高 元，丁 露，郭青云，譚小敏，謝青華，王子卓，戴小華

(贛南師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，江西 贛州 341000)

致倦庫(kù)蚊(Culexquinquefasciatus)屬于尖音庫(kù)蚊復(fù)合組，是我國(guó)南方常見(jiàn)優(yōu)勢(shì)蚊種，也是城鎮(zhèn)入室吸血騷擾的主要 “家蚊”[1]，它是絲蟲(chóng)病、流行性乙型腦炎、登革熱、西尼羅病毒和寨卡病毒等的重要傳播媒介[2]，嚴(yán)重危害人類(lèi)健康.殺滅蚊蟲(chóng)，切斷蚊媒疾病的傳播途徑是防治這些蚊媒疾病的有效途徑之一.

目前國(guó)內(nèi)外用于控制蚊蟲(chóng)的主要措施之一是使用化學(xué)殺蟲(chóng)劑[3]，但化學(xué)殺蟲(chóng)劑的長(zhǎng)期使用導(dǎo)致蚊蟲(chóng)抗藥性增強(qiáng)、環(huán)境污染和生態(tài)平衡破壞等問(wèn)題.因此，人們一直致力于尋找和發(fā)展對(duì)環(huán)境友好、高效安全的生物殺蚊制劑進(jìn)行媒介蚊蟲(chóng)的綜合控制.其中以生物防治為主的綜合治理方法逐漸成為蚊蟲(chóng)防治研究工作中的一個(gè)活躍領(lǐng)域[4-6].

目前蚊蟲(chóng)生物防治已受到世界各國(guó)的重視，已研究的生物防治候選物眾多，但是實(shí)際可用的卻很少，而已生產(chǎn)應(yīng)用的更少[7].殺蚊微生物資源豐富，在土壤，水體，昆蟲(chóng)中分布廣泛，目前主要來(lái)源于芽孢桿菌科、假單胞菌科、腸桿菌科、乳桿菌科和微球菌科等細(xì)菌類(lèi)群[8-13].其中芽胞桿菌在自然界的植物、土壤和蟲(chóng)體中廣泛分布，在形成芽孢的過(guò)程中細(xì)菌形成對(duì)蚊幼蟲(chóng)具有特異性毒殺作用的各種毒素蛋白，而對(duì)其他生物無(wú)毒害作用，因而被廣泛的應(yīng)用到蚊蟲(chóng)的生物防治中[10,12].其中研究比較深入的蘇云金桿菌以色列亞種(Bacillusthuringiensissubsp.israelensis)對(duì)伊蚊和庫(kù)蚊的毒力較高，按蚊次之，具有較寬的殺蚊譜且不易產(chǎn)生抗性而被廣泛用于蚊蟲(chóng)的防治，也是目前國(guó)內(nèi)外主要的蚊幼蟲(chóng)控制生物制劑[9].目前發(fā)現(xiàn)蘇云金芽胞桿菌的多種亞種或血清型具有殺蚊幼蟲(chóng)活性，如Canadensi亞種、Morrisoni亞種、Darmstadiensis亞種、Thomsonis亞種和Jegathesan亞種等[14-15].同時(shí)也發(fā)現(xiàn)多種殺蚊幼蟲(chóng)晶體蛋白如Cry2、Cry4A、Cry4B、Cry10A、 Cry11A、Cry11Bb、Cry19A、 Cry19B、Cry20Aa、Cry27A和Cyt等[16]，隨著研究的深入，新的殺蚊晶體蛋白不斷涌現(xiàn).

當(dāng)前，微生物資源收集受到世界各國(guó)的重視.本研究通過(guò)對(duì)土壤中殺蚊微生物資源收集、分離和鑒定，進(jìn)行系統(tǒng)篩選，獲得具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)和有開(kāi)發(fā)應(yīng)用前景的優(yōu)良菌株，豐富殺蚊微生物菌種資源庫(kù).該研究對(duì)控制蚊媒傳染病爆發(fā)具有重要的理論和應(yīng)用價(jià)值，在蚊蟲(chóng)的生物防治方面具有重要意義.

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基和ICPM培養(yǎng)基的配置參照文獻(xiàn)[11].

1.1.2 供試蚊蟲(chóng)

敏感致倦庫(kù)蚊品系引自中國(guó)科學(xué)院武漢病毒研究所袁志明教授課題組，未接觸過(guò)任何生物殺蟲(chóng)劑，在實(shí)驗(yàn)室已穩(wěn)定飼養(yǎng)10年以上；該蚊蟲(chóng)品系飼養(yǎng)在26-28 ℃和12∶12 h黑暗和光照(light-dark)交替條件下.

1.2 土樣采集

選擇植被豐富、腐殖質(zhì)豐富的土壤，清理土壤表層，采集深度3 cm以下的土樣約10 g，裝入塑封袋，采集點(diǎn)之間間隔20 m左右，對(duì)土樣分別進(jìn)行編號(hào).

1.3 菌株分離

采用醋酸鈉-抗生素法.取錐形瓶，裝10 mL LB液體培養(yǎng)基，加入100 mg/mL的氨芐青霉素10 μL和2 mol/L醋酸鈉(NaAc)712.5 μL，放入0.5 g土樣；30 ℃，220 rpm/min的搖床培養(yǎng)4 h，取1 mL懸浮液于EP管，80 ℃下水浴8 min，水浴之后立即冰浴10 min，解凍渦旋1 min，10,000 rpm/min離心5 min，棄上清，用1 mL無(wú)菌水重懸，10,000 rpm/min離心5 min，棄上清，取200 μL無(wú)菌水重懸沉淀，并將懸液涂布于ICPM固體培養(yǎng)基上，30 ℃培養(yǎng)3-4 d.

1.4 生物測(cè)定

挑取疑似芽胞桿菌的菌落接入5 mL ICPM液體培養(yǎng)基中，編號(hào)后置于30 ℃，220 rpm/min搖床發(fā)酵培養(yǎng)72 h.用一次性塑料杯裝入100 mL去氯水，轉(zhuǎn)入上述菌株發(fā)酵液1 mL，加入20只3～4齡健康的致倦庫(kù)蚊幼蟲(chóng)，滴加適量飼料，用清水作對(duì)照.48 h之后查看生測(cè)結(jié)果，記錄每個(gè)菌株對(duì)應(yīng)的蚊幼蟲(chóng)死亡率.將死亡率在50%以上的記為有毒菌株，死亡率在100%的菌株定為高毒株.對(duì)高毒株進(jìn)一步進(jìn)行生物測(cè)定，每次生測(cè)設(shè) 5-6個(gè)濃度，一組空白對(duì)照，每個(gè)濃度設(shè)2個(gè)重復(fù).在26±2 ℃室溫下處理48 h，檢查幼蟲(chóng)死亡率.用SPSS 13.0軟件分別計(jì)算蚊幼蟲(chóng)對(duì)分離菌株發(fā)酵液的LC50及LC90[17].

1.5 光學(xué)顯微鏡觀察

選取高毒菌株，接種于ICPM平板上培養(yǎng)3-7 d至芽孢晶體釋放，在載玻片上滴上無(wú)菌水，挑取少許菌在載玻片上涂布，用酒精燈微火固定后滴加染色液(0.133%的考馬斯亮藍(lán)，50%的乙酸)，染色2 min，用水清洗至無(wú)色，并在Olympus CX23 光學(xué)顯微鏡下觀察菌體和晶體形態(tài).

1.6 利用16S rDNA對(duì)菌株分類(lèi)鑒定

用TIANamp Bacteria DNA Kit (DP302-02)細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取分離得到的高毒力菌株基因組的總DNA，利用16S rDNA通用引物27F(5' AGAGTTTGATCMTGGCTC AG 3') 和1492R (5' TACGGYTACCTTGTTACGACTT 3')及高保真DNA聚合酶PrimeSTAR HS DNA Polymerase對(duì)分離菌株的16S rDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增程序如下：95.0 ℃，3 min；94.0 ℃，1 min，51.0 ℃，1 min，72.0 ℃，1 min 30 s，35個(gè)循環(huán)；72.0 ℃，10 min.擴(kuò)增結(jié)束后用1.0%瓊脂糖凝膠進(jìn)行檢測(cè)，切取目標(biāo)DNA條帶，用Omega D2500-02 Gel Extraction Kit瓊脂糖凝膠回收試劑盒純化后測(cè)序.所獲序列經(jīng)序列在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行BLAST同源性對(duì)比，利用MEGA 7.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，根據(jù)親緣關(guān)系對(duì)分離菌株進(jìn)行鑒定.

1.7 殺蚊菌株蛋白的SDS-PAGE分析

將獲得的高毒力菌株在ICPM的液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)72 h，使菌株的芽孢和晶體釋放，取1 mL菌液于EP管中，10,000 rpm/min離心1 min，收集菌體.用無(wú)菌去離子水洗滌菌體，加入200 μL的無(wú)菌水重懸菌體，加入5x加樣緩沖液，充分混勻后在沸水中煮10 min，12,000 rpm/min離心10 min，取上清10 μL點(diǎn)樣.在Bio-Rad電泳儀上進(jìn)行恒流電泳，分離膠的濃度為10%，濃縮膠的濃度為5%，以20 mA的電流至樣品進(jìn)入分離膠后，電流增大為25 mA繼續(xù)電泳.電泳結(jié)束后，取出凝膠置于考馬斯亮藍(lán)R250染色液中染色2.5 h，用脫色液脫色1 h，觀察結(jié)果.

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 殺致倦庫(kù)蚊幼蟲(chóng)芽胞桿菌的分離

在陡水湖、五指峰、贛南師范大學(xué)校園、崇義陽(yáng)明山和井岡山共采集103份土樣，分離獲得芽孢桿菌菌株159株，初步鑒定疑似蘇云金芽孢桿菌菌株68株，出菌率(蘇云金芽孢桿菌占芽孢桿菌總數(shù)的比率)為42.77%；其中有毒菌株52株，有毒率(有毒菌株占芽孢桿菌總數(shù)的比率)為32.70%，具體數(shù)據(jù)詳見(jiàn)表 1.其中高毒力菌株有6株，陡水湖分離出2株，標(biāo)號(hào)為D7-1、D4-2；贛南師范大學(xué)校園土樣分離出2株，標(biāo)號(hào)為X11-2、C3-2；陽(yáng)明山分離出1株，標(biāo)號(hào)為Yang20-1；井岡山分離出1株，標(biāo)號(hào)為1-2.

表1 不同采樣點(diǎn)所分離的芽孢桿菌出菌率和有毒株出菌率

2.2 分離芽孢桿菌對(duì)致倦庫(kù)蚊幼蟲(chóng)的毒力

將分離得到的6株高毒力菌株接種于ICPM液體培養(yǎng)基中，在搖床中震蕩培養(yǎng)3 d，待芽孢和晶體完全釋放，取發(fā)酵液對(duì)致倦庫(kù)蚊4齡幼蟲(chóng)進(jìn)行生物測(cè)定，以商品化的殺蚊菌株球形芽胞桿菌C3-41作為陽(yáng)性對(duì)照株.結(jié)果見(jiàn)表2.6株分離菌株對(duì)致倦庫(kù)蚊幼蟲(chóng)50%的致死率LC50值在0.69～1.18 μL/mL之間，符合高毒力菌株的特征，都可以作為潛在的殺蚊微生物資源.其中X11-2、 C3-2毒力最高，分別為0.69和0.74 μL/mL，和商品化的殺蚊菌株B.sphaericusC3-41的毒力相當(dāng)，可以作為潛在的新型殺蚊制劑；Yang20-1、7-1毒力次之，4-2、1-2毒力稍弱.

表2 分離高毒菌株發(fā)酵液對(duì)致倦庫(kù)蚊幼蟲(chóng)48 h的毒力

2.3 菌株形態(tài)觀察

用肉眼觀察生長(zhǎng)在ICPM固體培養(yǎng)基上的6株高毒力菌株，發(fā)現(xiàn)其菌落為乳白色，煎蛋狀，菌落邊緣粗糙，呈現(xiàn)典型的芽孢桿菌菌落形態(tài).挑取菌落經(jīng)考馬斯亮藍(lán)染色后在油鏡下觀察所產(chǎn)生的伴胞晶體形態(tài)，菌株X11-2的晶體形狀以長(zhǎng)方形為主，少量為正方形(圖1 A)；菌株C3-2的晶體形狀為長(zhǎng)方形(圖1 B)；菌株Yang20-1的晶體形狀主要為不規(guī)則形，部分圓形(圖1 C)；菌株7-1的晶體形狀為以圓形為主，少量為長(zhǎng)方形(圖1 D)；菌株4-2的晶體形狀為方形(圖1 E)；菌株1-2的晶體形狀也為方形(圖1 F).

圖1 分離殺蚊幼芽孢桿菌在光學(xué)顯微鏡下的芽孢以及伴孢晶體形態(tài)A:X11-2; B:C3-2； C: Yang20-1； D:7-1; E:4-2; F:1-2(箭頭所指為菌株的伴胞晶體形態(tài))

2.4 分離的對(duì)致倦庫(kù)蚊幼蟲(chóng)高毒力菌株的分子鑒定

提取分離的6株高毒力菌株的基因組，利用16S rDNA通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，均產(chǎn)生1.5 Kb左右的目的條帶，與預(yù)期結(jié)果一致.測(cè)序后的序列用BLAST程序在GenBank(www.ncbi.nlm.nih.gov)數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行相似性搜索，從中獲取相近的典型菌株的16S rDNA序列，利用Mega7.0軟件將獲得的序列與相關(guān)菌株的相應(yīng)序列進(jìn)行同源性分析，并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)[18](圖2).結(jié)果顯示，6株菌與蘇云金芽胞桿菌親緣關(guān)系最近，序列一致性在98%以上.其中菌株7-1和蘇云金芽孢桿菌以色列亞種B.thuringinesisserovarisraelensis(MK002737)聚為一支，同源性達(dá)100%；綜合所分離各細(xì)菌的形態(tài)特征，培養(yǎng)特征以及16S rDNA序列分析，將所獲得的菌株歸為蘇云金芽孢桿菌B.thuringinesis.

圖2 分離殺蚊芽胞桿菌基于16S rDNA序列的系統(tǒng)親緣關(guān)系分析

圖3 高毒力菌株SDS-PAGE檢測(cè)結(jié)果M: 蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn);1:X11-2;2:C3-2;3:Yang20-1;4:7-1;5:4-2;6:1-2(箭頭所指為菌株的晶體蛋白主帶)

2.5 殺蚊菌株晶體蛋白的SDS-PAGE

將分離到的6株高毒力菌株X11-2、C3-2、Yang20-1、7-1、1-2和4-2進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)6株菌株均發(fā)現(xiàn)了明顯的晶體蛋白條帶(圖3).菌株X11-2在29 kDa左右有明顯的晶體蛋白主帶；菌株C3-2在32 kDa和95 kDa左右有明顯的晶體蛋白主帶；Yang20-1的晶體蛋白在60 kDa左右有晶體蛋白主帶；菌株7-1在29 kDa左右有明顯的晶體蛋白主帶；而4-2和1-2的晶體蛋白主帶小于20 kDa.這些結(jié)果說(shuō)明分離所得高毒力殺蚊菌株的殺蚊幼蟲(chóng)活性主要來(lái)自菌株芽孢期產(chǎn)生的晶體蛋白.

3 討論

芽孢桿菌作為優(yōu)良的生物防治藥劑，科學(xué)界對(duì)它的研究越來(lái)越深入，本研究從陡水湖、五指峰、崇義、學(xué)校附近、井岡山5個(gè)地點(diǎn)采集103份土壤樣本，共分離得159株芽孢桿菌，其中蘇云金芽孢桿菌有68株，出菌率為42.77%，有毒菌株52株，有毒菌株出菌率32.70%.從出菌率和生物測(cè)定的數(shù)據(jù)來(lái)看，發(fā)現(xiàn)陡水湖不僅出菌率高，而且高毒力菌株占比也高，推測(cè)這可能跟陡水湖生態(tài)環(huán)境更為原始，人為干擾程度相對(duì)較低有關(guān)，另外陡水湖地區(qū)水面較多，利于蚊蟲(chóng)孳生、菌株和生態(tài)環(huán)境的協(xié)同進(jìn)化，更有利于篩選得到高毒力菌株.

通過(guò)重復(fù)生物測(cè)定方法，從分離篩選得到的52株有毒菌株中，最終篩選出6株高毒力菌株.通過(guò)與已商品化的滅蚊菌株球形芽孢桿菌C3-41對(duì)比發(fā)現(xiàn)，X11-2，C3-2的毒力與商品化的滅蚊菌株相當(dāng)，具有一定的發(fā)展為新型殺蚊幼劑的潛能，有望通過(guò)進(jìn)一步研究推廣應(yīng)用.對(duì)分離得到的6株高毒力菌株進(jìn)行形態(tài)觀察，發(fā)現(xiàn)其在平板上呈現(xiàn)典型的蘇云金芽孢桿菌的菌落特征，在進(jìn)一步晶體形態(tài)觀察中，7-1菌株的晶體以圓形和近球形晶體突出，其他5株的晶體都以方形晶體為主.通過(guò)聚丙烯酰胺凝膠電泳對(duì)高毒力菌株進(jìn)行蛋白分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在我們所分離的6株高毒力菌株中，菌株X11-2、C3-2和7-1在29 kDa左右有明顯的蛋白主帶，推測(cè)這些菌株可能含有殺蚊毒素Cyt蛋白；C3-2除含Cyt蛋白外，在95 kDa左右還有一條明顯的蛋白主帶，推測(cè)為Cry類(lèi)蛋白.而菌株4-2和1-2的晶體蛋白主帶小于20 kDa，推測(cè)可能是一種新的殺蚊毒素蛋白.可見(jiàn)，所分離高毒力菌株的殺蚊活性主要源于晶體蛋白，其蛋白歸類(lèi)還有待于后續(xù)的質(zhì)譜分析和深入研究，以期為開(kāi)發(fā)利用殺蚊幼蟲(chóng)微生物奠定基礎(chǔ)，對(duì)豐富我國(guó)殺蚊菌種資源和發(fā)展我國(guó)生物殺蟲(chóng)劑的研究和應(yīng)用具有實(shí)際意義.