史會娟，孔令玉，吳忠冰，趙 楊，石冬璇，李 晶，3*

(1.河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院，河北省腫瘤醫(yī)院，石家莊 050011；2.河北醫(yī)科大學(xué)研究生學(xué)院，石家莊 050011；3.河北醫(yī)科大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院，石家莊 050011)

食管癌是一種常見的惡性消化道腫瘤，我國是世界上食管癌發(fā)病率和死亡率最高的國家[1]。轉(zhuǎn)移的發(fā)生是導(dǎo)致食管癌治療失敗和患者死亡的主要原因[2]，我國食管癌患者的5年生存率僅為20.9%[3]。因此，尋求抑制食管癌轉(zhuǎn)移的有效方法是擺在我們面前的重要課題。

食管癌在癥狀上歸屬中醫(yī)“噎膈”范疇，前期實驗證實應(yīng)用“甘潤濡養(yǎng)”之法能夠明顯抑制食管癌細(xì)胞的遷移及侵襲[4-8]。四物飲以“甘潤濡養(yǎng)”立法，由四物湯合五汁安中飲化裁而成。

四物湯記載于唐代《仙授理傷續(xù)斷秘方》，是中醫(yī)補血、養(yǎng)血的經(jīng)典方藥，《醫(yī)學(xué)正傳》《景岳全書》《脈因證治》等中醫(yī)論著中多次提到四物湯對噎膈的治療作用。五汁安中飲出自《新增湯頭歌訣》引張任候方，主治噎膈，胸膈痞滿隱痛。

因為體外實驗更快速，可重復(fù)性更好，所以近年來體外實驗被越來越多地用于中藥制劑的毒理及藥物機制研究[9-10]。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

高分化人食管癌細(xì)胞Eca109購自上?？茖W(xué)院細(xì)胞生物學(xué)研究所，待穩(wěn)定傳代后用于實驗。

1.2 主要試劑與儀器

RPMI 1640培養(yǎng)基(貨號∶C11875500BT)購于美國Gibco公司；新生牛血清(貨號∶04-102-1B)購自美國Biological公司；熒光標(biāo)記鬼筆環(huán)肽(Phalloidin-FITC貨號∶A12379，批號∶1456973)購于美國Molecular Probes公司；單道可整支消毒移液器購自德國Eppendorf公司；IncuCyte S3活細(xì)胞動態(tài)成像與分析系統(tǒng)購于美國Essen BioScience公司；激光共聚焦顯微鏡(型號∶OLS4500)購于日本Olympus公司；Transwell小室(貨號∶3422)購于美國Corning公司。藥材購自河北省石家莊市樂仁堂，批號為190701，經(jīng)河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院藥劑科陳欣然副教授鑒定為正品，韭、姜、白梨、藕購于石家莊北國超市，牛乳購于內(nèi)蒙古蒙牛乳業(yè)(集團)股份有限公司，產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)號GB25109；竹瀝購于江西民濟藥業(yè)有限公司，批號為Z36021948。

1.3 實驗方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)

人食管癌細(xì)胞株Eca109用含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基，在37℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的飽和濕度恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每3 d換液1次，倒置顯微鏡下觀察待細(xì)胞貼壁生長至融合度達90%時，用0.25%胰蛋白酶消化并傳代，2～6代細(xì)胞進行實驗。

1.3.2 四物飲提取物制備

四物飲組成:當(dāng)歸10 g、白芍10 g、熟地20 g、川芎10 g、韭汁10 mL、姜汁10 mL、竹瀝10 mL、威靈仙10 g、牛乳60 mL、梨汁10 mL、藕汁10 mL。

當(dāng)歸、白芍、熟地、川芎、威靈仙加1000 mL蒸餾水浸泡30 min，加熱煮沸后，轉(zhuǎn)小火煮1 h，趁熱過濾，藥渣再加1000 mL蒸餾水加熱，沸后轉(zhuǎn)小火煮1 h，趁熱過濾，合并2次煎出液，韭、姜、白梨、藕榨汁，加入藥汁中，將牛乳及鮮竹瀝加入藥汁，離心，取上清。45℃旋蒸，至藥物濃稠，-80℃冰箱凍24 h，凍干機凍干，取凍干粉。凍干粉分裝并儲存于-80℃冰箱，應(yīng)用時用完全培養(yǎng)基配置1 mg/mL儲存液，并用濾器過濾，保存于無菌離心管中，用封口膜封口，儲存于4℃冰箱備用。依據(jù)各組加藥濃度不同再用完全培基(含10%胎牛血清的RPMI 1640)倍比稀釋。

1.3.3 細(xì)胞分組

培養(yǎng)細(xì)胞，依據(jù)前期實驗經(jīng)驗確定細(xì)胞濃度及藥物濃度[4-8]，待細(xì)胞貼壁生長至融合度達60%時，采用600μg/mL、300μg/mL、150μg/mL、70μg/mL和30μg/mL濃度的四物飲分別作用Eca109細(xì)胞24 h，并設(shè)未處理的細(xì)胞為對照組。

1.3.4 S3劃痕實驗

使用IncuCyte S3活細(xì)胞動態(tài)成像與分析系統(tǒng)評估細(xì)胞遷移。

IncuCyte S3活細(xì)胞動態(tài)成像與分析系統(tǒng)可高通量、非傷害的長時間實時動態(tài)觀察活細(xì)胞，并自動收集每個時間點的圖像。在劃痕實驗中除了可以得到圖像外，還可得到由系統(tǒng)軟件自動依據(jù)飽和度和計數(shù)分析生成的相對傷口密度與時間圖表。

應(yīng)用IncuCyte S3活細(xì)胞動態(tài)成像與分析系統(tǒng)完成劃痕實驗，觀察各劑量四物飲對食管癌細(xì)胞遷移能力的影響，用IncuCyte軟件評估劃痕閉合率，用相對傷口密度(%)與時間圖表表示，篩選四物飲抑制食管癌細(xì)胞遷移的有效劑量。

依據(jù)前期實驗經(jīng)驗確定細(xì)胞濃度[6]，4×103Eca109細(xì)胞/孔接種在96孔培養(yǎng)板中，并在37℃，5% CO2的RPMI1640完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h。然后用劃痕器進行劃痕。用培養(yǎng)基清洗細(xì)胞2次，不同濃度的四物飲(30、70、150、300、600μg/mL)干預(yù)細(xì)胞，對照組細(xì)胞不加干預(yù)。細(xì)胞培養(yǎng)板被放在IncuCyte S3活細(xì)胞動態(tài)成像與分析系統(tǒng)和劃痕區(qū)域的圖像(10×倍放大)每1 h記錄。顯微鏡下測量劃痕的寬度，以0 h劃痕寬度為標(biāo)準(zhǔn)對照。劃痕寬度越大，表明細(xì)胞遷移能力越弱。實驗重復(fù)3次。

因為本實驗篩選四物飲抑制食管癌Eca109細(xì)胞遷移最佳濃度為150μg/mL，故之后細(xì)胞功能實驗均采用150μg/mL濃度。

1.3.5 Transwell測細(xì)胞侵襲

采用Transwell系統(tǒng)檢測腫瘤細(xì)胞侵襲能力。

四物飲組用四物飲150μg/mL干預(yù)細(xì)胞24 h。用預(yù)冷后的槍頭將過夜液化的Matrigel人工基質(zhì)膠(1.5 mg/mL；美國BD生物科學(xué))與4℃預(yù)冷的無血清培養(yǎng)基1∶4比例混合，每個Transwell小室的上室均勻鋪入40μL稀釋過的Matrigel膠，此步操作均在冰上進行。將鋪好膠的小室放入恒溫培養(yǎng)箱1 h使膠固化。參考文獻[4]，將不含牛清的細(xì)胞(1×105/mL)加到Transwell小室的上室和0.5 mL含有牛清的培養(yǎng)基放在Transwell小室的下室。在37℃，5%的二氧化碳孵育過夜。用棉簽輕輕從上室刮下細(xì)胞。將Transwell小室放入新板，將附著內(nèi)容的上室和附著細(xì)胞的下室表面用4%多聚甲醛固定20 min，用結(jié)晶紫染色30 min。用PBS沖洗后，在顯微鏡下拍攝細(xì)胞。實驗重復(fù)3次。

1.3.6 激光共聚焦顯微鏡觀察鬼筆環(huán)肽標(biāo)記細(xì)胞微絲骨架

FITC標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽可特異的與細(xì)胞微絲結(jié)合，從而顯示微絲骨架在細(xì)胞中的分布，因此可應(yīng)用鬼筆環(huán)肽標(biāo)記觀察食管癌細(xì)胞的形態(tài)。細(xì)胞微絲在細(xì)胞的變形運動中起著關(guān)鍵的作用，上皮細(xì)胞間質(zhì)化(epithelial to mesenchy-mal transition，EMT)時，偽足由細(xì)胞膜伸出，以此獲得運動的能力。

依據(jù)前期實驗經(jīng)驗確定細(xì)胞濃度[7]，將1×106食管癌細(xì)胞Eca109接種于24孔板，待細(xì)胞貼壁后四物飲組用150μg/mL的四物飲作用細(xì)胞24 h，對照組不予干預(yù)，每組3個復(fù)孔。將細(xì)胞用PBS洗3次，每次5 min。用1 mL 4%多聚甲醛室溫固定20 min，然后1 mL 0.3% TRIton X-100室溫透膜10 min，再以PBS洗3次，每次5 min。1 mL 10%BSA室溫封閉30 min。加入2% BSA 1∶100稀釋的鬼筆環(huán)肽(phalloidin-FITC)，4℃過夜。用含0.1%Tween 20的PBS洗滌3次，每次5 min。PBS洗滌1次，5 min，甘油封片。應(yīng)用激光共聚焦顯微鏡觀察結(jié)果，采集圖像。實驗重復(fù)3次。

1.3.7 RNA-Seq測序及信息分析

四物飲組細(xì)胞用四物飲150μg/mL干預(yù)24 h，分別收集兩組細(xì)胞，提取總RNA。測OD值，-80℃保存?zhèn)溆?。測序文庫構(gòu)建:使用oligo dT微珠純化mRNA，使其片段化處理，反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成雙鏈cDNA。雙鏈DNA末端修復(fù)及3’末端加‘A’，使用特定的測序接頭連接DNA片段兩端，高保真聚合酶擴增構(gòu)建成功測序文庫，DNA成簇(Cluster)擴增后進行高通量測序。實驗重復(fù)3次。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 22.0統(tǒng)計學(xué)軟件對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。所有實驗均重復(fù)3次以上。計量資料符合正態(tài)分布以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，兩組間比較采用兩獨立樣本t檢驗；多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析；計數(shù)資料采用χ2檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞生長情況

倒置顯微鏡下觀察Eca109細(xì)胞生長情況:細(xì)胞形態(tài)不一，多呈卵圓形，貼壁生長，細(xì)胞間連接緊密，傳代時間約為72 h。

2.2 應(yīng)用IncuCyte Zoom觀察四物飲對細(xì)胞遷移的影響以篩選藥物濃度

用IncuCyte軟件評估劃痕閉合率，從相對傷口密度(%)與時間圖中可以看出，不同濃度的四物飲均能夠抑制食管癌細(xì)胞遷移，但當(dāng)四物飲濃度為150μg/mL時抑制細(xì)胞遷移效果最好(P＜0.05)，因此，四物飲抑制食管癌細(xì)胞遷移的有效濃度為150μg/mL，見圖1。

注:四物飲濃度為150μg/mL時對食管癌細(xì)胞Eca109的遷移能力抑制最強。圖1 應(yīng)用IncuCyte Zoom觀察四物飲對食管癌細(xì)胞遷移的影響Note.Siwuyin concentration was 150μg/mL，it had the strongest inhibition on the migration of esophageal cancer cell line Eca109.Figure 1 The effect of Siwuyin on the migration of esophageal cancer cells was observed by incucyte zoom

2.3 劃痕實驗觀察四物飲對細(xì)胞遷移的影響

從IncuCyte Zoom系統(tǒng)記錄的大量圖像中提取對照組、四物飲70μg/mL組、四物飲150μg/mL組圖像進行分析，發(fā)現(xiàn)在20 h對照組細(xì)胞劃痕寬度基本為0，故以20 h為結(jié)束時間。

顯微鏡下測量劃痕的寬度，以0 h劃痕寬度為標(biāo)準(zhǔn)對照100%，取所測量時刻的劃痕寬度與0 h劃痕寬度比值的百分?jǐn)?shù)，所測量時刻劃痕寬度越大，則百分?jǐn)?shù)數(shù)值越大，表明細(xì)胞遷移能力越弱。結(jié)果表明當(dāng)四物飲濃度為150μg/mL時，細(xì)胞遷移能力最低(P＜0.05)，見圖2、表1。

表1 IncuCyte Zoom測量食管癌細(xì)胞Eca109的遷移(每小時劃痕寬度%，n＝3)Table 1 Migration of Eca109 cells was measured by incucyte zoom (scratch width/hour scratch width)

2.4 應(yīng)用Transwell觀察四物飲對細(xì)胞侵襲的影響

四物飲組(150μg/mL)與對照組相比，四物飲組細(xì)胞穿過Transwell小室的數(shù)量明顯減少(P＜0.05)。結(jié)果表明，四物飲150μg/mL時能夠明顯抑制食管癌細(xì)胞侵襲，見圖3、表2。

表2 四物飲對食管癌細(xì)胞遷移的影響Table 2 The effect of Siwuyin on the migration of esophageal cancer cells

2.5 激光共聚焦顯微鏡觀察四物飲對細(xì)胞微絲骨架的影響

與對照組相比，經(jīng)150μg/mL四物飲干預(yù)后細(xì)胞微絲排列更加有序，細(xì)胞膜上偽足也伸出更少，證實四物飲能夠明顯抑制食管癌細(xì)胞EMT，見圖4。

2.6 應(yīng)用RNA-Seq測序及信息分析明確四物飲對食管癌細(xì)胞RNA的影響

應(yīng)用RNA-Seq測序進一步明確四物飲干預(yù)后食管癌細(xì)胞中RNA的改變，并通過信息分析明確四物飲主要干預(yù)的信號傳導(dǎo)通路，從而初步明確四物飲抑制食管癌細(xì)胞遷移及侵襲的機制。

RNA-Seq檢測經(jīng)150μg/mL四物飲干預(yù)后食管癌細(xì)胞RNA變化，結(jié)果顯示，與對照組相較，四物飲組食管癌細(xì)胞中丙氨酸，天門冬氨酸和谷氨酸代謝通路明顯改變，而其作用點主要在抑制延胡索酸生成上，見圖5。

注:IncuCyte Zoom系統(tǒng)中記錄對照組、四物飲70μg/mL組、四物飲150μg/mL組分別于0 h、10 h、20 h圖像。如圖可見，當(dāng)四物飲濃度為150μg/mL時，細(xì)胞遷移能力最低。圖2 應(yīng)用IncuCyte Zoom觀察四物飲對食管癌細(xì)胞遷移的影響Note.The images of the control group，Siwuyin 70μg/mL group and Siwuyin 150μg/mL group were recorded in the incucyte zoom system at 0，10 and 20 hours respectively.As shown in the figure，when Siwuyin concentration is 150μg/mL，the cell migration ability is the lowest.Figure 2 The effect of siwuyin on the migration of esophageal cancer cells was observed by incucyte zoom

注:經(jīng)四物飲干預(yù)后食管癌細(xì)胞穿過小室的細(xì)胞數(shù)明顯減少。圖3 應(yīng)用Transwell觀察四物飲對細(xì)胞侵襲的影響Note.The number of cells passing through the transwell of esophageal cancer cells decreased significantly after Siwuyin treatment.Figure 3 Transwell was used to observe the effect of Siwuyin on Eca109 cells invasion

注:經(jīng)四物飲作用后細(xì)胞微絲排列的同向性增強，微絲排列規(guī)律，而對照組細(xì)胞中微絲排列雜亂無章。圖4 激光共聚焦顯微鏡觀察四物飲對食管癌細(xì)胞Eca109中微絲排列的影響(油鏡)Note.Siwuyin group，the arrangement of microfilaments was enhanced in the same direction.Control group，the arrangement of microfilaments was disordered.Figure 4 Laser confocal microscopy was used to observe the effect of Siwuyin on the arrangement of microfilaments in Eca109 cells(oil mirror)

注:A:RNA-seq測食管癌細(xì)胞株Eca109經(jīng)四物飲(150μg/mL)作用后變化，結(jié)果顯示:丙氨酸，天門冬氨酸和谷氨酸代謝通路被抑制。B:四物飲干預(yù)后中改變的RNA。C:丙氨酸，天門冬氨酸和谷氨酸代謝通路。圖中綠色標(biāo)記顯示經(jīng)四物飲作用后明顯降低的RNA，其中3.4.17.21、3.5.1.15、6.3.4.4分別為葉酸水解酶1(folate hydrolase 1，F(xiàn)OLH1)、天門冬氨酸酶(asparaginase，ASPA)、腺苷琥珀酸合成酶(adenosine succinate synthetase，ADSS)。圖5 應(yīng)用RNA-Seq測序明確四物飲對食管癌細(xì)胞RNA的影響Note.A，RNA-seq was used to detect the changes of esophageal cancer cell line Eca109 after treated with Siwuyin(150μg/mL).The results showed that the alanine，aspartic acid and glutamate pathway was inhibited.B，RNA changed after Siwuyin intervention.C，The alanine，aspartic acid and glutamate pathway.The green marker in the figure shows the significantly reduced RNA after Siwuyin treatment，among which 3.4.17.21，3.5.1.15 and 6.3.4.4 are FOLH1，ASPA and ADSS respectively.Figure 5 RNA-seq was used to determine the effect of Siwuyin on the RNA of esophageal cancer cells

3 討論

食管癌就其臨床表現(xiàn)而言歸屬于中醫(yī)“噎膈”范疇。本課題組應(yīng)用“甘潤濡養(yǎng)”之法防治食管癌轉(zhuǎn)移，取得了一定的成果[4-8]。

四物湯由當(dāng)歸、川芎、白芍、熟地黃四味藥材組成，藁本內(nèi)酯(ligustilide)，正丁烯基酜內(nèi)酯(butylidene phthalide)，川芎內(nèi)酯(senkyunolide)，阿魏酸(ferulic acid)，沒食子酸(gallic acid)，芍藥苷(peoniflorin)，焦地黃素A(jioglutin A)，梓醇(catalpol)是該方主要活性成分，四物湯類方能夠干預(yù)多種惡性腫瘤[11]，但在食管癌方面沒有相關(guān)報道。

本次實驗證實四物飲能夠明顯抑制食管癌細(xì)胞微絲骨架重排，使食管癌細(xì)胞微絲排列更規(guī)整，并減少偽足伸出，從而抑制食管癌的遷移能力，進一步抑制食管癌細(xì)胞EMT。為進一步明確四物飲的作用機制，我們對四物飲干預(yù)的食管癌細(xì)胞及對照組細(xì)胞給予RNA-Seq測序，結(jié)果顯示，經(jīng)四物飲干預(yù)后食管癌細(xì)胞中丙氨酸，天門冬氨酸和谷氨酸代謝通路明顯改變。通路中葉酸水解酶1(folate hydrolase 1，F(xiàn)OLH1)，天門冬氨酸酶(asparaginase，ASPA)，腺苷琥珀酸合成酶(adenosine succinate synthetase，ADSS)的表達明顯降低，從而抑制了延胡索酸的生成。

延胡索酸在三羧酸循環(huán)中通常作為一種中間產(chǎn)物，被細(xì)胞用來產(chǎn)生能量。大量研究顯示延胡索酸水合酶(fumarate hydratase，F(xiàn)H)的缺乏導(dǎo)致延胡索酸堆積，促進了腫瘤細(xì)胞EMT的發(fā)生[12-13]。英國劍橋大學(xué)的研究人員向FH正常的腎上皮細(xì)胞中加入可滲入細(xì)胞的延胡索酸之后，細(xì)胞仍舊發(fā)生了EMT，證實了FH的缺失可能并不能直接導(dǎo)致腫瘤轉(zhuǎn)移，而是延胡索酸堆積直接加速了腫瘤轉(zhuǎn)移的出現(xiàn)[14]。本次實驗證實四物飲能夠抑制延胡索酸的生成，這可能是抑制食管癌轉(zhuǎn)移的機制所在。

綜上所述，四物飲能夠改變食管癌細(xì)胞中丙氨酸，天門冬氨酸和谷氨酸代謝通路，抑制延胡索酸生成，從而抑制食管癌細(xì)胞EMT的發(fā)生，進而抑制食管癌細(xì)胞侵襲及遷移能力。