量，分子量不同誘導(dǎo)潰瘍性結(jié)腸炎模型的炎癥程度不同，其中，分子量36 000～50 000的DSS最適合用來(lái)誘導(dǎo)結(jié)腸炎，因?yàn)槠渌问降腄SS不能誘導(dǎo)可重復(fù)的結(jié)腸炎，或?qū)е赂咚劳雎?。Kitajima等[27]給予BALB/c小鼠三種不同分子量的5% DSS(5×103，40×103，500×103)溶液自由飲用7 d誘導(dǎo)結(jié)腸炎模型。分子量為5×103和40×103DSS處理組小鼠出現(xiàn)結(jié)腸炎，表現(xiàn)為隱窩消失，黏膜層和黏膜下層炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，黏膜水腫、糜爛和潰瘍形成。而分子量為500×103的DSS處理組小鼠無(wú)上述表現(xiàn)。而分子量5×103和40×103所導(dǎo)致的結(jié)腸炎又有所不同，后者誘導(dǎo)的結(jié)腸炎表現(xiàn)相比于前者較重，分子量5×103的DSS導(dǎo)致的結(jié)腸炎病變主要集中在盲腸及近段結(jié)腸，而分子量40×103的DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎病變主要在遠(yuǎn)端結(jié)腸。分子量為500×103的DSS誘導(dǎo)小鼠無(wú)結(jié)腸炎表現(xiàn)可能由于分子量過(guò)大不能通過(guò)黏膜層而不能發(fā)揮作用有關(guān)。Hirono等[28]證實(shí)不同DSS分子量有不同的結(jié)腸致癌活性，分子量為54 000的2.5% DSS飲食處理大鼠致癌活性最高，而分子量為52 000和9500的DSS無(wú)明顯致癌活性。另外，研究發(fā)現(xiàn)相同分子量的DSS含硫量不同誘導(dǎo)的結(jié)腸炎模型嚴(yán)重程度也不同[29]。

3.2 DSS濃度

不同DSS濃度誘導(dǎo)的潰瘍性結(jié)腸炎嚴(yán)重程度不同，正確選擇DSS濃度是UC模型成功的關(guān)鍵。顧思臻等[30]給予C57BL/6J小鼠自由飲用不同DSS濃度溶液(3%、4%、5%)6 d來(lái)建立潰瘍性結(jié)腸炎模型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)各組小鼠均有體重下降、便血、黏膜層及黏膜下層炎癥浸潤(rùn)和IL-1β、TNF-α表達(dá)增加等結(jié)腸炎表現(xiàn)，以4% DSS組表現(xiàn)最典型，死亡率低，是DSS誘導(dǎo)小鼠UC模型的最佳方案。王倩等[31]分別用2種質(zhì)量濃度DSS溶液(30 g/L、50 g/L)建立SD大鼠UC模型，大鼠自由飲用DSS溶液7 d后，觀察大鼠一般狀態(tài)，對(duì)疾病活動(dòng)指數(shù)(DAI)和結(jié)腸損傷指數(shù)(CMDI)進(jìn)行評(píng)估。結(jié)果顯示，與DSS低濃度組相比，DSS高濃度組DAI評(píng)分和CMDI評(píng)分增加，潰瘍性結(jié)腸炎表現(xiàn)更加明顯，但鑒于30g/L DSS即可誘發(fā)急性UC模型，因此認(rèn)為30 g/L DSS更適合用來(lái)誘導(dǎo)大鼠UC模型。Shimizu等[32]給予斷奶Wistar幼鼠不同濃度DSS溶液(2%、3%、4%)自由飲用7 d誘導(dǎo)結(jié)腸炎模型。結(jié)果表明，隨給藥濃度的增加，結(jié)腸炎表現(xiàn)更明顯，嚴(yán)重程度增加。因此，可以選擇不同濃度DSS作為兒童不同程度結(jié)腸炎模型。2% DSS溶液可用來(lái)制作兒童輕度UC模型；3% DSS溶液用作中度UC模型；4% DSS溶液用來(lái)作為重度UC模型。Egger等[33]給予BALB/c小鼠自由飲用不同濃度DSS溶液(2.5%、5%、7.5%)7 d誘導(dǎo)結(jié)腸炎模型，評(píng)估結(jié)腸粘膜損傷和炎癥因子表達(dá)情況。研究證實(shí)隨DSS濃度增加，結(jié)腸損傷嚴(yán)重程度增加，而結(jié)腸黏膜損傷程度取決于飲用水中DSS濃度，并不是攝入的DSS總劑量。李欣等[34]給予雄性C57BL/6J小鼠不同濃度DSS溶液(3%、5%、7%)飲用6 d，觀察小鼠一般情況及結(jié)腸損傷情況，檢測(cè)炎癥因子表達(dá)，結(jié)果表明隨著DSS濃度的增加，小鼠成模率增加，TNF-α、IF-17等促炎因子增加，抑炎因子IF-4、IF-10等表達(dá)下降，小鼠死亡率增加。

3.3 DSS給藥時(shí)間

隨著DSS給藥時(shí)間的延長(zhǎng)，潰瘍性結(jié)腸炎表現(xiàn)更嚴(yán)重，給藥時(shí)間的長(zhǎng)短決定了潰瘍性結(jié)腸炎的急慢性過(guò)程，因此DSS給藥時(shí)間的長(zhǎng)短對(duì)建立UC模型至關(guān)重要。李富鳳等[35]給予C57BL/6小鼠自由飲用3% DSS溶液1周，再恢復(fù)正常飲水3周建立UC模型，分別于1、2、3、4周4個(gè)時(shí)間點(diǎn)動(dòng)態(tài)觀察小鼠表現(xiàn)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同時(shí)間段，小鼠結(jié)腸炎表現(xiàn)不同。造模1周后，小鼠體重下降、便血、腹瀉，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)粘膜層，符合UC模型急性期表現(xiàn)；造模2周后，小鼠整體表現(xiàn)有所改善，病理示漿細(xì)胞、淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)肌層組織，炎癥因子進(jìn)一步增高，符合炎癥后期表現(xiàn)；造模3、4周后，肌層纖維結(jié)構(gòu)紊亂，炎癥評(píng)分下降，符合UC緩解期表現(xiàn)。Oishi等[36]通過(guò)給予Wistar大鼠自由飲用5% DSS溶液5 d(急性期)，接著給予2% DSS溶液10 d(慢性期)來(lái)誘導(dǎo)結(jié)腸炎模型。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著給藥時(shí)間的增加，結(jié)腸損傷程度不同。誘導(dǎo)4～6 d時(shí)被認(rèn)為是結(jié)腸炎損傷最嚴(yán)重的時(shí)期，疾病活動(dòng)指數(shù)評(píng)分最高，相應(yīng)炎癥因子TNF-α、iNOS、IL-6 mRNA及中性粒細(xì)胞趨化因子-1等表達(dá)最高。Yan等[37]通過(guò)在預(yù)定時(shí)間給予C57BL/6小鼠自由飲用3.5% DSS溶液建立結(jié)腸炎模型。實(shí)驗(yàn)觀察到隨著DSS給藥時(shí)間的延長(zhǎng)，結(jié)腸炎表現(xiàn)逐漸加重，而撤回DSS溶液，小鼠結(jié)腸炎模型會(huì)逐漸恢復(fù)。DSS給藥時(shí)間的不同引起不同的結(jié)腸炎表現(xiàn)，因此，研究人員可根據(jù)不同的實(shí)驗(yàn)?zāi)康倪x擇不同的給藥時(shí)間，從而構(gòu)建理想的UC模型。

3.4 DSS給藥方式

目前DSS誘導(dǎo)UC模型的主要給藥方式為自由飲用，也有一些研究者采用灌胃的方式誘導(dǎo)UC模型。如黃循銣等[38]給ICR小鼠通過(guò)灌胃方式給予2.5% DSS溶液容易成功誘導(dǎo)結(jié)腸炎模型。衡宇等[39]探討了DSS自由飲用與灌胃2種給藥方式誘導(dǎo)UC模型疾病相關(guān)指標(biāo)的差異。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，自由飲用與灌胃2種給藥方式均可誘導(dǎo)UC模型，但自由飲用的方式無(wú)法控制鼠攝入DSS總劑量，容易出現(xiàn)實(shí)驗(yàn)誤差，而灌胃組小鼠動(dòng)物表現(xiàn)更均一，各項(xiàng)指標(biāo)的變異系數(shù)小，離散度低，實(shí)驗(yàn)成本低，是最佳的給藥方式。

3.5 動(dòng)物種系

不同種系、不同部位對(duì)DSS誘導(dǎo)潰瘍性結(jié)腸炎敏感程度不同。M?hler等[40]給予不同種系小鼠自由飲用3.5% DSS溶液5 d誘導(dǎo)結(jié)腸炎模型。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，C3H/HeJBir，C3H/HeJ，NOD/LtJ，NOD-scid小鼠對(duì)DSS誘導(dǎo)結(jié)腸炎高度敏感，病變集中在盲腸和遠(yuǎn)端結(jié)腸，而NON/LtJ和NON.H2g7有一定耐受性。C57BL/6J和129/SvPas小鼠的結(jié)腸對(duì)DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎敏感，病變主要集中在中段和遠(yuǎn)端結(jié)腸，而盲腸有高度耐受性。這些不同表現(xiàn)可能與遺傳變異有關(guān)。

4 結(jié)語(yǔ)

DSS誘導(dǎo)的UC模型因其與人類UC表現(xiàn)最為相似，所以得到更廣泛的應(yīng)用。了解DSS致潰瘍性結(jié)腸炎作用機(jī)制及造模過(guò)程中的相關(guān)影響因素，研究者可以根據(jù)不同實(shí)驗(yàn)?zāi)康倪x擇相應(yīng)的種系、DSS濃度、給藥方式及給藥時(shí)間，有利于提高造模效率，建立高成功率的UC模型，從而為UC發(fā)病機(jī)制及相關(guān)治療等研究奠定基礎(chǔ)。