顏峰平，葉 星，陳圓圓

(贛南醫(yī)學(xué)院法醫(yī)學(xué)系，江西 贛州 341000)

法醫(yī)學(xué)損傷時間是指人體組織、器官損傷后至檢驗時所經(jīng)歷的時間間隔，損傷時間推斷是法醫(yī)病理學(xué)研究和實(shí)踐的重點(diǎn)與難點(diǎn)內(nèi)容?？陀^、準(zhǔn)確的損傷時間推斷能為劃分嫌疑人范圍、推測嫌疑人的作案意圖、現(xiàn)場重建等提供重要依據(jù)，具有重要的法醫(yī)學(xué)意義[1]?，F(xiàn)有研究認(rèn)為通過檢測損傷修復(fù)過程中各種生物學(xué)指標(biāo)的變化趨勢，并結(jié)合損傷的形態(tài)學(xué)變化，可以為損傷時間推斷提供良好依據(jù)[2]。

細(xì)胞自噬參與皮膚損傷的修復(fù)過程已被研究證實(shí)。本研究通過建立大鼠皮膚挫傷模型，研究不同損傷時間段后自噬相關(guān)分子Beclin1、LC3的mRNA及蛋白表達(dá)情況，并探討B(tài)eclin1、LC3在法醫(yī)學(xué)損傷時間推斷中的價值。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗動物健康成年雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠42只，體重180～200 g，購自上海杰思捷實(shí)驗動物有限公司。

1.1.2主要試劑及儀器5%水合氯醛(Sigma)，TRIzol試劑(Invitrogen)，RIPA裂解液(碧云天生物技術(shù)公司)，LC3抗體(CST)，Beclin1抗體(CST)，β-actin抗體(CST)，HRP標(biāo)記的二抗(CST)，SYBR Green PCR試劑盒(Qiagen)，PCR引物(上海生工生物工程股份有限公司)，熒光定量PCR儀(Applied Biosystems)，蛋白免疫印跡化學(xué)發(fā)光儀(天能)，核酸電泳儀(天能)等。

1.2實(shí)驗方法

1.2.1動物分組和模型建立SD大鼠隨機(jī)分為正常對照組，皮膚挫傷后3 h、6 h、12 h、24 h、72 h組及死后皮膚挫傷組，每組6只，參考劉寧國等報道的方法構(gòu)建大鼠皮膚挫傷模型[3]。在特定損傷時間后將大鼠頸椎脫臼處死，快速提取挫傷區(qū)皮膚組織置于-80℃冰箱凍存?zhèn)溆?。正常對照組皮膚不作挫傷處理，取與挫傷組相同部位皮膚組織。

1.2.2總RNA提取和實(shí)時熒光定量PCR檢測(RT-qPCR)挫傷組、對照組皮膚組織按TRIzol一步法提取總RNA，用紫外分光光度法檢測所提取RNA的濃度和純度，同時采用瓊脂糖凝膠電泳判斷提取的RNA質(zhì)量。RNA在波長為260 nm和280 nm處的吸光度比值要求在1.8～2.2范圍內(nèi)，方可進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗。

按照SYBR Green PCR試劑盒說明書配置RT-qPCR體系，然后在7500型熒光定量PCR儀上進(jìn)行檢測。熒光定量PCR引物序列見表1，GAPDH作為內(nèi)參基因，采用2-△△Ct計算基因相對表達(dá)量。

表1 熒光定量PCR引物序列

1.2.3蛋白質(zhì)免疫印跡反應(yīng)(Westernblot)各組取適量皮膚組織加入裂解液勻漿，離心取上清液，按1∶1加入2X的SDS上樣緩沖液中，放入100 ℃的沸水中加熱10 min使蛋白變性，SDS-PAGE電泳分離蛋白質(zhì)，電泳結(jié)束后，在轉(zhuǎn)膜緩沖液中進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，取出PVDF膜置于5%的牛奶中封閉1 h，封閉結(jié)束后，用TBST洗膜3次，5 min/次，在膜上敷上相應(yīng)的一抗，4 ℃過夜。次日，TBST洗膜3次，5 min/次，加入相應(yīng)的二抗，室溫孵育1 h。最后配置ECL顯色液(A∶B=1∶1)，在化學(xué)發(fā)光儀上對孵有相應(yīng)抗體的條帶顯色。

2 結(jié) 果

2.1挫傷后各組皮膚組織中Beclin1、LC3的mRNA表達(dá)變化RT-qPCR檢測發(fā)現(xiàn)Beclin1 和LC3的mRNA含量在挫傷后均呈現(xiàn)先下降后恢復(fù)至正常水平的趨勢。Beclin1、LC3分別在挫傷6 h、12 h下降最為顯著，在24 h、72 h均恢復(fù)至正常水平，死后損傷組與對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(圖1、表2)。

圖1 挫傷皮膚組織中Beclin1和LC3 mRNA水平檢測

表2 熒光定量PCR檢測各組皮膚組織中LC3和Beclin1 mRNA相對表達(dá)量

注：a為與對照組相比。

2.2挫傷后各組皮膚組織中Beclin1、LC3的蛋白表達(dá)情況與對照組比較，挫傷后24 h內(nèi)Beclin1、LC3蛋白表達(dá)下降，其中12 h組下降最為顯著；72 h組升高至正常水平；死后挫傷組皮膚組織中Beclin1、LC3蛋白表達(dá)無明顯改變(圖2)。

圖2 挫傷皮膚組織中Beclin1和LC3蛋白水平檢測

3 討 論

損傷時間推斷是法醫(yī)病理學(xué)領(lǐng)域一直未解決的問題之一。研究人員通過酶組織化學(xué)、免疫組織化學(xué)、分子生物學(xué)等方法檢測機(jī)體損傷后各種炎癥因子、化學(xué)因子、生活活性酶、生長因子等的表達(dá)并結(jié)合損傷的形態(tài)學(xué)變化，篩選呈規(guī)律性表達(dá)的標(biāo)記物，可以為損傷時間推斷提供良好依據(jù)[4]。但在法醫(yī)學(xué)鑒定實(shí)踐中，人體皮膚損傷的位置、范圍多變且損傷程度不一，損傷后會受體內(nèi)外多種因素的影響，很難尋找到有確切時間變化規(guī)律、并能應(yīng)用于法醫(yī)鑒定的某種或某類生物學(xué)標(biāo)記物。因此尋找與損傷時間具有相關(guān)性的標(biāo)記物仍是法醫(yī)學(xué)研究的重點(diǎn)。

細(xì)胞自噬是真核生物普遍存在的自穩(wěn)機(jī)制，細(xì)胞通過啟動自噬清除胞內(nèi)受損的蛋白質(zhì)、細(xì)胞器或入侵的病原體等，利用溶酶體途徑降解、回收利用降解產(chǎn)物以維持細(xì)胞穩(wěn)定。細(xì)胞自噬與皮膚損傷愈合過程關(guān)系密切。目前有關(guān)自噬與皮膚損傷的報道尚少[5]。賴紅梅等在小鼠切創(chuàng)的動物模型中發(fā)現(xiàn)Beclin1、LC3轉(zhuǎn)錄水平與蛋白表達(dá)水平具有相似規(guī)律：小鼠皮膚損傷后1 h升高不顯著，6 h升高較顯著，24 h到達(dá)高峰，48 h至72 h有所下降，切創(chuàng)皮膚組織中Beclin1、LC3的整體水平高于正常皮膚組織[6]。Asai等通過免疫熒光計數(shù)LC3陽性自噬點(diǎn)方法觀察皮膚創(chuàng)面愈合過程中自噬發(fā)生的情況，發(fā)現(xiàn)傷后7～9天成纖維細(xì)胞存在高水平的自噬[7]。但Kimura等研究小鼠皮膚損傷后較短時間內(nèi)(24 h內(nèi))自噬蛋白LC3和p62的表達(dá)情況，結(jié)果顯示損傷0.5 h后LC3表達(dá)下降，p62相對量增加，說明皮膚損傷抑制了局部的細(xì)胞自噬[8]。皮膚損傷后細(xì)胞自噬的情況，上述各類實(shí)驗結(jié)果表現(xiàn)出了差異，仍有待進(jìn)一步研究。

本研究通過建立大鼠皮膚挫傷模型，采用RT-qPCR和Western blot方法從轉(zhuǎn)錄水平、蛋白水平研究自噬相關(guān)分子Beclin1、LC3的表達(dá)變化。結(jié)果顯示Beclin1、LC3 的mRNA和蛋白表達(dá)呈現(xiàn)相似的變化規(guī)律，隨挫傷時間延長呈先降低后升高并接近對照組水平的趨勢，其中Beclin1、LC3的mRNA水平分別在挫傷6 h、12 h組下降顯著，24 h、72 h組均升至正常水平；Beclin1、LC3蛋白含量挫傷后24 h內(nèi)表達(dá)下降，在12 h降低顯著，72 h恢復(fù)至正常水平；死后挫傷皮膚組織自噬相關(guān)分子表達(dá)無顯著變化。說明皮膚損傷后較短時間內(nèi)細(xì)胞自噬被抑制，與前述Kimura的實(shí)驗結(jié)果一致，而隨著傷后時間的延長，細(xì)胞自噬水平升高。我們認(rèn)為細(xì)胞自噬參與了皮膚損傷后修復(fù)、愈合的過程，在損傷后的不同階段發(fā)揮了不同作用。同時，Beclin1、LC3的表達(dá)與皮膚損傷時間具有一定的相關(guān)性，可以為皮膚損傷時間推斷提供參考依據(jù)。但本研究僅采用動物模型進(jìn)行觀察，缺乏人體樣本驗證，實(shí)際檢案中皮膚的損傷不同于實(shí)驗動物模型， Beclin1、LC3作為損傷時間推斷標(biāo)記物在實(shí)踐中的有效性仍有待驗證。