張家寧，孫大鵬，李雯，周偉平

(海軍軍醫(yī)大學(xué)附屬東方肝膽外科醫(yī)院肝外三科，上海 200438)

在肝臟的原發(fā)性腫瘤中，肝內(nèi)膽管癌的發(fā)病率僅次于肝細(xì)胞肝癌，而且由于肝內(nèi)膽管癌的起病更為隱匿，進(jìn)展迅速，相比于肝細(xì)胞肝癌，其5年生存率更差[1-2]。不僅僅是我國情況如此，在一些歐美國家肝內(nèi)膽管癌的發(fā)病率也呈逐年上升的趨勢[3]。近年來很多研究報道了MicroRNA-7 (miR-7)在多種腫瘤中低表達(dá)，如肺癌、乳腺癌以及胃癌等,而且MiR-7能夠在不同的腫瘤中通過特定的機(jī)制影響癌細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲等[4-6]。但是在肝內(nèi)膽管癌中，miR-7是否也起著一定生物學(xué)作用尚未明確。基于此，本文通過體外實(shí)驗(yàn)探索了miR-7對于肝內(nèi)膽管癌細(xì)胞HCCC9810的影響，以期為以后的臨床轉(zhuǎn)化提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

材料與方法

一、材料準(zhǔn)備以及臨床樣本選擇

本研究使用的肝內(nèi)膽管癌細(xì)胞HCCC9810以及正常人肝內(nèi)膽管上皮細(xì)胞購于中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫；其他試劑和相關(guān)設(shè)備包括： RPMI1640培養(yǎng)基，OPTI-MEN培養(yǎng)基，胎牛血清 (FBS) ，lip3000 以及miRNA合成試劑盒Invitrogen(美國)； 6孔板12孔板以及96孔板(美國Corning)，CCK-8試劑盒(Dojindo)，EDU試劑盒(廣州銳博生物)，Transwell 小室(美國Corning)；miR-7 mimics以及MIR-7 陰性對照以及內(nèi)參引物均由上海生工公司提供。

所有用于實(shí)驗(yàn)檢測的28例病人的組織樣本均取自東方肝膽外科醫(yī)院，病人術(shù)后的肝內(nèi)膽管癌癌組織和癌旁組織均經(jīng)過病理證實(shí)。手術(shù)取出樣本后立即放在液氮中冷凍然后凍存于-80 ℃冰箱。病人所有樣本的采集均經(jīng)過病人的知情同意而且得到醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。

二、細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染

將細(xì)胞用RPMI1640完全培養(yǎng)基(10%胎牛血清、1%青霉素以及鏈霉素)在37 ℃、5% CO2的溫箱下進(jìn)行培養(yǎng)。膽管癌細(xì)胞HCCC9810設(shè)立miR-7 mimics+lip3000(miR-7 mimics組) 以及miR-7 NC+lip3000(miR-7 NC組)。其miR-7 mimics序列為(CTGTAGAGGCATGGCCTGTGC)；miR-7 NC序列為(UUCUCCGAACGUGUCACGUTT)。

三、實(shí)時定量PCR

使用Trizol提取細(xì)胞或組織的總RNA，然后按照Takara公司的逆轉(zhuǎn)錄試劑盒獲得cDNA，以cDNA為模板進(jìn)行實(shí)時定量PCR實(shí)驗(yàn)。其中目的基因和內(nèi)參的序列如下：miR-7上游引物(5′-CGTGCTGGAAGACTAGTGAT-3′),miR-7 下游引物 (5′-GAGCAGGGTCCGAGGT-3′);U6上游引物(5′-CGAGCACAGAATCGCTTCA-3′);U6下游引物(5′-CTCGCTTCGGCAGCACATAT-3′)。

四、CCK-8試劑盒檢測各組細(xì)胞增殖情況

取各組細(xì)胞以3 000個/100 μl接種于96孔板，細(xì)胞周圍每孔加入100 μl PBS以減少蒸發(fā)，待細(xì)胞貼壁后，分別取0、12、24、36、48、60 h六個時間點(diǎn)，每孔加入10 μl的CCK-8試劑后避光孵育2 h,而后通過酶標(biāo)儀在450 nm的波長下測其吸光值。每組設(shè)立3個復(fù)孔，且每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

五、EDU細(xì)胞增殖檢測試驗(yàn)

取對數(shù)生長期的各組細(xì)胞按照5×104個/ml的密度接種在12孔板里，按照EDU試劑說明書的方法分別進(jìn)行EDU標(biāo)記、細(xì)胞固定、Apollo染色以及DNA染色，最后通過熒光顯微鏡獲得圖像。每組設(shè)立3個復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

六、克隆形成實(shí)驗(yàn)

取對數(shù)生長期的各組細(xì)胞，常規(guī)洗滌、消化、離心，重懸細(xì)胞后，按照每孔600個細(xì)胞種植在六孔板里，加入足夠完全培養(yǎng)基，待10 d后，鏡下觀察，待克隆的大小以及數(shù)量合適后，拍照并計數(shù)。每組設(shè)立3個復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

七、劃痕實(shí)驗(yàn)

為驗(yàn)證細(xì)胞的遷移能力是否發(fā)生了變化，將陰性對照組細(xì)胞以及miR-7 mimics研究組細(xì)胞分別接種到12孔板里，待到細(xì)胞快長滿時，在細(xì)胞表面使用10 μl的小槍頭在細(xì)胞表面進(jìn)行劃痕，然后將細(xì)胞培養(yǎng)基換成無血清培養(yǎng)基后放入細(xì)胞培養(yǎng)箱，待到48 h后，使用PBS洗去脫落的細(xì)胞，在顯微鏡下拍照觀察，每個樣品設(shè)置3個復(fù)孔，獲得的劃痕數(shù)據(jù)用于后續(xù)統(tǒng)計分析。

八、Transwell實(shí)驗(yàn)

為驗(yàn)證細(xì)胞的侵襲能力是否發(fā)生了變化，分別將不同組別的細(xì)胞進(jìn)行常規(guī)消化計數(shù)，使用RPMI1640重懸細(xì)胞后，以2×105個/ml的細(xì)胞密度加入200 μl接種到鋪好matrigel膠的Transwell小室的上室，同時下室加入800 μl的RPMI1640培養(yǎng)基(含有10%胎牛血清)，待到48 h后，使用4%的多聚甲醛進(jìn)行細(xì)胞固定20 min,之后使用結(jié)晶紫進(jìn)行細(xì)胞染色，最后進(jìn)行拍照并細(xì)胞計數(shù)，每個樣品設(shè)立3個平行復(fù)孔。

九、統(tǒng)計學(xué)分析

結(jié) 果

一、病人組織以及細(xì)胞中miR-7表達(dá)水平驗(yàn)證結(jié)果

定時定量PCR對于肝內(nèi)膽管癌病人的癌組織和癌旁組織中miR-7的表達(dá)水平驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)癌組織中miR-7的表達(dá)量明顯低于癌旁組織(P<0.01)，見圖1A；HCCC9810細(xì)胞中miR-7的表達(dá)量也低于正常肝內(nèi)膽管上皮細(xì)胞HIBEC(P<0.01)，見圖1B。

二、轉(zhuǎn)染效率結(jié)果

在細(xì)胞轉(zhuǎn)染后，我們通過定時定量PCR進(jìn)行了驗(yàn)證，如圖2所示，發(fā)現(xiàn)miR-7 mimics組miR-7的表達(dá)水平明顯高于miR-7 NC組，且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

三、CCK-8增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果

CCK-8增殖實(shí)驗(yàn)如圖3所示，通過不同時間點(diǎn)對于HCCC9810細(xì)胞增殖能力的檢測，發(fā)現(xiàn)miR-7 mimics組其細(xì)胞增殖能力顯著弱于miR-7 NC組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

四、EDU實(shí)驗(yàn)結(jié)果

EDU實(shí)驗(yàn)中，我們也得到了類似CCK-8實(shí)驗(yàn)的效果。如圖4所示，HCCC9810細(xì)胞中，miR-7 mimics組相比于miR-7 NC組，其陽性細(xì)胞顯著減少(P<0.05)，提示細(xì)胞增殖能力下降。

五、克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果

克隆形成實(shí)驗(yàn)如圖5所示，在HCCC9810細(xì)胞中，mimics組其細(xì)胞克隆形成能力顯著弱于miR-7 NC組(P<0.001),mimics組肉眼下幾乎不能發(fā)現(xiàn)形成的細(xì)胞克隆。

六、劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果

進(jìn)一步對于細(xì)胞的遷移能力進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)miR-7 mimics組細(xì)胞的遷移能力要弱于miR-7 NC組(P<0.05),提示高表達(dá)miR-7后，可抑制膽管癌細(xì)胞的遷移。見圖6。

七、Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果

進(jìn)一步探索miR-7過表達(dá)后，是否對癌細(xì)胞的侵襲能力產(chǎn)生影響，結(jié)果如圖7，發(fā)現(xiàn)miR-7 mimics組穿過的細(xì)胞要明顯少于miR-7 NC組的細(xì)胞數(shù)目(P<0.01)，證實(shí)了miR-7可以抑制癌細(xì)胞的侵襲能力。

討 論

肝內(nèi)膽管癌的發(fā)病率近年來逐漸攀升，由于肝內(nèi)膽管癌早期臨床表現(xiàn)并不明顯，而且進(jìn)展迅速，很多病人確診時已經(jīng)錯過了手術(shù)時機(jī)，而對于非手術(shù)治療，無論是化療還是放療，目前的治療效果均不是很理想[7-8]。在其他腫瘤中，對于錯過手術(shù)機(jī)會的病人，靶向治療展示出了巨大的前景和療效，而對于肝內(nèi)膽管癌，目前仍缺乏一些特異性的分子靶點(diǎn)[9-10]。因此，有必要對于肝內(nèi)膽管癌細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲等過程進(jìn)行探索，這對于肝內(nèi)膽管癌的治療以及控制疾病的發(fā)展提供了相關(guān)的分子治療目標(biāo)和靶點(diǎn)。研究發(fā)現(xiàn)，MicroRNA在細(xì)胞的生長發(fā)育過程中起著重要的調(diào)控作用，而且很多癌癥的發(fā)生發(fā)展和MicroRNA的異常表達(dá)密切關(guān)聯(lián)[11-12]。miR-7作為MicroRNA家族成員之一，在多種腫瘤中發(fā)現(xiàn)其異常表達(dá)可以影響癌細(xì)胞的生長、轉(zhuǎn)移以及凋亡等。例如，在乳腺癌中，miR-7通過抑制ALDH1A3活性來抑制乳腺癌生長[13]；在直腸癌里，miR-7可以調(diào)控TRIP6以影響結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移[14]；在胰腺癌中，miR-7可通過EGFR/STAT3途徑影響癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移[15]。但是在肝內(nèi)膽管癌中，miR-7的表達(dá)水平以及是否可以發(fā)揮某些生物學(xué)功能較少報道，我們分別在組織水平以及細(xì)胞水平對于miR-7的表達(dá)水平進(jìn)行了驗(yàn)證，組織中顯示癌組織對比癌旁組織miR-7的表達(dá)水平下降，而細(xì)胞水平顯示正常肝內(nèi)膽管上皮細(xì)胞中miR-7的表達(dá)高于肝內(nèi)膽管癌細(xì)胞HCCC9810，這些結(jié)果提示miR-7表達(dá)水平的失調(diào)可能會導(dǎo)致癌癥事件的發(fā)生。我們在肝內(nèi)膽管癌細(xì)胞系HCCC9810中過表達(dá)miR-7，體外實(shí)驗(yàn)的結(jié)果暗示miR-7在肝內(nèi)膽管癌中可能扮演著抑癌基因的角色：即發(fā)現(xiàn)在肝內(nèi)膽管癌細(xì)胞系中過表達(dá)miR-7后可以抑制癌細(xì)胞的增殖，轉(zhuǎn)移以及侵襲。因此我們推測miR-7可能在肝內(nèi)膽管癌的發(fā)生、發(fā)展過程中起到一定作用。

綜上，過表達(dá)miR-7可以影響肝內(nèi)膽管癌細(xì)胞的生物學(xué)行為，因此我們推測miR-7表達(dá)水平的異常可能會影響到肝內(nèi)膽管癌的發(fā)展，從而最終影響到肝內(nèi)膽管癌病人疾病的進(jìn)展過程甚至生存預(yù)后。雖然目前缺乏一些證據(jù)證實(shí)miR-7是否可以作為臨床上肝內(nèi)膽管癌治療的靶點(diǎn)進(jìn)行干預(yù)，但是目前的結(jié)果顯示miR-7具有進(jìn)一步研究的價值，它有望成為一個潛在的分子靶點(diǎn)為以后肝內(nèi)膽管癌病人提供治療選擇，從而達(dá)到控制疾病的進(jìn)展甚至最終治愈疾病的目的。