周倩倩，方士元，梅 俊，謝 晶,4,*

（1.上海海洋大學食品學院，上海 201306;2.上海水產(chǎn)品加工及貯藏工程技術(shù)研究中心，上海 201306;3.上海冷鏈裝備性能與節(jié)能評價專業(yè)技術(shù)服務(wù)平臺，上海 201306;4.食品科學與工程國家級實驗教學示范中心（上海海洋大學），上海 201306）

海產(chǎn)品具有豐富的營養(yǎng)價值，深受消費者的喜愛。但在貯藏和運輸過程中，由于內(nèi)源蛋白水解酶活性的增大和細菌的生長繁殖，會使產(chǎn)品品質(zhì)下降，造成其經(jīng)濟價值和食用價值的下降[1]。腐敗希瓦氏菌（Shewanella putrefaciens）和熒光假單胞菌（Pseudomonas fluorescens）是低溫肉和水產(chǎn)品中主要的革蘭氏陰性優(yōu)勢腐敗菌，革蘭氏陰性菌的細胞壁結(jié)構(gòu)復雜，包括外膜和肽聚糖[2]。腐敗希瓦氏菌和熒光假單胞菌可以在缺氧條件下快速繁殖，并將三甲胺-N-氧化物還原為三甲胺，水解蛋白質(zhì)和脂肪，產(chǎn)生令人不愉快的魚腥味，導致感官上的不可接受性。Lyu等[2]發(fā)現(xiàn)肉桂油與γ射線結(jié)合對腐敗希瓦氏菌有很強的抑菌效果。Zhang Nannan等[3]研究發(fā)現(xiàn)銀杏葉提取物會破壞腐敗希瓦氏菌的細胞壁和細胞膜;Wright等[4]發(fā)現(xiàn)法地欖仁果提取物可以抑制腐敗希瓦氏菌的生長，防止魚肉腐敗。Yao Xiaolin等[5]探究了川陳皮素和橘皮素可破壞熒光假單胞菌細胞膜的通透性，抑制蛋白質(zhì)合成，延緩代謝;Tyagi等[6]發(fā)現(xiàn)空氣負離子與揮發(fā)油蒸氣的聯(lián)合作用對熒光假單胞菌的抑制作用更加明顯。Ferreira等[7]發(fā)現(xiàn)季銨化合物芐基十二烷基氯化銨可通過離子和疏水相互作用與熒光假單胞菌細胞膜結(jié)合，導致膜特性和功能發(fā)生變化。

為了保持食品的安全性并降低食品中容易導致高血壓的鹽含量，植物精油及其提取物在食品工業(yè)中的應用逐漸增多[8]。丁香酚是丁香油的主要成分，對細菌和真菌有很強的抑制作用，是一種良好的天然抑菌劑，它可以破壞微生物細胞膜，使膜內(nèi)蛋白質(zhì)和脂質(zhì)泄露。其兼具抗菌、消炎、抗氧化特性，因此在食品、醫(yī)療、化妝品和個人保健產(chǎn)品中的應用備受關(guān)注[9]。錢衛(wèi)東等[10]研究了丁香酚對耐藥性大腸桿菌的抑菌作用;Zhang Yi[9]和Jafri[11]等分別研究了丁香酚對牙齦卟啉單胞菌、白色念珠菌和變形鏈球菌的單生物膜和混合生物膜的抑菌機理。雖然已有很多學者研究了丁香酚對致病菌的抑菌機理，但是目前對其作用于海產(chǎn)品腐敗菌的抑菌效果和抑菌機理知之甚少。因此，本研究嘗試用多種方法揭示丁香酚對腐敗希瓦氏菌和熒光假單胞菌的抑菌機理，為海產(chǎn)品保鮮中天然安全的植物源保鮮劑開發(fā)提供了理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

腐敗希瓦氏菌WS13從4 ℃貯藏下的凡納濱對蝦中分離得到;熒光假單胞菌ATCC27853購于北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院;丁香酚（純度大于98%）購于上海阿拉丁試劑有限公司;堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，AKP）、三磷酸腺苷（adenosine triphophate，ATP）酶試劑盒購于南京建成生物工程研究所。

1.2 儀器與設(shè)備

全自動微生物生長曲線分析儀 芬蘭Bioscreen公司;MIRA3場發(fā)射掃描電子顯微鏡 泰思肯貿(mào)易（上海）有限公司;Nicolet iS5 FT-IR傅里葉變換紅外光譜（Fourier transform infrared spectroscopy，F(xiàn)TIR）儀 美國賽默飛世爾有限公司。

1.3 方法

1.3.1 最小抑菌濃度測定

采用二倍梯度稀釋法[12]配制不同質(zhì)量濃度的丁香酚。在選擇性液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)腐敗希瓦氏菌和熒光假單胞菌，用磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）稀釋，使其菌體濃度約為106CFU/mL。在96 孔板中，每孔加入10 μL細菌懸液、100 μL丁香酚、100 μL培養(yǎng)基，使丁香酚的最終質(zhì)量濃度分別為93.75、187.5、375、750、1 500 mg/L。對照組1加入100 μL質(zhì)量分數(shù)2.5%的二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）和10 μL細菌懸液，對照組2加入100 μL無菌水和10 μL細菌懸液，在30 ℃下培養(yǎng)24 h，在培養(yǎng)時間內(nèi)沒有觀察到細菌明顯生長時丁香酚的濃度為最小抑菌濃度（minimal inhibitory concentration，MIC），實驗重復3 次。

1.3.2 生長曲線繪制

參考侯溫甫等[13]的方法并稍作修改。在選擇性液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)腐敗希瓦氏菌和熒光假單胞菌，用PBS稀釋，獲得約106CFU/mL的菌液。將不同質(zhì)量濃度的丁香酚（終質(zhì)量濃度分別為0（對照）、0.5 MIC、1 MIC、2 MIC）加入懸液管中培養(yǎng)48 h，用全自動微生物生長曲線分析儀測定OD600nm，每2 h測一次，并以時間為橫坐標，光密度值為縱坐標繪制生長曲線。

1.3.3 AKP活力的測定

AKP活力測定采用AKP試劑盒。在液體培養(yǎng)基中加入108CFU/mL細菌懸液和終質(zhì)量濃度分別為0（對照）、0.5 MIC、1 MIC、2 MIC丁香酚溶液，然后在搖床中以150 r/min和30 ℃的條件培養(yǎng)3 h。最后分別于0 h和3 h各取1 mL培養(yǎng)液8 000 r/min離心10 min，然后用AKP試劑盒測定上清液中AKP的活力。對照組以DMSO代替丁香酚，實驗重復3 次。

1.3.4 蛋白質(zhì)和核酸的測定

參考Xiang Qisen等[14]方法，并稍作修改。在選擇性液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)腐敗希瓦氏菌和熒光假單胞菌，用PBS稀釋，獲得約106CFU/mL的菌液，將終質(zhì)量濃度為0（對照）、0.5 MIC、1 MIC、2 MIC丁香酚溶液分別加入至1 mL 106CFU/mL菌懸液中，在搖床中以150 r/min、30 ℃條件培養(yǎng)3 h后，取其上清液的10 倍稀釋液測得OD280nm和OD260nm。重復實驗3 次，每次設(shè)置3 個平行。

1.3.5 K+含量的測定

通過1.3.3節(jié)中的方法獲得上清液，用K+試劑盒分別檢測0 h和3 h上清液中K+的含量，實驗重復3 次。

1.3.6 ATP酶活力的測定

采用ATP酶試劑盒檢測ATP酶活力。通過1.3.3節(jié)中的方法獲得上清液及沉淀，離心后除去上清液，用液氮破碎細菌。分別于0 h和3 h測定ATP酶活力，實驗重復3 次。

1.3.7 FTIR分析分子結(jié)構(gòu)

采用FTIR法[15]對細菌分子結(jié)構(gòu)的變化進行分析，在細菌培養(yǎng)液中加入終質(zhì)量濃度為1 MIC的丁香酚，對照組加入等體積的DMSO。在搖床中以30 ℃、150 r/min培養(yǎng)6 h，然后取培養(yǎng)懸液以8 000 r/min離心10 min，去上清液，用PBS清洗細胞兩次，冷凍干燥后，用FTIR儀對干燥的細菌細胞進行分析。

1.3.8 掃描電子顯微鏡觀察

采用掃描電子顯微鏡觀察丁香酚對細菌的損傷情況。沉淀細胞由1.3.7節(jié)中的方法獲得，接著用體積分數(shù)2.5%戊二醛溶液固定細胞4 h，然后在PBS中漂洗兩次，每次10 min，再置于30%～100%的乙醇中脫水，真空冷凍干燥后噴金，掃描電鏡觀察細菌的細胞形態(tài)。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

采用SPSS 19.0軟件（單因素方差分析）和Origin 8.5軟件對數(shù)據(jù)分別進行顯著性分析和圖表的制作。

2 結(jié)果與分析

2.1 丁香酚的MIC

不同質(zhì)量濃度丁香酚對腐敗希瓦氏菌和熒光假單胞菌的抑菌作用見表1。丁香酚對腐敗希瓦氏菌和熒光假單胞菌的MIC均為750 mg/L，DMSO無抑菌作用[16]。

表 1 丁香酚對腐敗希瓦氏菌和熒光假單胞菌的MICTable 1 MICs of eugenol against Shewanella putrefaciens and Pseudomonas fluorescens

2.2 丁香酚對腐敗希瓦氏菌和熒光假單胞菌生長曲線的影響

從圖1A可以看出，對照組的細菌生長活性較高，在開始的20 h內(nèi)迅速增加，之后幾乎不再生長。隨著丁香酚質(zhì)量濃度的增加，丁香酚的抑制作用越明顯。0.5 MIC丁香酚處理的腐敗希瓦氏菌在培養(yǎng)的前16 h受到抑制，隨后進入對數(shù)生長期，后期OD600nm下降可能是培養(yǎng)基的消耗所致。1 MIC和2 MIC處理組無細菌生長。

如圖1B所示，丁香酚對熒光假單胞菌的抑制作用主要表現(xiàn)為延遲其對數(shù)生長期，0.5 MIC時的丁香酚對熒光假單胞菌的抑制作用在前14 h受到抑制，隨后迅速增加，24 h后高于對照組?？赡苁嵌∠惴友舆t了熒光假單胞菌的對數(shù)生長期[17-18]。1 MIC和2 MIC處理組無細菌生長。這一結(jié)果與之前測定MIC的結(jié)果相似。

圖 1 丁香酚對腐敗希瓦氏菌（A）和熒光假單胞菌（B）生長曲線的影響Fig. 1 Effect of eugenol on the growth of Shewanella putrefaciens (A) and Pseudomonas fluorescens (B)

2.3 丁香酚對腐敗希瓦氏菌和熒光假單胞菌AKP活力的影響

圖 2 丁香酚對腐敗希瓦氏菌（A）和熒光假單胞菌（B）AKP活力的影響Fig. 2 Effect of eugenol on the activity of AKP in Shewanella putrefaciens (A) and Pseudomonas fluorescens (B)

AKP是一種位于細胞壁和細胞膜之間的磷酸單酯酶，菌懸液中AKP活力可以反映細菌細胞壁的完整性[19]。如圖2所示，兩種細菌在不加丁香酚的情況下，兩菌株酶活力穩(wěn)定在0.13左右，經(jīng)1 MIC丁香酚處理3 h后，腐敗希瓦氏菌和熒光假單胞菌實驗組的OD值分別從0.125和0.128增加到0.42和0.36。且OD值隨著丁香酚質(zhì)量濃度增加而增加。這些結(jié)果表明丁香酚顯著增加了細胞壁的通透性，使得AKP流出，這意味著細菌細胞壁的完整性已經(jīng)被破壞。細胞壁具有固定細胞形狀，使細胞具有一定機械強度以避免滲透壓等其他外力對細胞損害的作用，失去細胞壁的保護，細菌極易死亡[20-21]。

2.4 丁香酚對腐敗希瓦氏菌和熒光假單胞菌蛋白質(zhì)和核酸的影響

表 2 丁香酚對腐敗希瓦氏菌和熒光假單胞菌蛋白質(zhì)和核酸的影響Table 2 Effect of eugenol on protein and nucleic acid in Shewanella putrefaciens and Pseudomonas fluorescens

從表2可以看出，丁香酚處理后的腐敗希瓦氏菌和熒光假單胞菌的蛋白質(zhì)和核酸釋放量明顯增加，OD260nm的增加比OD280nm更為明顯，且與丁香酚的質(zhì)量濃度成正比，這與陳夢玲等[22]研究牛至精油使腐生葡萄球菌紫外吸收物質(zhì)泄漏的結(jié)論相似。可能是因為與丁香酚接觸后細胞膜通透性增加，導致核酸和蛋白質(zhì)從細胞內(nèi)釋放到細胞外，使其吸光度增大[23]。加入1 MIC丁香酚的實驗組與對照組比較有顯著性差異。這與Zhang Yi等[9]所研究的丁香酚殺菌作用的結(jié)果相似。

2.5 丁香酚對腐敗希瓦氏菌和熒光假單胞菌K+泄漏量的影響

圖 3 丁香酚對腐敗希瓦氏菌（A）和熒光假單胞菌（B）K＋滲漏的影響Fig. 3 Effect of eugenol on potassium ion leakage from Shewanella putrefaciens (A) and Pseudomonas fluorescens (B)

由圖3可以看出，丁香酚引起兩種細菌K+泄漏量顯著增加（P＜0.05）。經(jīng)0.5 MIC丁香酚處理后，腐敗希瓦氏菌和熒光假單胞菌培養(yǎng)液的上清液中K+含量分別由1.08、1.09?mmol/g增加到6.08、5.57 mmol/g，且隨著丁香酚質(zhì)量濃度的增加，K+含量越多，說明丁香酚越能增大細胞膜的通透性，使細胞膜損傷，導致細菌中K+的泄漏，這與Liu Guorui等[24]對雙歧桿菌導致李斯特菌細胞泄漏的研究結(jié)果相似。

2.6 丁香酚對腐敗希瓦氏菌和熒光假單胞菌ATP酶活力的影響

ATP酶是糖酵解過程中促進細胞代謝和生產(chǎn)ATP的胞內(nèi)酶[25]。如圖4所示，在兩種細菌中加入1 MIC丁香酚后，腐敗希瓦氏菌和熒光假單胞菌的ATP酶活力分別下降了70.8%和73.2%（P＜0.05），且下降的程度與丁香酚的質(zhì)量濃度呈正相關(guān)，丁香酚能顯著抑制ATP酶的活性。ATP酶的低水平也間接導致細胞因缺乏能量而死亡[26]。

圖 4 丁香酚對腐敗希瓦氏菌（A）和熒光假單胞菌（B）ATP酶活力的影響Fig. 4 Effect of eugenol on the activity of ATPase in Shewanella putrefaciens (A) and Pseudomonas fluorescens (B)

2.7 FTIR分析結(jié)果

圖 5 加入丁香酚4 h后的腐敗希瓦氏菌的FTIR圖Fig. 5 Infrared spectra of Shewanella putrefaciens after exposure to eugenol for 4 h

圖 6 加入丁香酚4 h后的熒光假單胞菌的FTIR圖Fig. 6 Infrared spectra of Pseudomonas fluorescens after exposure to eugenol for 4 h

FTIR可以間接表征腐敗希瓦氏菌和熒光假單胞菌暴露于丁香酚的死亡誘導機制，反映丁香酚加入前后兩種菌的分子組成變化。3 300 cm-1與2 800 cm-1之間的吸收峰代表脂質(zhì)的官能團，1 237 cm-1左右的吸收峰代表與磷脂雙層相關(guān)的磷酸二酯;1 657、1 546、1 455 cm-1和1 399 cm-1的吸收峰代表蛋白的官能團：1 650 cm-1的吸收峰代表α-螺旋結(jié)構(gòu)中的酰胺I，1 546 cm-1的吸收峰代表蛋白質(zhì)酰胺的N—H鍵，1 455 cm-1和1 399 cm-1的吸收峰代表小區(qū)結(jié)構(gòu)蛋白;1 078 cm-1的吸收峰代表核酸的官能團;在1 235 cm-1的吸收峰代表磷酸二酯鍵的不對稱拉伸，與磷脂雙層有關(guān)[27]。

由圖5、6可知，經(jīng)1 MIC丁香酚處理后的腐敗希瓦氏菌和熒光假單胞菌大分子發(fā)生了明顯變化，與對照組相比，經(jīng)丁香酚處理的腐敗希瓦氏菌在3 272 cm-1（脂質(zhì)）和1 237 cm-1（磷酸二酯）處的吸收峰強度分別明顯減弱和增強，這表明丁香酚可以破壞細胞膜的磷脂雙分子層。對照組1 078 cm-1處吸收峰與處理后1 050 cm-1處吸收峰位置偏移，可以看出丁香酚使核酸部分流出并破壞了其結(jié)構(gòu)。在1 644、1 530、1 456 cm-1和1 399 cm-1處吸收峰強度明顯增加，表明丁香酚改變了膜蛋白的二級結(jié)構(gòu)。經(jīng)過丁香酚處理后的熒光假單胞菌與腐敗希瓦氏菌不同之處在于2 390～2 851 cm-1的峰強度幾乎不變，但峰面積減少，這也表明丁香酚破壞了細胞膜的磷脂雙分子層;在1 649、1 546、1 456 cm-1和1 396 cm-1處吸收峰強度明顯減弱，表明丁香酚改變了膜蛋白的二級結(jié)構(gòu)。因此，丁香酚通過破壞細胞膜來抑制細菌的生長繁殖，這與Liu Ming等[28]研究海帶中分離的解聚褐藻糖膠對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌影響的結(jié)論相似。

2.8 掃描電子顯微鏡觀察結(jié)果

圖 7 經(jīng)丁香酚處理后的腐敗希瓦氏菌和熒光假單胞菌掃描電子顯微鏡圖像Fig. 7 SEM images of Shewanella putrefaciens and Pseudomonas fluorescens treated with eugenol

由圖7可以看出，未加入丁香酚的腐敗希瓦氏菌呈現(xiàn)出完整的桿狀，并且彼此間無粘黏，經(jīng)過1 MIC丁香酚處理4 h后，許多腐敗希瓦氏菌開始聚集成堆，可能是細胞膜破損，細胞內(nèi)容物泄露使它們粘連在一起，桿狀出現(xiàn)斷裂，細胞發(fā)生了明顯的變形。經(jīng)丁香酚處理前后的熒光假單胞菌之間的對比也同樣明顯，正常的熒光假單胞菌分散均勻，呈完整短桿狀，而經(jīng)丁香酚處理后的熒光假單胞菌細胞也遭到了明顯的破壞，細胞和細胞之間發(fā)生粘黏現(xiàn)象。因此，從掃描電子顯微鏡圖像中可以明顯看出丁香酚對腐敗希瓦氏菌和熒光假單胞菌細胞膜的破壞，失去了細胞膜的保護，細胞因不能正常生長而死亡[29]。

3 結(jié) 論

數(shù)據(jù)顯示丁香酚對腐敗希瓦氏菌和熒光假單胞菌的MIC均為750 mg/L。1 MIC丁香酚能明顯抑制腐敗希瓦氏菌和熒光假單胞菌生長，丁香酚破壞了細胞膜使其細胞內(nèi)的核酸、蛋白質(zhì)泄漏到細胞外，K+含量、AKP活力升高和胞內(nèi)ATP酶活力下降，可以看出細胞壁遭到破壞、細胞膜的通透性增加、細胞內(nèi)溶物發(fā)生泄露，導致細胞無法正常進行生命活動而死亡。從丁香酚處理前后的掃描電子顯微鏡圖像可看出完整光滑的菌體出現(xiàn)裂解、粘黏現(xiàn)象，結(jié)合傅里葉變換紅外光譜呈現(xiàn)的代表脂質(zhì)、蛋白質(zhì)等分子成分官能團的改變，進一步說明了丁香酚對腐敗希瓦氏菌和熒光假單胞菌的抑制機理。本實驗為海產(chǎn)品保鮮中天然安全的植物源保鮮劑的開發(fā)提供了理論依據(jù)。