賽春梅 賈玲玉 趙 爽 張國(guó)印 高 峰 張方鵬

(1濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，日照 276826；2山東廣育堂國(guó)藥有限公司， 濟(jì)寧 272071)

二仙膏(Erxiangao)組方主要有人參、枸杞、鹿角膠、龜板、牛鞭、黃芪、黑芝麻、核桃仁、熟地黃(砂仁拌)、制何首烏、五味子(酒制)、沙苑子、遠(yuǎn)志、牛膝、丹參、山藥十六味藥，輔料為蜂蜜。二仙膏滋陰助陽，益氣養(yǎng)血。用于治療氣血兩虛，神疲體倦，周身懶軟，神經(jīng)衰弱。其組方合理，是廣育堂傳承的經(jīng)驗(yàn)方，國(guó)家首批中藥保護(hù)品種，入選國(guó)家非物質(zhì)文化遺產(chǎn)保護(hù)代表性項(xiàng)目。

二仙膏用于腫瘤患者康復(fù)治療，顯著提高患者的生活質(zhì)量和生存時(shí)間，得到許多患者的一致好評(píng)。初步藥理試驗(yàn)結(jié)果表明，二仙膏對(duì)化療藥致白細(xì)胞減少癥小鼠模型的免疫功能有明顯改善作用，可顯著增加白細(xì)胞和造血細(xì)胞的數(shù)量，增強(qiáng)機(jī)體免疫力[1-2]。中藥復(fù)方成分復(fù)雜，研究其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)對(duì)于闡明整體功效、作用機(jī)制及提高質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)具有關(guān)鍵作用，其中，中藥復(fù)方有效成分的研究能夠在一定程度上明確中藥發(fā)揮藥效的物質(zhì)基礎(chǔ)，尋找并定量測(cè)定其有效部位是現(xiàn)階段中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究的最基礎(chǔ)、最重要環(huán)節(jié)[3-4]。中藥復(fù)方質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的完善制定是確保療效穩(wěn)定、用藥安全的有效依據(jù)[5]。雖然二仙膏有很好的臨床療效，但是現(xiàn)有質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)簡(jiǎn)單，且藥效物質(zhì)基礎(chǔ)尚不明確，需進(jìn)一步深入研究。通過分析二仙膏的方解及文獻(xiàn)報(bào)道藥味的有效成分，表明總皂苷、總多糖提高機(jī)體免疫力效果明顯[6-8]，且預(yù)實(shí)驗(yàn)表明這2大類成分含量較高，故本文研究紫外可見分光光度法測(cè)定二仙膏總皂苷、總多糖的含量，為提高質(zhì)量控制方法和下一步藥效物質(zhì)基礎(chǔ)的深度研究奠定基礎(chǔ)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

TU-1901光雙束紫外可見分光光度計(jì)(北京普析通用儀器有限責(zé)任公司)；102-2A電熱鼓風(fēng)干燥箱(龍口市先科儀器公司)；JJ224BC電子天平(G&G公司)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(鞏義市予華儀器有限公司)；SHK-IIIS循環(huán)水式多用真空泵(鄭州科泰實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)；玻璃儀器氣流烘干器(河南省予華儀器有限公司)。

1.2 試藥

二仙膏(山東廣育堂國(guó)藥有限公司，批號(hào)20190501、20190601、20190701)；齊墩果酸(中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)110709-201705)；AR無水葡萄糖(天津市登科化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)161111)；AB-8大孔樹脂(天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所，批號(hào)20170408)；正丁醇，無水乙醇，硫酸，乙酸，高氯酸，甲醇，蒽酮均為分析純，水為蒸餾水。

2 方法與結(jié)果

2.1 二仙膏總皂苷的測(cè)定

2.1.1對(duì)照品溶液的制備 精密稱取干燥至恒重的齊墩果酸對(duì)照品14.00mg，置10ml容量瓶中，加入甲醇溶解，搖勻，定容；精密吸取1.0ml，用甲醇定容至10ml，搖勻，即得。

2.1.2供試品溶液的制備 精密稱取二仙膏0.6g，加水2ml，溶解后用正丁醇萃取4次，合并正丁醇減壓蒸干，浸膏用甲醇溶解，過濾，定容至50ml，精密吸取5.0ml，用甲醇定容至10ml，搖勻，即得。

2.1.3溶液的顯色 精密量取對(duì)照品溶液或供試品溶液0.4ml，置于25ml具塞試管中，水浴揮干溶劑，依次加入0.2ml 5%香草醛-冰醋酸溶液和0.8ml高氯酸，搖勻后置70℃恒溫水浴15min，隨后立即取出，置冰浴中冷卻3min，加冰乙酸5.0ml，搖勻，放置10min，用于吸光度測(cè)定。

2.1.4測(cè)定波長(zhǎng)的選擇 分別精密量取齊墩果酸對(duì)照品溶液和供試品溶液0.4ml，置于25ml具塞試管中，按照“2.1.3”項(xiàng)下方法進(jìn)行顯色，以相應(yīng)試劑為空白對(duì)照，于400～800nm波長(zhǎng)處掃描，結(jié)果顯示對(duì)照品溶液和樣品溶液均在(540±2)nm處有最大吸收，故確定檢測(cè)波長(zhǎng)為540nm。

2.1.5標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制和線性范圍 分別精密量取0.15、0.20、0.25、0.30、0.35、0.40、0.45、0.50ml對(duì)照品溶液，分別置于25ml具塞試管中，按照“2.1.3”項(xiàng)下方法進(jìn)行顯色，以空白溶劑同法處理作參比，于540nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度，以吸光度(A)為縱坐標(biāo)，濃度(C)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算回歸方程為：y=11.182x-0.0629(r=0.9999)，表明齊墩果酸在0.021～0.070mg/mL濃度范圍內(nèi)與吸光度有良好的線性關(guān)系。見圖1。

圖1 齊墩果酸對(duì)照品標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.1.6精密度試驗(yàn) 取同一供試品溶液(批號(hào)20190601)0.4ml，置25ml具塞試管中，按“2.1.3”項(xiàng)方法進(jìn)行顯色，以空白溶劑同法處理作參比，于540nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度，平行測(cè)定吸光度值6次。計(jì)算吸光度的RSD為0.23%(n=6)，表明精密度良好。

2.1.7穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取供試品溶液(批號(hào)20190601)0.4ml，置25ml具塞試管中，按“2.1.6”項(xiàng)操作，分別在0、20、40、60、80、100、120min時(shí)各測(cè)定一次吸光度，計(jì)算吸光度的RSD為1.54%(n=7)，結(jié)果表明供試品溶液在120min內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.8重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱量二仙膏(批號(hào)20190601)，共6份，置50ml燒杯中，按“2.1.2”項(xiàng)方法制備，精密吸取供試品溶液0.4ml，置25ml具塞試管中，按“2.1.6”項(xiàng)操作，在540nm處測(cè)定其吸光度，計(jì)算總皂苷的平均含量為8.10mg/g，RSD為3.53%(n=6)，表明該方法重復(fù)性良好。

2.1.9加樣回收率試驗(yàn) 精密稱定已知含量的批號(hào)為20190601的二仙膏6份，每份0.3000g，分別精密加入0.14mg/ml的齊墩果酸對(duì)照品溶液16.9ml，依“2.1.2”項(xiàng)制備供試品溶液，依法測(cè)定，測(cè)得齊墩果酸的平均回收率為96.77%，RSD為1.61%，表明該方法準(zhǔn)確性良好。見表1。

表1 加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.10樣品總皂苷的測(cè)定 精密稱取不同批次二仙膏0.6g，按“2.1.2”項(xiàng)制備供試品溶液，依法測(cè)定，計(jì)算總皂苷含量。見表2。

表2 樣品總皂苷測(cè)定實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2 二仙膏總糖的測(cè)定

2.2.1對(duì)照品溶液的制備 精密稱取干燥至恒重的葡萄糖對(duì)照品6.0mg，加水溶解，并定容至50ml，搖勻，即得。

2.2.2供試品溶液的制備 精密稱取二仙膏2.0g，加3.0ml水溶解，過AB-8大孔樹脂柱(內(nèi)徑2.4cm，高22.5cm)，用水洗脫3個(gè)柱體積，洗脫液濃縮，加水定容至50ml，從中精密吸取0.5ml，加水定容至100ml，混勻，即得。

2.2.3溶液的顯色 精密吸取葡萄糖對(duì)照品溶液或供試品溶液0.5ml，置25ml具塞試管中，加水至2ml，加0.2%蒽酮-濃硫酸溶液6.0ml，搖勻，置水浴中加熱15min，取出，放入冰浴中冷卻15min，用于吸光度測(cè)定。

2.2.4測(cè)定波長(zhǎng)的選擇 分別精密量取葡萄糖對(duì)照品溶液和供試品溶液0.50ml，置于25ml具塞試管中，按照“2.1.3”項(xiàng)進(jìn)行顯色，以相應(yīng)試劑為空白對(duì)照，于400～800nm波長(zhǎng)處掃描，結(jié)果顯示對(duì)照品溶液和樣品溶液均在620nm處有最大吸收，故確定檢測(cè)波長(zhǎng)為620nm。

2.2.5標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制和線性范圍 分別精密吸取濃度為0.12mg/ml葡萄糖對(duì)照品溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0ml置25ml具塞試管中，加水至2ml，精密加入0.2%硫酸-蒽酮溶液6.0ml，搖勻，置水浴中加熱15min，取出，放入冰浴中冷卻15min，在620nm處測(cè)定吸光度，計(jì)算回歸方程為：y=6.8708x+0.0231(r=0.9999)，表明葡萄糖在0.024～0.120mg/mL濃度范圍內(nèi)與吸光度有良好的線性關(guān)系。見圖2。

圖2 葡萄糖對(duì)照品標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2.6精密度試驗(yàn) 取同一供試品溶液(批號(hào)20190701)0.5ml，置25ml具塞試管中，按“2.2.3”項(xiàng)進(jìn)行顯色，以空白溶劑同法處理作參比，于620nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度，平行測(cè)定吸光度值6次。計(jì)算吸光度的RSD為0.12%(n=6)，表明精密度良好。

2.2.7穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取同一供試品溶液(批號(hào)20190701)0.5ml，置25ml具塞試管中，按“2.2.6”項(xiàng)操作，分別在0、20、40、60、80、100min時(shí)各測(cè)定一次吸光度，計(jì)算吸光度的RSD為0.71%(n=6)，結(jié)果表明供試品溶液在100min內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.8重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱量二仙膏(批號(hào)20190701)，共6份，按“2.2.2”項(xiàng)方法制備，精密吸取供試品溶液0.5ml，置25ml具塞試管中，按“2.2.6”項(xiàng)操作，在620nm處測(cè)定其吸光度，計(jì)算總糖的平均含量為34.78%，RSD為3.58%(n=6)，表明該方法重復(fù)性良好。

2.2.9加樣回收率試驗(yàn) 精密稱定已知含量的批號(hào)為20190701的二仙膏6份，每份1.0g，分別精密加入347.8mg的葡萄糖對(duì)照品，依“2.2.2”項(xiàng)制備供試品溶液，依法測(cè)定，測(cè)得葡萄糖的平均回收率為101.83%，RSD為0.92%，表明該方法準(zhǔn)確性良好。見表3。

表3 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.2.10樣品總糖的測(cè)定 精密稱取不同批次二仙膏2.0g，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，依法測(cè)定，計(jì)算總糖含量。見表4。

表4 樣品總糖含量測(cè)定結(jié)果

注：二仙膏工藝中加入了約4倍清膏量的蜂蜜，故所測(cè)的總糖含量中有約80%來自蜂蜜，其他藥味中含總多糖約為8%。

3 討論

二仙膏有滋陰助陽，益氣養(yǎng)血的功效，結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道分析該藥的處方組成及方解，通過系統(tǒng)化學(xué)成分預(yù)試驗(yàn)的方法，初步確定二仙膏中含量較高的有效成分主要有皂苷類、多糖類[9-12]。本文通過方法學(xué)考察，表明紫外可見分光光度法測(cè)定總皂苷及總糖的含量方法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、靈敏度高、重復(fù)性好、穩(wěn)定性高，可作為二仙膏中總皂苷、總糖的含量測(cè)定方法。本文二仙膏中大類成分的含量測(cè)定，為后續(xù)其物質(zhì)基礎(chǔ)研究和質(zhì)量控制奠定了基礎(chǔ)。