黃冠明，郭 香，祁劍飛，寧 岳，巫旗生，王曉清*，曾志南*，朱禮艷

1. 湖南農業(yè)大學動物科學技術學院，湖南 長沙 410128 2. 福建省水產研究所，福建 廈門 361013 3. 福建安井食品股份有限公司中心實驗室，福建 廈門 361028

引 言

葡萄牙牡蠣(Crassostreaangulata)又名福建牡蠣，屬軟體動物門(Mollusca)、雙殼綱(Bivalvia)、珍珠貝目(Pterioida)、牡蠣科(Ostreidae)、巨蠣屬(Crassostrea)，其食物鏈較短、生長迅速、產量高，且經濟效益好[1]，是福建省海水貝類養(yǎng)殖的主要種類。牡蠣味道鮮美，并富含蛋白質及多種微量元素，為人們提供了豐富的營養(yǎng)源，是一種深受歡迎的海產品。隨著生活水平的提高，消費者更加看重牡蠣的營養(yǎng)和風味，選育營養(yǎng)好、口感佳的牡蠣新品種，在水產消費市場有著很大的需求。目前，葡萄牙牡蠣遺傳育種的研究主要集中在種間雜交[2-3]，快速生長新品系和殼色新品種的選育等方面，曾志南等[4]通過連續(xù)數(shù)代的群體選育，培育出了金黃殼色速長葡萄牙牡蠣新品系，其生長速度明顯高于普通群體，通過對該品系體成分的研究分析發(fā)現(xiàn)，該新品系水分、糖原、鋅、鐵的含量明顯高于普通群體，高糖原含量的牡蠣普遍口感更佳，但新品系粗蛋白、鈣的含量顯著低于普通群體[5]，同時觀測到，高銅、鋅含量的葡萄牙牡蠣中?；撬岬暮恳裁黠@較高。一直以來, 國內外都未見有關牡蠣肉質性狀選育工作的報道，原因是對肉質性狀進行選育時，需要對大量樣本的成分指標進行檢測分析，而傳統(tǒng)的實驗室化學檢測方法存在耗時費力、成本高、污染環(huán)境等缺點[6]。

近紅外光譜技術(near-infrared spectroscopy, NIRS)是一種敏感、高效、低成本、無污染的新型定量分析技術，能夠對同一樣本中的多項化學指標進行快速準確的預測，在食品[7]、醫(yī)藥[8]、選擇育種[9]等方面有廣泛的應用。目前，在水產育種領域，近紅外光譜技術僅對長牡蠣(Crassostreagigas)中蛋白質、糖原的含量有較準確的預測[10]，但尚未見用于分析葡萄牙牡蠣生化成分的報道。本研究對105份采自4個時間段，6個產地的葡萄牙牡蠣樣本進行冷凍干燥處理，避免牡蠣軟體部高水分含量對近紅外光譜分析的影響，建立了能夠快速準確測定葡萄牙牡蠣中蛋白質、糖原、?；撬?、鋅、硒、鈣6種體成分含量的近紅外光譜模型，對今后選育肉質性狀佳的葡萄牙牡蠣新品系提供了技術支持。

1 實驗部分

1.1 材料

自2018年6月至2019年3月，三個月為一間隔，分別從福建福州、石獅、詔安，廣東汕頭、湛江，廣西防城港6個產地，共采集105份葡萄牙牡蠣樣本。單個牡蠣軟體部濕重(除去閉殼肌)為0.28～2.33 g, 根據(jù)開殼后牡蠣肉的大小，分為大個體樣本組和小個體樣本組，每份樣本濕重30～50 g。

將新鮮葡萄牙牡蠣開殼，取軟體部，用剪刀剪去閉殼肌后稱重，按大小分組后放入50 mL離心管, 并將離心管置于冰盒中。先用剪刀將離心管中的牡蠣肉剪碎，然后用手持式勻漿機調至最大轉速勻漿60 s，在-80 ℃冰箱中保存12 h后，使用真空冷凍干燥機干燥48 h。用研缽和研杵將干燥后的樣本研磨至細粉末，然后用60目篩網篩分, 樣本顆粒越均勻細小，越利于提高模型預測的準確度[12]。將每份樣本分成兩份，一份用于近紅外光譜的采集，一份用于6種成分化學真實值的測定。

1.2 儀器

傅里葉近紅外(NIR)光譜儀(Thermo Fisher，AntarisⅡ, USA)，采集軟件RESULT-Integration(Thermo Fisher，USA)，數(shù)據(jù)分析軟件TQ Analyst(Thermo Fisher，USA)，全自動凱氏定氮儀(FOSS，Kjeltec 8400, Sweden)，可見分光光度計(Shimadzu，UVmini-1240, Japan)，液相色譜儀(Shimadzu, LC-16, Japan)，火焰原子吸收分光光度計(Varian, AA240FS, USA), 雙道原子熒光儀(北京吉天，AFS-930, China), 真空冷凍干燥機(CHRIST, Alpha 2-4 LDplus，Germany), 手持式勻漿機(IKA T10 basic ULTRA-TURRAX，Germany)。

1.3 光譜采集

近紅外光譜儀開機預熱30 min后, 將準備好的樣品放入光譜儀配套的石英杯，樣品厚度1 cm，將軟件設置為漫反射光譜，光譜掃描范圍在10 000～4000 cm-1，掃描次數(shù)為64次，分辨率為8 cm-1，吸收光譜用log(1/R)表示，其中R表示反射率。在采集每個樣品之前，先采集背景光譜以消除背景所帶來的影響。

1.4 化學真實值測定

葡萄牙牡蠣中蛋白質、牛磺酸、鋅、硒、鈣含量測定采用GB 5009.5—2016《食品中蛋白質的測定》、GB 5009.169—2016《食品中?；撬岬臏y定》、GB 5009.14—2017《食品中鋅的測定》、GB 5009.93—2017《食品中硒的測定》、GB 5009.92—2016《食品中鈣的測定》的方法，糖原含量測定采用試劑盒法(EnzyChromTM糖原試劑盒，BioAssay Systems，USA)。

1.5 模型建立與驗證

采用TQ Analyst軟件，選用偏最小二乘法(PLS)，以及乘法散射校正(MSC)、一階求導、Norris平滑的光譜預處理方法，并選擇軟件自動推薦的波段范圍，剔除異常樣本。模型采用外部驗證和交叉驗證的方法對模型預測效果進行驗證，驗證樣本數(shù)量為總樣本數(shù)的1/3。

2 結果與討論

2.1 化學成分測定結果

采用國標法和試劑盒法對105份葡萄牙牡蠣干粉樣本的蛋白質、糖原、?；撬?、鋅、硒、鈣含量進行測定。分析結果如表1所示，蛋白質含量分布范圍為30.60%～68.00%，糖原3.00%～48.10%，牛磺酸7.80%～27.60%，鋅0.11%～2.21%，硒1.36%～6.91%，鈣1.09%～11.70%，可見樣本中6種成分含量的分布范圍廣，有較強代表性，滿足了近紅外定量模型要求樣本成分含量分布范圍廣的基本要求。

表1 葡萄牙牡蠣樣本中蛋白質、糖原、?；撬帷\、硒、鈣含量分析結果

Table 1 Statistics of protein, glycogen, taurine, zinc, selenium and calcium contents ofCrassostreaangulatasamples

蛋白質糖原?；撬徜\硒鈣最大值/%68.0048.1027.602.216.9111.70最小值/%30.603.007.800.111.361.09平均值/%51.6218.5216.250.742.693.19標準偏差/%9.0611.694.700.501.032.11總樣本數(shù)105105105105105105

2.2 原始光譜分析

用近紅外光譜儀采集了105份樣本原始光譜，如圖1所示，光譜曲線走向基本一致，但不同樣本的光譜曲線又略有不同，說明各樣本成分含量有差異。由于部分樣本采集光譜時正處于南方梅雨季節(jié)，實驗室濕度較大，導致采集的原始光譜在7 500～7 000和5 500～5 000 cm-1附近的水峰區(qū)域有噪聲干擾，圖譜質量受到了水汽影響。

圖1 葡萄牙牡蠣樣本的原始光譜圖Fig.1 The raw spectra of Crassostrea angulata samples

2.3 預處理光譜分析

如圖2所示，原始光譜通過乘法散射校正(MSC)、一階求導、Norris平滑的光譜預處理方法，消除了由于樣本顆粒大小等原因引起的光譜信號基線漂移及噪聲等問題[12]，減少了圖譜中的不均勻散射效應，提高了信噪比(SNR)。

圖2 乘法散射校正、一階求導結合Norris平滑F(xiàn)ig.2 MSC+1st derivative+Norris derivative filter

2.4 模型的確立和外部驗證

選擇TQ Analyst軟件自動推薦的光譜波段范圍(如表2)，建立了6種成分的近紅外定量分析模型，并對模型進行了外部驗證。

蛋白質定量模型的校正相關系數(shù)(RC)為0.985 3，校正均方根誤差(RMSEC)為1.62，預測相關系數(shù)(RP)為0.985 1，預測均方根誤差(RMSEP)為1.59(如圖3)。

糖原定量模型的校正相關系數(shù)(RC)為0.965 1，校正均方根誤差(RMSEC)為3.19，預測相關系數(shù)(RP)為0.963 6，預測均方根誤差(RMSEP)為3.17(如圖4)。

牛磺酸定量模型的校正相關系數(shù)(RC)為0.950 4，校正均方根誤差(RMSEC)為1.14，預測相關系數(shù)(RP)為0.944 1，預測均方根誤差(RMSEP)為1.05(如圖5)。

鋅定量模型的校正相關系數(shù)(RC)為0.955 4，校正均方根誤差(RMSEC)為0.156，預測相關系數(shù)(RP)為0.946 1，預測均方根誤差(RMSEP)為0.153。

硒定量模型的校正相關系數(shù)(RC)為0.920 0，校正均方根誤差(RMSEC)為0.290，預測相關系數(shù)(RP)為0.919 0，預測均方根誤差(RMSEP)為0.289。

圖3 蛋白質化學真實值與預測值的相關關系圖Fig.3 Protein chemical value and predictive valueof correlation diagram

圖4 糖原化學真實值與預測值的相關關系圖Fig.4 Glycogen chemical value and predictivevalue of correlation diagram

圖5 牛磺酸化學真實值與預測值的相關關系圖Fig.5 Taurine chemical value and predictive valueof correlation diagram

鈣定量模型的校正相關系數(shù)(RC)為0.925 2，校正均方根誤差(RMSEC)為0.929，預測相關系數(shù)(RP)為0.924 1，預測均方根誤差(RMSEP)為1.03。

以上6個定量模型的校正相關系數(shù)(RC)均高于或等于0.92，預測相關系數(shù)(RP)均高于0.91，模型預測值與化學真實值有很高的的相關度，且校正均方根誤差(RMSEC)和預測均方根誤差(RMSEP)都在可接受范圍，6個近紅外定量模型都有著較好的預測效果，尤其蛋白質、糖原、?；撬?、鋅定量模型的預測效果特別令人滿意。由此可見，此次建模適用于今后葡萄牙牡蠣體成分的實際檢測。

2.5 模型的交叉驗證

通過軟件對6個模型進行了交叉驗證，得到以下結果：

蛋白質定量模型的交叉驗證相關系數(shù)(RCV)為0.981 7，交叉驗證均方根誤差(RMSECV)為1.81。

糖原定量模型的交叉驗證相關系數(shù)(RCV)為0.946 1，交叉驗證均方根誤差(RMSECV)為3.95。

牛磺酸定量模型的交叉驗證相關系數(shù)(RCV)為0.900 5，交叉驗證均方根誤差(RMSECV)為1.61。

鋅定量模型的交叉驗證相關系數(shù)(RCV)為0.897 5，交叉驗證均方根誤差(RMSECV)為0.233。

硒定量模型的交叉驗證相關系數(shù)(RCV)為0.875 3，交叉驗證均方根誤差(RMSECV)為0.360。

鈣定量模型的交叉驗證相關系數(shù)(RCV)為0.829 2，交叉驗證均方根誤差(RMSECV)為1.39。

以上6個實驗結果，交叉驗證均方根誤差(RMSECV)都在可接受范圍，交叉驗證相關系數(shù)(RCV)除了鈣的結果不夠理想，其余均高于0.87，預示模型有著較好的預測效果，但鈣的近紅外定量模型今后還有可優(yōu)化空間。

3 結 論

實驗樣本采集時長9個月，葡萄牙牡蠣樣本來自于6個不同產地，且樣本量足夠大，具有較好的代表性，樣本經過冷凍干燥處理，減少了水分對光譜質量的影響，有利于提高模型的準確性及穩(wěn)定性。實驗所建立的6個近紅外定量模型，有著較高的校正相關系數(shù)和預測相關系數(shù)，可見模型具有較好的預測效果，近紅外光譜技術適用于葡萄牙牡蠣中蛋白質、?；撬帷\、硒、鈣含量的檢測。但鈣定量模型的交叉驗證相關系數(shù)稍低，還需對其進行優(yōu)化，進一步提高其實際預測的準確性。

本模型的建立，對今后開展大規(guī)模葡萄牙牡蠣體成分的測定，選育肉質性狀佳的葡萄牙牡蠣新品系有著重要意義。